高压水解：一种用于复杂生物基质中氨基酸分析的快速样品制备方法

《Journal of Chromatography A》：High-Pressure Hydrolysis: A Rapid Sample Preparation Strategy for Amino Acid Analysis of Complex Biological Matrices

　　

李书聪|孟柳霜|秦竹|张晓英|顾一平

中国广西桂林市桂林医学院公共卫生学院，广西环境暴露组学与全生命周期健康重点实验室，541199

摘要

延长酸水解步骤（通常为20-24小时）是氨基酸分析中的一个普遍瓶颈，尤其是在处理复杂、富含蛋白质的生物样本时。为了解决这个问题，我们开发并严格验证了一种新型的高压水解策略。在一种具有挑战性的模型基质（蚯蚓，一种复杂的动物来源材料）中，仅用2小时（120°C，饱和蒸汽压力0.12 MPa，约1.2 atm）就实现了蛋白质的完全水解——比传统方法节省了90%以上的时间。关键的是，与24小时的金标准方法直接比较后，通过两次单侧t检验（TOST）确认了分析等效性，16种氨基酸中有15种的等效性在±5%的范围内。结合使用稳健的苯基异硫氰酸酯（PITC）预柱衍生化HPLC-UV协议，该方法表现出优异的性能：特异性、线性（R² > 0.99）、精确度（RSD < 2.5%）和准确性（回收率：95.1–104.9%）。其实际效用通过快速生成一致的色谱指纹图谱以及揭示13批样品中关键氨基酸（例如脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的统计显著、来源相关的变异得到了证明。这项工作在样品制备方面取得了重大进展，提供了一种快速、可靠且广泛应用的方法，可以显著提高复杂生物材料氨基酸分析的通量。

引言

氨基酸分析是表征多种领域蛋白质材料的关键技术。该分析的准确性从根本上取决于通过酸水解完全且可重复地释放氨基酸。然而，传统的协议需要在110°C下进行20-24小时的处理，这严重限制了分析通量[1,2]。

已经开发出了一些加速这一过程的策略，如微波辅助酸水解（MAAH）[[3], [4], [5]]和超声辅助水解（包括酶法[6]和酸法[7]），这些方法将处理时间从几小时缩短到了几分钟。然而，使用这些加速方法实现完全且可重复的水解通常需要仔细优化多个反应参数（如温度、时间和能量输入），从而增加了方法开发的复杂性[[3], [4], [5], [6],8]。

虽然提高压力以影响反应动力学在更广泛的背景下是已知的，但将其专门应用于解决常规氨基酸水解中的特定瓶颈却尚未得到充分探索。基础研究表明，高压和高温可以显著改变肽键水解和氨基酸分解的动力学，反应速率和路径强烈依赖于具体条件[[9], [10], [11]]。需要注意的是，这些研究中使用的压力（20-200 MPa）属于超高压范围，与本研究中使用的常规高压釜工作压力（0.12 MPa表压）有根本不同。具体来说，虽然超高压条件已被用于研究降解动力学或增强酶促蛋白水解，但我们的方法是在温和的饱和蒸汽压力下进行的，这种条件与常规实验室设备兼容，并且旨在定量、完全释放完整的氨基酸。此外，其是否适用于使用标准、易获得的实验室设备分析复杂的天然生物基质尚未得到验证。

此外，当应用于高度复杂和异质的基质时——例如含有复杂蛋白质、肽和多糖网络的传统药物——这些加速方法的性能可能高度依赖于样品组成[12]。这通常需要额外的基质特异性优化，以确保完全消化并防止分析物降解[6,12]。因此，仍然迫切需要一种稳健、高效且广泛兼容的水解方法，该方法可以无缝集成到标准分析工作流程中，同时保证对各种复杂样品类型的可靠性[2,12,13]，从而提高现代氨基酸分析的通量和可靠性[13,14]。

在这里，我们通过使用标准实验室高压釜开发了一种新型的高压水解策略，利用可控的高温和高压显著加速了反应动力学。这项工作重点在于该策略的系统开发、优化，以及最关键的严格验证，其主要目标是证明其与传统24小时协议的定量等效性。为了评估该方法在苛刻条件下的稳健性和通用性，选择了蚯蚓作为复杂的生物基质模型，因为它含有复杂的蛋白质、多糖和脂质组成。通过稳健的苯基异硫氰酸酯（PITC）预柱衍生化HPLC-UV平台[15,16]对水解产物进行了分析。最后，将该方法应用于多个这种复杂基质的批次，以证明其实际效用及其生成高质量、化学信息丰富的数据的能力，这些数据适用于后续的鉴定或质量筛选等研究。

章节摘录

化学品和试剂

L-天冬氨酸（Asp）、L-谷氨酸（Glu）、L-丝氨酸（Ser）、L-缬氨酸（Val）、L-精氨酸（Arg）、L-甘氨酸（Gly）、L-脯氨酸（Pro）、L-丙氨酸（Ala）、L-组氨酸（His）、L-苯丙氨酸（Phe）、L-赖氨酸（Lys）、L-甲硫氨酸（Met）、L-异亮氨酸（Ile）、L-亮氨酸（Leu）、L-羟脯氨酸（Hyp）、L-酪氨酸（Tyr）参考标准品以及内标（IS）牛磺酸参考标准品均购自国家食品药品监督管理局（北京，中国）。明胶（250克）和玉米醇溶蛋白（来自

选择PITC衍生化和方法开发目标的理由

对于氨基酸的预柱衍生化，有多种试剂可供选择，包括PITC和9-氟苯甲酰氯（FMOC-Cl）。FMOC-Cl确实是一种强大的试剂，特别是在质谱分析中非常有价值，因为它能够形成高荧光和可电离的衍生物，如在复杂食品基质中灵敏检测氨基磷酸酯除草剂时所证明的[17]。然而，对于常规质量控制（QC）的具体目的

结论

本研究为复杂生物样本的氨基酸分析提供了一种重要的方法学进展。核心创新是一种新型的高压水解策略，将样品制备时间从超过20小时缩短到了仅2小时。至关重要的是，通过两次单侧t检验（TOST）和Bland-Altman分析，严格证明了这种加速过程与24小时金标准方法的分析等效性，确认了15种氨基酸的等效性

CRediT作者贡献声明

李书聪：正式分析、数据管理。孟柳霜：可视化、研究、正式分析。秦竹：数据管理。张晓英：撰写——审稿与编辑、监督。顾一平：撰写——初稿、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。