一种利用纳米液相色谱法和核磁共振光谱法持续识别植物成分的方法：洋蓟叶样本

《Journal of Chromatography Open》：A sustainable approach to the identification of plant matrices by nano-liquid chromatography and nuclear magnetic resonance spectroscopy: Artichoke leaves sample

　　A.P. Sobolev | C. Dal Bosco | G. D’Orazio
生物系统研究所（ISB），意大利国家研究委员会（CNR），蒙特罗通多（罗马）

**摘要**
植物基物质的植物化学特性分析是现代分析化学的关键方面，这一领域的发展受到人们对植物营养保健品日益增长的兴趣的推动。然而，传统的亲脂性提取方法通常依赖于氯仿等有毒溶剂，这与绿色分析化学（GAC）的原则相悖。本研究提出了一种可持续的分析流程，用于鉴定洋蓟（Cynara cardunculus var. scolymus）叶片中的疏水性初级和次级代谢物。本文比较了传统的氯仿提取方法与环保替代方法（包括茴香醚、乙酸乙酯和异戊基乙酯），并评估了一种疏水性天然共晶溶剂（NaDES）的提取效率。提取物通过微型技术（如纳米液相色谱法（nano-LC）和核磁共振（NMR）光谱进行分析，以鉴定和半定量脂肪酸、脂类、甾醇以及特别是倍半萜内酯（STLs），例如cynaropicrin。结果表明，基于生物的溶剂，尤其是异戊基乙酯和茴香醚，为提取亲脂性化合物提供了实用且可持续的替代方案，使整个过程符合GAC原则。利用Hansen溶解度参数（HSP）、LogP和表面张力的理论评估证实，这些绿色替代品可以有效替代氯仿。具体而言，热力学亲和力与传质动力学之间的平衡确保了STLs的高回收率，证明了在完全可持续的工作流程中既能保持高质量的提取结果，也能实现定量回收。最后，应用AgreePrep指标比较了使用氯仿和最有前景的替代溶剂进行样品制备的可持续性。

**1. 引言**
植物是生物活性化合物的丰富来源，包括黄酮类、萜类和生物碱，这些化合物具有显著的抗氧化、抗炎和抗菌特性[1,2]。提取这些植物化学物质是一个关键步骤，其中溶剂和方法的选择对于最大化产量和保持化合物完整性至关重要[3,4]。传统上，固液萃取（SLE）和液液萃取（LLE）采用的方法包括浸渍、渗透和索氏萃取。然而，这些传统方法往往需要大量有毒溶剂，消耗大量能源，并产生大量废物[5,6]。为应对这些环境问题，绿色化学（GAC）的原则已被纳入分析工作流程中[8]。GAC强调可持续的实验室实践，如微型化、减少溶剂使用以及更安全、低能耗的方法。通过应用GAC原则，特别是在样品制备过程中，从提取到表征的整个过程变得更加环保和高效[9]。受GAC原则的推动，开发出了诸如超声辅助萃取（UAE）[10]、微波辅助萃取（MAE）[11]、加压液相萃取（PLE）[12]和超临界流体萃取（SFE）[13]等创新技术。这些方法通过增强对植物基质的破坏作用，显著减少了溶剂的使用量和萃取时间。然而，选择合适的溶剂系统可以进一步提高环境可持续性。向更环保的萃取方法转变促使人们开发出克服传统有机溶剂局限性的溶剂系统。这些环保选项设计为环境安全、可生物降解且无毒[7,14]。其中，天然共晶溶剂（NADES）因其低蒸气压和热稳定性而受到关注[15]，基于生物的溶剂（如醇类、酯类和萜类）也是如此[16,17]。近期研究表明，用生物基溶剂成功替代了传统溶剂；例如，甲基四氢呋喃在类固醇提取方面的表现与正己烷相当[18]，而2-甲基四氢呋喃与醇类的混合物则替代了Bligh和Dyer或Folch方法用于脂质回收[19,20]。同样，乙酸乙酯也被有效用于从石榴等复杂基质中提取多酚[21]。

洋蓟（Cynara cardunculus var. scolymus）因其富含生物活性化合物（包括酚酸、黄酮类和倍半萜内酯如cynaropicrin）而备受关注[22,23,24,25]。虽然极性溶剂主要提取酚类化合物，但非极性溶剂对于回收对植物健康有益的疏水性STLs至关重要[22,26,27]。历史上，从洋蓟中提取亲脂性成分一直涉及使用有害溶剂。文献报道了使用己烷、二乙醚和二氯甲烷的顺序萃取[22]，或使用氯仿的传统Bligh和Dyer方法[28]。最近的研究探索了使用乙酸乙酯通过UHPLC-QTOF-MS同时定量多种STLs[29]，以及使用乙醇和丙酮进行浸渍或索氏萃取[30]。这些研究表明，这类提取物主要由cynaropicrin和其他次要化合物组成，强调了高效且可持续地回收这些代谢物的必要性。

**2. 实验**
**2.1. 化学品和材料**
本研究中使用的所有化学品均为分析试剂级，按原样使用。以下溶剂和溶液购自Carlo Erba（意大利米兰罗达诺）：2-丙醇（2-PrOH）、氯仿、乙酸乙酯、甲酸（99% w/w）和氨溶液（30% w/w）。乙腈（HPLC级）、甲醇（MeOH）和HPLC级超纯水（通过0.2 μm过滤器过滤并在氮气下包装）购自VWR（意大利米兰International PBI S.r.l.）。分析标准品（包括甲苯（CAS No.: 108-88-3）、乙苯（CAS No.: 100-41-4）、丙苯（CAS No.: 103-65-1）、丁苯（CAS No.: 104-51-8）、薄荷醇（CAS No.: 89-78-1）和百里酚（CAS No.: 89-83-8），以及丁香酸、纳多洛尔、K2HPO3和KH2PO3购自Sigma-Aldrich（意大利米兰Merk Life Science S.r.l.）。提取溶剂（包括茴香醚（CAS No.: 100-66-3）和异戊基乙酯（CAS No.: 123-92-2）也购自Sigma-Aldrich。氘代溶剂（D2O、CD3OD、CDCl3）和3-(三甲基硅基)-丙酸-2,2,3,3-d4酸钠盐（TSP）购自Eurisotop（法国圣奥宾）。

流动相由水或乙腈组成，每种溶剂均含有0.1%（v/v）的甲酸。在使用前，所有标准溶液和植物基质均储存在-18°C。洋蓟植物提取物在使用或分析前储存在4°C的黑暗环境中。

用于纳米液相色谱系统的毛细管柱由聚酰亚胺涂层熔融石英制成，外径（OD）为375 μm，内径（ID）为100 μm或50 μm。填充色谱柱的固定相为Varian公司（美国加利福尼亚州圣克拉拉）生产的Chromspher C18块状材料（3.0 μm，120 ?）。毛细管柱的填充长度为25.0 cm，有效长度和质谱长度分别为26.5 cm和35.0 cm。

**2.2. 仪器**
使用Bransonic 3510E超声浴（美国康涅狄格州丹伯里）对流动相进行脱气、溶解分析物，并在填充毛细管柱时均质化固定相浆液。使用Bausch & Lomb Stereozoom 4光学显微镜（美国纽约罗切斯特）观察和评估填充过程。使用PerkinElmer Series 10 HPLC泵（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托）进行柱填充和与流动相的平衡。使用Labconco FreeZone 1系统（美国密苏里州堪萨斯城）冷冻整个洋蓟植物样品。

**2.2.1. 毛细管柱填充程序**
毛细管柱的填充采用Fanali等人（2004）[31]的方法进行。简要来说，该程序包括将50 mg/mL的固定相悬浮在乙酸中，进行超声处理，然后将浆液转移到Valco HPLC短柱（50 × 4.1 mm ID）中。该预柱连接到LC泵和一根硅胶毛细管（35 cm长）。使用甲醇作为泵送溶剂，压力维持在30-35 MPa。通过入口和出口处的烧结熔块将固定相固定在硅胶毛细管中。通过在出口烧块处去除聚酰亚胺涂层，在出口处创建检测窗口。使用烷基苯标准混合物测试每根柱的稳定性和性能，并在每天结束时用ACN冲洗。

**2.2.2. 纳米液相色谱系统**
纳米液相色谱实验使用LC Packings Dionex公司的Ultimate? Capillary HPLC系统进行。设置包括VICI VALCO Instruments（美国德克萨斯州休斯顿）提供的手动样品注射器和低分散六通阀，配备5 μL外部回路。注射体积约为200 nL，基于流量和阀门切换时间估算。分离出的化合物在195 nm处通过适当的检测单元进行检测，采集速率为10 Hz。为了最小化死体积和谱带展宽，毛细管柱直接连接到注射阀。通过连续室温调节，色谱系统的温度保持在18至22°C之间。泵和UV-Vis检测器由Chromeleon?色谱管理系统软件（版本6.6，LC Packings）控制。

**2.2.3. 质谱条件和电喷雾接口**
纳米液相色谱系统通过定制的液体接头（L-J）电喷雾离子化（ESI）接口连接到LXQ离子阱质谱仪（Thermo Finnigan，美国加州圣何塞）。该接口由聚砜（PSU 1000）制成，采用基于早期工作的改进工艺设计，是一个多端口装置，用于连接喷雾液体储罐、电喷雾接触点、毛细管柱出口和ESI发射器尖端。通过将毛细管柱出口和发射器尖端之间的距离保持在约100 μm来实现精确对齐。使用PEEK管在接口体内维持这种紧密距离。鞘液流动由连接到L-J接口的小电解液储罐提供的静水压力驱动。发射器尖端由熔融石英毛细管（10 cm × 50 μm ID × 375 μm OD）制成，并用细砂纸打磨。使用XYZ线性平移台精确放置发射器尖端相对于质谱仪入口的位置，并通过模拟视频系统进行视觉确认。

**2.3. 质谱参数优化**
为了最大化信噪比（S/N），对质谱仪参数进行了优化。对于负离子或正离子模式分析，使用浓度为10 μg/mL的丁香酸或纳多洛尔溶液自动调整质谱仪。在负离子模式下，使用m/z 198.2处的基峰（BP）进行优化。应用了以下参数：喷雾电压 -1.8 kV；毛细管电压 -12.00 V；毛细管温度 195°C；管透镜电压 -5.00 V；自动增益控制（AGC）目标 1.00 × 10^5；微扫描次数 3次；最大注射时间 100毫秒。在正模式下，使用了 m/z 310.4 的 BP，质谱仪（MS）参数为：喷雾电压 +1.8 kV；毛细管电压 +28.00 V；透镜电压 +10.00 V。质谱数据是在 m/z 范围 140–800 内的全扫描模式下获取的。鞘液由 0.1%（体积/体积）甲酸（甲酸铵，pH 4.5）与 2-丙醇、水和甲醇按 10/10/80（体积/体积/体积）的比例混合而成。化合物的鉴定基于提取离子色谱图（EICs）中的保留时间和峰高与已知标准品的匹配。质谱图、总离子色谱图（TICs）、基峰色谱图（BPCs）和提取离子色谱图（EICs）是使用 Xcalibur? 2.0 软件（Thermo-Finnigan）获取和处理的。

2.2.4 NMR 实验
所有提取物的 NMR 光谱是在 28°C 下使用 Bruker AVANCE III HD 600 MHz 光谱仪（德国莱茵施泰滕）获得的，该光谱仪的工作频率为 600.13 MHz，并配备了多核 z-梯度逆探针头。化学位移以氯仿溶液中四甲基硅烷（TMS）信号在 0.00 ppm 处为内部参考。对于疏水性提取物，通过添加 128 个脉冲（每个脉冲宽度为 13 ppm，共 32k 个数据点）来记录 1H NMR 光谱，使用 zg（单脉冲）Bruker 脉冲序列，脉冲时间为 90°，持续 10–11 μs，循环延迟 5 s 以实现完全松弛。扫描次数（NS）设置为信噪比优于 200:1，以确保准确定量。松弛延迟（D1+AQ）约为 7.2 s，以确保扫描之间的磁化强度恢复足够（至少 > 95%）。NMR 光谱分析时间为 16–30 分钟。

考虑到仅对选定的信号进行相对定量，这些采集设置适合进行分析。采集后，数据被填充到 64k 个点，并在应用 0.3 Hz 指数衰减后进行傅里叶变换。经过手动相位和基线校正后，通过积分诊断信号（β-谷甾醇和菜油甾醇在 0.68 ppm，cynaropicrin 在 5.95 ppm，所有脂肪酸在 1.26 ppm）来进行相对代谢物定量，并将结果积分归一化到内部标准物的共振峰在 0.0 ppm。

2.3 样品制备
2.3.1 天然深共晶溶剂的合成
天然深共晶溶剂（NaDES）的合成按照 Garmroodi 等人 [34] 开发的程序进行。深共晶溶剂（DES）的组分 dl-薄荷醇和百里酚在真空烘箱中过夜干燥，以确保没有水分。在一个 20 mL 的螺旋盖玻璃小瓶中，通过精确称量各组分来按 2:1 的摩尔比（dl-薄荷醇: 百里酚）制备 DES。混合物在 313.15 K（40°C）下加热并搅拌，直到形成均匀溶液；继续搅拌 5 分钟。

2.3.2 固液萃取程序
本代谢谱研究使用的洋蓟材料是新鲜的、未成熟的 Cynara cardunculus L. subsp. scolymus 的花序。这些洋蓟是从罗马南部的当地市场购买的，被鉴定为“IGP Lazio’s Carciofo Romanesco”，这是一种受欧盟质量体系保护的地理标志产品（PGI），表明了它们的区域来源和质量标准。分析时仅考虑叶子；花序和茎部分用于进一步研究。购买后，将洋蓟储存在 4°C 下，并在几小时内将其解剖成特定的解剖部分：花心（花托）、外苞片、茎和紧邻的叶子。然后将叶子（来自不同的洋蓟）在 -55°C、0.200 mbar 下冻干 48-72 小时，以确保完全脱水。通过定期称重固体残留物来监测冻干过程中的水分含量，直到达到恒定重量，确认完全干燥。冻干后的材料使用叶片搅拌机（Termozeta，意大利米兰）进行细磨，并在 -40°C 下避光保存，直到进一步分析。这种低温储存是为了最小化潜在的代谢物降解。

每种冻干叶片样品准确称重 50 毫克，放入 15 mL 的聚丙烯（PP）螺旋盖离心管（Greiner Bio-One S.r.l，意大利）。加入 2 毫升（2.0 mL）萃取溶剂或 1.0 毫升深共晶溶剂（DES），然后涡旋混合 5 分钟（Heidolph Relax 2000，Heidolph Scientific Products，德国）。随后使用直接浸入式探头（Qsonica Q125，Qsonica L.L.C., 美国）在 20 kHz 和 50% 的振幅（最大功率 125 W）下进行超声波辅助固液萃取（USA-SLE），脉冲周期为 5 秒开启和 5 秒关闭，恒温浴保持萃取温度稳定在 20°C。萃取后，样品在 20°C 下以 4,000 RPM 离心 5 分钟（Hettich Universal 320R，Hettich Benelux B.V., 荷兰）。有机相（或 DES 相）使用玻璃 Pasteur 移液管小心收集，并转移到 8 mL 的螺旋盖玻璃小瓶中。然后使用 DC150-2 氮气样品浓缩器（Yooning，中国）在 37°C 下用干燥氮气流干燥提取物。干燥后，将残留物重新溶解在适合每种分析技术的溶剂中。

对于 Nano-LC-MS，将样品加入 500 μL 的 50/50（体积/体积）甲醇/水（MeOH/H2O）溶液中。溶液涡旋混合直至完全溶解，然后将样品转移到 2 mL 的聚丙烯离心管（Eppendorf S.r.l., 意大利）中，并以 13,400 RPM 离心 5 分钟（Eppendorf MiniSpin，Eppendorf S.r.l.）。上清液使用 25 μL 的 HPLC 微注射器（Hamilton Company，澳大利亚）收集并注入 nano-LC-MS 系统。对于非挥发性的 NaDES 提取物，将其与甲醇按 1:1（体积/体积）稀释，离心后按前述方法注射。所有提取物在 4°C 下避光保存，直到分析。

对于 NMR 实验，每种提取物溶解在含有 0.03% 四甲基硅烷（TMS）作为内部标准的 0.75 mL CDCl3 中，然后转移到一个 5 mm 的 NMR 管中并火焰密封。此外，DES 提取物用 CD3OD（9:1 体积/体积）稀释。

3. 结果与讨论
本研究的实验方面旨在表明，通过更可持续的制备方法可以实现植物基质中初级和次级代谢物的全面分析。传统上，从植物来源中提取疏水性组分依赖于 Bligh-Dyer 方法，该方法使用氯仿作为主要溶剂。在此基础协议的基础上，结合基于 NMR 的代谢物鉴定，本研究特别针对倍半萜内酯（STLs）（见图 1 的分子结构），并使用 nano-LC–UV-MS 进一步表征和定量，以确保高分析灵敏度。

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图 1. 在洋蓟叶子的亲脂组分中鉴定出的倍半萜内酯（STLs）的分子结构。

3.1 提取溶剂的选择和表征：生物活性化合物提取的物理化学安全性评估
从洋蓟叶子中提取生物活性化合物使用了固液萃取（SLE）结合超声波辅助萃取（UAE）以及一组符合 GC 原则 5（使用更安全的溶剂）和 7（使用可再生原料）的溶剂。实际上，如下所述，茴香醚、异戊基乙酸酯和乙酸乙酯都是来自可再生原料的环境友好且对人体安全的溶剂。使用的 2 mL 体积是最小可能的体积，以覆盖粉末样品。为了便于全面讨论，表 1 展示了这些溶剂的物理化学性质，这些性质影响它们的提取效率和安全性概况，以及根据 GSK 的溶剂可持续性指南 [35] 的可持续性指数 G。

表 1. 选定提取溶剂的物理化学性质和安全性概况
溶剂 Mw (g/mol) Teb (°C) TM (°C) 水溶性 (g/L) LogP (**) Snyder 极性指数 (P') GHS 危险性图示 (**) GHS 危险性声明 (*/****) GSK (G)
氯仿 119.3 61.1 8.0 1.9 4.1 H30 H315 H319 H331 H336 H351 H361d H372 4.4
乙酸乙酯 88.1 177.1 87.0 3.4 H2 25 H319 H336 6.7
异戊基乙酸酯 130.1 81.4 22.0 2.7 4.0 H2 26 H315 H319 H335 H336 7.3
茴香醚 108.1 154 1.5 2.6 2.3 H2 26 H315 H319 H336 7.4
L-薄荷醇 156.2 62 12 (42.0) 0.4 2.6 H315 H319 - 3-
百里酚 150.2 22 23 (50.0) 0.9 3.4 - H30 H314 H4 1-
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/; (**) Marvinsketch 19.24; (***) DES 中无数据

历史上，像氯仿这样的氯化溶剂在天然产物化学中被广泛用作从植物基质中提取亲脂性代谢物的基准溶剂 [36]。它们的有效性源于其独特的物理化学性质组合，包括对中等非极性化合物的高亲和力（高 LogP 和中等 Snyder 极性指数 P’），这允许它们有效地渗透复杂的基质 [37]。此外，它们低的水溶性（例如，氯仿在 20°C 时的溶解度为 8.1 g/L）确保了液-液萃取过程中的清晰相分离。由于它们的沸点低，它们特别适合快速加热和通过蒸发简单回收溶剂，而不会损坏热不稳定的化合物。尽管有这些技术优势，氯仿和氯化溶剂在现代实验室中逐渐被淘汰或受到严格限制。如表 1 所示，氯仿具有严重的 GHS 危险性声明，包括 H351（怀疑会导致癌症）、H361d（怀疑会对未出生的孩子造成伤害）和 H372（长期或反复接触会导致器官损伤）。这些风险以及其环境持久性使其与绿色化学原则不兼容。根据欧洲立法，这种不兼容性通过 REACH 法规（EC No. 1907/2006）正式规定，该法规将氯仿列在附件 XVII 中。此条目仅限于专业和工业用途，并明确禁止向公众销售。此外，根据 2004/37/EC 指令关于致癌物和突变原的预防层次结构，实验室在技术上可行时必须用更安全的替代品替换氯仿。这就是为什么在制药领域开发了溶剂选择指南的目的。通过比较表 1 中列出的溶剂的 G 指数值，可以清楚地看到茴香醚和异戊基乙酸酯是氯仿最可持续的替代品。此外，它们的物理化学性质通常与氯仿非常相似，使得这些替代溶剂在萃取方面具有潜力。在寻找传统石化基溶剂的可持续替代品时，水果酯类是主要候选者之一，正如我们在分析应用中使用异戊基乙酸酯的开创性研究 [38,39] 所证明的。与来自化石燃料的卤化溶剂不同，许多酯类可以从植物废弃物 [40] 中提取，或者通过环保的发酵 [41,42] 或催化酯化 [43] 生产。它们以其高生物降解性和低环境持久性而闻名。在意外释放的情况下，它们会更快地分解成无毒物质和代谢物。

如前所述，在选择替代氯仿的溶剂时，水不溶性和疏水性等因素至关重要；然而，沸点也是选择的重要标准。虽然像乙酸苯酯或异丙基乙酸酯（以及芳香族/酯类家族中的其他溶剂）等候选物可能具有有趣的化学性质，但许多溶剂的沸点超过 150-200 °C。这些溶剂在标准实验室条件下几乎是不挥发的，给样品浓缩和溶质回收带来了显著挑战。像乙酸乙酯和异戊基乙酸酯这样的小酯类分别具有高度和中等挥发性（见表 1）。尽管这两种溶剂都覆盖了广泛的亲脂性范围，但乙酸乙酯（LogP 0.73）非常适合提取中等极性化合物，而异戊基乙酸酯（LogP 2.70）提供了适合脂肪、油和非极性次级代谢物的高度疏水环境。如表 1 中的安全参数所述，这些溶剂通常没有严重的慢性毒性，其 GHS 情况通常表明较低的危害级别，主要是易燃性和轻微刺激，这提高了操作人员和提取过程中的安全性。作为水果酯类的专门生物替代品，茴香醚（甲氧基苯）作为回收疏水性目标物的有希望的选择。它通过木质素衍生的苯的甲基化合成，木质素是纸浆和造纸工业的主要副产品，具有类似于氯仿的亲脂性，具有中等挥发性和高不溶性（见表 1）。从毒理学角度来看，茴香醚不具有与慢性毒性相关的严重 GHS 危险性声明，如致癌性或生殖危害。其主要危害仅限于易燃性（H226）和轻微刺激（H315, H319），使其对实验室人员来说更加安全。

在选定的溶剂中，本研究还考察了深共晶溶剂（DES），这代表了可持续萃取技术的范式转变 [44]。具体来说，选择了两种天然萜类作为天然 DES（NaDES）的前体，即薄荷醇和百里酚，它们的疏水性在整个范围内较高，LogP 值超过 2.6，使其特别适合选择性回收高度非极性的生物活性分子。这两种都是生物来源的化合物（即可生物降解、可再生的）（分别存在于薄荷和百里酚中）。合成的共晶混合物被定义为天然深度共晶溶剂（NaDES），在室温下保持液态，在SLE-USA过程中表现出高热稳定性，并且不与水混溶。这些基于萜烯的溶剂的一个关键挑战是它们在宽广的温度范围内的挥发性较低。虽然这一特性对所有DESs来说都是共同的，通过降低实验室工作人员吸入毒性和易燃性的风险来提高安全性，但同时也给样品处理带来了显著障碍。具体来说，这种低挥发性阻止了通过常规蒸发方法去除溶剂，这可能会影响最终结果，正如在NMR和Nano-LC实验中后来报告的那样。此外，尽管这两种萜烯都是生物基和可再生的，但它们的毒理学特性差异很大，如表1中的GHS危险说明所示。薄荷醇通常是无害的，只有轻微的刺激危险（H315, H319），而百里酚的安全性则更为严重；它被分类为H302（吞食有害）和H314（导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤）。此外，表1中的“环境危害”图示表明百里酚对水生生物有毒，并且具有长期影响（H411说明）。这一分类强调了在提取过程后对NaDES进行严格处置和负责任废物管理的必要性，表明产品的天然来源并不一定意味着可以免除环境保护的需要。

3.2. 洋蓟叶的有机组分：NMR代谢物谱型
尽管科学文献[45]，特别是Sobolev等人的实验工作[28]，通过一维和二维NMR实验对洋蓟叶的有机组分进行了详尽的表征，但本文简要分析了按化学类别的分类，以补充当前的研究结果。信号分配基于之前的研究[28]，其中使用了相同类型的基质（即洋蓟叶）、相似的提取程序和相同的NMR采集协议。每个选定组分的信号集被识别并与之前的研究[28]进行了比较。图2显示了使用不同提取溶剂获得的疏水组分的1H-NMR光谱。需要注意的是，NaDES提取物是一个特例；由于其非挥发性，这种提取物无法蒸发至干燥，其特定的代谢谱型由共晶组分的主要信号所表征，将在后面的部分详细讨论。

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图2. 洋蓟叶提取物的1H NMR光谱的7.5 -3.5 ppm区域。使用的提取溶剂如下：a) 茴香醚，b) 异戊基醋酸酯，c) 乙酸乙酯，d) 氯仿，e) NaDES。星号、“o”和“+”分别表示cynaropicrin、grosheimin和脂肪酸中的双键。有关实验条件，请参见第2.2.4节NMR实验。
挥发性有机溶剂提取物（氯仿、乙酸乙酯、异戊基醋酸酯和茴香醚）的1H NMR谱型在化学组成上非常一致。这些光谱的特点是具有特定的区域，对应于初级和次级代谢物。具体来说，5.0–5.4 ppm范围内的信号归因于不饱和脂肪酸（FAs）的双键，而饱和脂肪酸链的亚甲基在2.9–1.2 ppm范围内被识别。值得注意的是，所有光谱在2.30 ppm处显示出α-CH?基团的信号，在2.05 ppm处显示出烯丙基CH?基团的信号，在2.81 ppm处显示出双烯丙基CH?基团的信号（对于亚油酸）。所有其他CH?基团出现在1.31-1.26 ppm范围内。
STLs的信号分布在1.6到6.4 ppm的宽光谱范围内[28]，特征性的1H-NMR信号在4.7–6.4 ppm区域清晰可见（图2a-d）。在这些信号中，cynaropicrin被鉴定为主要STL，其次是grosheimin。有趣的是，尽管之前有报道dehydrocynaropicrin是STL组分中的次要成分[28]，但在本研究的NMR光谱中未检测到它，这可能是由于叶片的发育阶段和植物品种的不同所致。
除了主要的STLs和FAs外，叶提取物的疏水组分还包括大量的甾醇。鉴定出的主要甾醇是β-谷甾醇和菜油甾醇，其次是豆甾醇。与其他代谢物组分的发现一致，四种有机提取溶剂中的甾醇谱型非常相似。在1H-NMR光谱中，这些植物甾醇主要出现在高场烷基区域。具体来说，0.68 ppm处的一个独特单峰归属于菜油甾醇和β-谷甾醇的18-CH3基团（数据未显示）。相比之下，0.70 ppm处的单峰对应于另一种次要甾醇豆甾醇的18-CH3基团。
在深度共晶溶剂（NaDES，图2e）的情况下，溶剂组分（薄荷醇和百里酚）的强烈1H NMR信号使得大部分1H NMR光谱变得模糊，尤其是在2.6–0.6 ppm、3.8–3.2 ppm和5.3–4.3 ppm区域。除非使用完全氘代的DES组分作为溶剂，否则无法从1H NMR分析中获得关于脂肪酸和甾醇等化合物类别的光谱信息。然而，完全氘代的薄荷醇和百里酚在市场上不可获得；因此，只能获得关于DES提取物组成的有限见解。在DES提取物的6.3–5.3 ppm区域观察到了特征性的STL信号，从而能够识别它们。与氯仿提取物一样，cynaropicrin是主要的STL，grosheimin作为次要成分存在。
考虑到三类中最丰富的化合物，即STLs、甾醇和FAs，表2报告了三种提取物中cynaropicrin以及β-谷甾醇和菜油甾醇的总丰度与氯仿提取物的比较。cynaropicrin在氯仿提取物中的丰度最高，而异戊基醋酸酯是提取甾醇最有效的溶剂。

表2. 使用不同提取溶剂进行SLE-USA处理后洋蓟叶提取物中选定组分的1H-NMR相对丰度（以%表示）。
化合物 氯仿 乙酸乙酯 异戊基醋酸酯 茴香醚 β-谷甾醇+菜油甾醇
100.0 94.3 115.6 109.4 100.0 81.9 83.7 3.2
总脂肪酸（1.43 - 1.17 ppm） 100.0 56.5 100.1 27.0
回收数据的精确度，以RSD（%）表示，大约为5%。

3.3. 洋蓟叶SLE后Nano-LC-UV和MS谱型的溶剂比较研究
为了补充基于NMR的表征，使用不同提取溶剂获得的洋蓟叶疏水组分进一步通过纳米液相色谱结合紫外检测（nano-LC–UV）和质谱（nano-LC–MS）进行了研究。
尽管分离技术与UV检测结合使用不如MS具有选择性，但它是一种用于复杂植物提取物指纹分析的成熟方法[46]。
在这方面，结合UV检测的nano-LC，特别是在195 nm处，作为一个非选择性检测器。所得到的色谱谱型提供了疏水提取物的全面定性指纹，从而可以比较不同的提取溶剂。
如图3所示，所有色谱谱型都由峰#4主导，通过MS鉴定为cynaropicrin，确认了其在Cynara scolymus叶中的主要亲脂生物活性标记物的作用。通过MS鉴定出几个次要峰，其强度是cynaropicrin的6到15倍，这些次要峰被鉴定为次级STLs。尽管这些次要组分在1H-NMR实验中未被检测到（除了grosheimin），这种差异可能是由于叶片的发育阶段和植物品种的不同。
除了主要的STLs和FAs外，叶提取物的疏水组分还包括大量的甾醇。鉴定出的主要甾醇是β-谷甾醇和菜油甾醇，其次是豆甾醇。与其他代谢物组分的发现一致，四种有机提取溶剂中的甾醇谱型非常相似。在1H-NMR光谱中，这些植物甾醇主要出现在高场烷基区域。具体来说，0.68 ppm处的一个独特单峰归属于菜油甾醇和β-谷甾醇的18-CH3基团（数据未显示）。相比之下，0.70 ppm处的单峰对应于另一种次要甾醇豆甾醇的18-CH3基团。
在深度共晶溶剂（NaDES，图2e）的情况下，溶剂组分（薄荷醇和百里酚）的强烈1H NMR信号使得大部分1H NMR光谱变得模糊，尤其是在2.6–0.6 ppm、3.8–3.2 ppm和5.3–4.3 ppm区域。除非使用完全氘代的DES组分作为溶剂，否则无法从1H NMR分析中获得关于脂肪酸和甾醇等化合物类别的光谱信息。然而，完全氘代的薄荷醇和百里酚在市场上不可获得；因此，只能获得关于DES提取物组成的有限见解。在DES提取物的6.3–5.3 ppm区域观察到了特征性的STL信号，从而能够识别它们。与氯仿提取物一样，cynaropicrin是主要的STL，grosheimin作为次要成分存在。
考虑到三类中最丰富的化合物，即STLs、甾醇和FAs，表2报告了三种提取物中cynaropicrin以及β-谷甾醇和菜油甾醇的总丰度与氯仿提取物的比较。cynaropicrin在氯仿提取物中的丰度最高，而异戊基醋酸酯是提取甾醇最有效的溶剂。

表2. 使用不同提取溶剂进行SLE-USA处理后洋蓟叶提取物中选定组分的1H-NMR相对丰度（以%表示）。
化合物 氯仿 乙酸乙酯 异戊基醋酸酯 茴香醚 β-谷甾醇+菜油甾醇
100.0 94.3 115.6 109.4 100.0 81.9 83.7 3.2
总脂肪酸（1.43 - 1.17 ppm） 100.0 56.5 100.1 2.7
回收数据的精确度，以RSD（%）表示，大约为5%。

3.3. 洋蓟叶SLE后Nano-LC-UV和MS谱型的溶剂比较研究
为了补充基于NMR的表征，使用不同提取溶剂获得的洋蓟叶疏水组分进一步通过纳米液相色谱结合紫外检测（nano-LC–UV）和质谱（nano-LC–MS）进行了研究。
虽然分离技术与UV检测结合使用不如MS具有选择性，但它是一种成熟的复杂植物提取物指纹分析方法[46]。
在这方面，结合UV检测的nano-LC，特别是在195 nm处，作为一个非选择性检测器。所得到的色谱谱型提供了疏水提取物的全面定性指纹，使得可以比较不同的提取溶剂。
如图3所示，所有色谱谱型都由峰#4主导，通过MS鉴定为cynaropicrin，确认了其在Cynara scolymus叶中的主要亲脂生物活性标记物的作用。通过MS鉴定出几个次要峰，其强度是cynaropicrin的6到15倍，这些次要峰被鉴定为次级STLs。尽管这些次要组分在1H-NMR实验中未被检测到（除了grosheimin），这种差异可能是由于NMR的灵敏度较低以及NMR光谱中基质信号的重叠，这可能会掩盖这些次要STLs的较弱共振。

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图3. 使用不同提取溶剂获得的洋蓟叶的nano-LC–UV色谱谱型比较。实验条件：毛细管柱，内径100 μm，长度25.0 cm（有效长度26.5 cm），填充Chromspher C18颗粒材料（3.0 μm，120 ?，Varian）；流动相：梯度程序，流速210 nL/min；室温；进样体积：200 nL。检测波长：195 nm。有关峰的鉴定，请参见图1。有关更多信息，请参见第2节。
在半定量分析之前，通过评估主要色谱参数的重复性来评估仪器的变异性。日内（n=6）和日间（n=12，d=3）的精度测试显示，保留时间的平均变异性分别为0.1%和0.5%。对于峰面积，相应的变异性分别为4.2%和6.1%。
对20–25分钟范围内（大多数生物活性信号洗脱）的色谱面积进行比较分析，发现替代溶剂的相对回收率介于100%到107%之间，与氯仿相当或略高。然而，需要注意的是，这些光谱观察仅限于有色分子，不涉及非UV活性物种。
使用NaDES获得的提取谱型与使用传统有机溶剂获得的谱型有显著差异。由于其非挥发性，NaDES被稀释后直接注入提取的基质中。虽然nano-LC需要过载柱条件以最大化灵敏度，但通常通过柱内聚焦注射塞来最小化峰形失真。这种聚焦效果高度依赖于稀释溶剂的选择。在这种情况下，NaDES的高粘度和物理化学性质对聚焦机制产生了不利影响，导致信号严重失真。因此，NaDES提取物的定量评估仍处于初步阶段，尽管定性谱型表明其提取能力受到其组分疏水性的驱动。
进行了Nano-LC-MS实验，以鉴定和量化之前在UV色谱谱型中观察到的主要倍半萜内酯（STLs）。尽管文献经常描述STL分析是在正离子模式下进行的[[47]，[48]，[49]，[50]，[51]]，但使用J-L电喷雾接口可以提高电离效率，从而在正离子和负离子模式下实现高灵敏度检测。为了确定最佳条件，使用氯仿提取物进行了电离模式的比较研究。对主要STLs（特别是cynaropicrin和grosheimin）的质谱进行分析，发现正离子模式主要产生[M+H]+离子，尽管也观察到了更强的[M+NH4]+加合物（m/z，[M+18]）。在这种情况下，电离液设置在酸性条件下（甲酸），但较弱的MS信号表明它不支持有效的电离；相反，添加缓冲液（甲酸铵，pH 3.5）对于产生强信号是必要的。相反，负离子模式的特点是[M+HCOO]-甲酸盐加合物（m/z，[M+45]）占主导（见补充材料，图S1）。比较两种模式的基峰色谱（BPCs），负离子模式产生了更丰富的谱型和更详细的质量谱。因此，选择负离子模式进行提取物的全面表征。
洋蓟叶的倍半萜内酯（SLT）谱型具有高化学多样性，这一点在文献中有广泛记录。在这项研究中，通过将我们的实验证据与已建立的文献数据相关联并评估它们的相对丰度，鉴定了六种主要的SLT。这些化合物的化学结构在图1中进行了总结。同时，它们在基峰色谱（BPC）中的存在通过图4中显示的特定提取离子色谱（EICs）得到了证明。

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图4. 通过nano-LC-MS获得的洋蓟叶氯仿提取物的基峰色谱（BPC）和提取离子色谱（EICs）。鉴定出的化合物：(1) 11,13-二氢脱酰基cynaropicrin [49]，(2) 11,13-二羟基-8-脱氧grosheimin [49]，(3) grosheimin [28]，(4) cynaropicrin [28]，(5) 衍生物II [50]，以及(6) dehydrocynaropicrin [28]。有关详细实验条件，请参见图3和第2节。
为了评估所提出的可持续溶剂的提取效率，研究了两个主要方面：整体提取质量（即提取的代谢物总量）和鉴定出的STL类的定量产量。
由于L-J接口作为纳米喷雾工作，电喷雾效率非常高。考虑到通过MS尖端的出口流速达到数百纳升/分钟，信噪比（S/N）显著高于传统LC-MS接口。因此，总离子电流（TIC）和基峰色谱（BPC）定义得非常清晰，显示出与UV检测相当的分辨率和谱型一致性。
为了评估可持续替代剂与传统氯仿的提取效率，使用BPC分析作为可靠的比较工具。如图5所示，BPC谱图显示每种溶剂都有独特的指纹模式，其中NaDES在选择性和产率方面表现出最显著的差异。这一比较强调了绿色溶剂在匹配甚至提高特定目标代谢物回收率方面的潜力。下载：下载高分辨率图像（312KB）下载：下载全尺寸图像图5. 使用不同提取溶剂从洋蓟叶提取物中获得的基峰色谱图（BPC）的比较研究。实验条件：负离子模式下的nano-LC-MS分析；有关进一步的色谱和质谱参数，请参见第2节和图4。与研究目标一致，氯仿谱图的比较显示其较高峰值在替代溶剂中始终存在。乙酸乙酯和异戊基乙酸酯显示出相似的谱图，尽管后者的信号强度几乎高一个数量级。虽然这些选定的酯类表现出有趣的提取能力，但它们的谱图似乎比氯仿的稍微简单一些。相反，茴香醚产生的谱图与氯仿非常相似；其提取丰富性和峰分布表明它是一个可行的绿色替代品。最后，如前所述，在紫外检测中，NaDES提取物的BPC受到共晶基质存在的强烈影响。然而，其提取能力仍然显著，能够捕获目标生物活性化合物。在对色谱图进行定性分析后，进行了目标定量分析，以评估从不同提取溶剂中回收的STLs的情况。以传统氯仿方法的提取产率为基准（100%），比较了可持续替代品的效率，如表3所示。表3. 使用不同提取溶剂通过SLE-USA程序后洋蓟叶提取物中选定组分的相对丰度（%）的nano-LC-MS结果。有关实验条件，请参见第2节。峰号化合物氯仿乙酸乙酯异戊基乙酸酯茴香醚111,13-二氢去酰基西那罗皮林100.091.7118.182.1211,13-二羟基-8-脱氧格罗斯海明100.072.4101.480.63格罗斯海明100.087.8109.478.84西那罗皮林100.0102.4113.895.05der 2100.089.1114.278.56脱氢西那罗皮林100.043.5113.047.7回收数据的精度（n=3），表示为RSD（%），在7-12%的范围内。主要关注的是西那罗皮林，这是洋蓟叶的主要生物活性标志物。数据表明异戊基乙酸酯是一个明显更好的替代品，对于西那罗皮林和格罗斯海明以及其他衍生物，其回收率均超过100%。茴香醚也是一个强有力的候选者；尽管其西那罗皮林的回收率略低于氯仿参考值，但仍处于可接受的分析范围内。这证实了BPC（图5）中观察到的化学丰富性直接导致了高定量产量。相比之下，乙酸乙酯产生了更不一致的结果：虽然它有效地回收了西那罗皮林，但对于其他STLs（如格罗斯海明）的效率较低，对于脱氢西那罗皮林的效率更低。关于西那罗皮林的定量，MS回收数据和NMR结果之间观察到了轻微的数值差异。尽管如此，所有测试的生物溶剂都能实现超过80%的回收率，这使它们成为有效且可持续的替代品。两种技术之间的差异源于它们不同的检测原理、校准方法、选择性、动态范围和基质效应。3.4. 可持续提取溶剂的先验选择为了评估替代氯仿的可行性，考虑了几种物理化学描述符来选择具有模仿传统氯化溶剂溶解能力的“绿色”候选者。特别是，比较了溶质和溶剂的实验和理论描述符，如辛醇-水分配系数（LogP）的对数、溶剂粘度和表面张力以及汉森溶解参数（HSPs）[52],[51]，以评估化学亲和力并对目标化合物或特定植物基质部分的溶解度进行更准确的预测。详细来说，汉森方法受到“相似相溶”方法的启发，将溶剂的总内聚能（每摩尔体积）分解为3个HSPs，分别代表分散（δD）、极性（δP）和氢键（δH）力，为先验溶剂选择提供了一个合理的框架。在3D汉森溶解空间中，考虑到G ≥7且沸点≤155°C的生物溶剂，与氯仿最接近的溶剂是茴香醚（Ra= 1.8；δD = 17.8，δP = 4.4，δH = 6.9）、乙酸乙酯（Ra= 4.8；δD = 15.8，δP = 5.3，δH = 7.2）和异戊基乙酸酯（Ra= 5.2；δD = 15.3，δP = 3.1，δH = 7.0）。所有这些溶剂都与氯仿非常相似，且随着Ra距离的增加，其溶解能力的匹配概率降低。它们的δP和δH项表明它们的极性较低；实际上，它们都与水不互溶。然而，乙酸乙酯的极性最高（δP+δH= 12.5）；因此，它可能导致不需要的极性杂质的共提取，从而可能使亲脂谱图复杂化。这一理论与实验中的LogP结果相符，乙酸乙酯的LogP明显低于其他溶剂（分别为1.97、2.11、2.25）。在洋蓟叶研究中，长链脂肪酸（例如棕榈酸、亚油酸和亚麻酸）的提取，通常具有高于6的LogP值，理论上可以使用n-己烷（代表非极性极端溶剂，LogP约为3.9）来实现；然而，像Bligh-Dyer提取这样的传统方法依赖于氯仿，尽管其LogP较低（1.97），但它创建了一个有利于疏水相互作用的环境，同时排除了像糖或黄酮类这样的高极性成分。茴香醚和异戊基乙酸酯的稍高LogP值（分别为2.11和2.25）进一步提高了它们穿透植物角质层疏水蜡层的能力，有助于甾醇和脂肪酸的回收。最后，除了化学亲和力外，物理性质也影响传质动力学，即提取发生的速度。在这方面，参考溶剂氯仿的粘度非常低（η= 0.54 cP），这使得快速通过基质成为可能。尽管茴香醚和异戊基乙酸酯的粘度稍高（约1.0 cP），但它们仍然远低于会阻碍传质的阈值，不像粘性的NaDES。此外，叶片表面的“润湿”对于穿透角质层蜡质至关重要。在这项研究中，异戊基乙酸酯表现出最低的表面张力（约24 mN/m），尽管它接近氯仿（27.2 mN/m）。这种改进的润湿能力可以确保与目标基质的有效接触，从而提高提取效率。物理化学参数的先验分析表明，茴香醚和异戊基乙酸酯都是提取洋蓟亲脂部分的高度可行的可持续替代品。虽然茴香醚在HSPs和LogP方面与氯仿非常相似，但异戊基乙酸酯的表面张力较低，这可以改善其渗透基质的能力。相反，尽管乙酸乙酯是一种有效的绿色溶剂，但其相对较高的极性与纯疏水部分的较低选择性相关。3.5. 可持续性的定量评估植物基质中的水分含量对植物代谢组学研究有显著影响，会影响样品保存和有机提取溶剂的效率，并干扰仪器分析。此外，水可以延长酶活性并促进真菌和细菌的生长，改变样品的化学组成。特别是在1H NMR实验中，宽的水信号可能会使谱图解释复杂化。因此，样品干燥是所有类型样品制备前的必要步骤。冷冻干燥是最常用且可靠的技术，特别是对于像倍半萜内酯这样的热敏感分析物。均质化，由于使用时间短（几秒钟），其能耗可以忽略不计，是确保样品一致性和可比性的另一个基本步骤[53]。除了这些不可避免的预处理外，随后的提取阶段容易受到绿色评估指标的改进。实际样品制备使用了AgreePrep指标（图6）进行了定量可持续性评估。尽管用其他条件相同的情况下，用氯仿（图6 A）或异戊基乙酸酯（图6 B）替代氯仿作为提取溶剂有明显优势。下载：下载高分辨率图像（197KB）下载：下载全尺寸图像图6. 基于使用氯仿（A）或异戊基乙酸酯（B）作为提取溶剂进行样品制备评估的AGREEprep象形图。使用高挥发性的氯仿意味着在标准n. 6（样品吞吐量）和n. 8（能耗）方面有所增益，因为更快的蒸发可以在更短的时间内处理双倍数量的样品，从而节省能源。然而，考虑到使用了高功率质谱检测器（已经因标准9 - 样品制备后的分析配置而受到惩罚），使用常见台式实验室设备进行有限时间的样品制备所消耗的能源在确定方法的可持续性方面可以忽略不计。另一方面，氯仿的严重毒理学特性，会对器官造成损害，并被认为会导致癌症和伤害未出生的孩子，显著降低了总体得分。在这方面，根据标准10，氯仿比健康安全的异戊基乙酸酯多一个象形图，但该指标没有考虑危害类型。此外，标准3（材料的可持续性、可再生性和可重复使用性）严重惩罚了氯仿的使用，因为它既不可持续也不可再生，而异戊基乙酸酯则不是。总体而言，使用异戊基乙酸酯代替氯仿的优势超过了劣势，得分更高（0.69而不是0.54）。甲基叔丁基醚（MTBE）也会得到类似的得分（0.67），这是一种在Bleigh Dyer提取中提出的比氯仿更安全的替代品[54]，但由于其石化来源与可持续方法不一致，因此在本研究中未进行测试。关于流动相消耗，标准9惩罚了不考虑流速的液相色谱使用。在这项工作中，nano-LC技术使用的流速为210 nL/min，这意味着每次分析的流动相消耗仅为10.5 μL，在传统LC中相当于注射体积的数量级。鉴于GAC原则5和7鼓励减少废物和使用微型化方法[55]，这是一个巨大的优势。4. 结论在这项研究中，我们成功开发了一种可持续的分析方法，用于洋蓟叶的植物化学成分分析，重点关注亲脂代谢物的挑战性提取。通过使用固液提取（SLE）结合超声辅助提取（USA）来替代有害的氯化溶剂，如茴香醚和异戊基乙酸酯等环保的生物基替代品，显著降低了样品制备步骤的环境影响，而不会大幅降低提取效率。来自微型化nano-LC和NMR技术的结果证明了对洋蓟基质的全面表征非常有效。这种组合使得关键生物活性分子的精确鉴定成为可能，特别是对倍半萜内酯（STLs）如西那罗皮林的鉴定，这些化合物对植物的营养价值至关重要。使用nano-LC-MS和NMR不仅提供了高灵敏度和结构阐明，还显著减少了溶剂和样品的消耗，进一步强化了工作流程的绿色性质。从理论角度来看，我们的结果表明，成功转向基于生物的溶剂取决于平衡热力学亲和力和传质动力学。根据汉森溶解参数（HSP）谱图，茴香醚在化学上是最相似的氯仿替代品。然而，异戊基乙酸酯在工艺效率方面似乎是更好的选择；其较低的表面张力和较高的LogP促进了更深入的植物基质渗透，并提高了最疏水STLs的回收率，这得到了我们的半定量MS数据的支持。它们的高回收率提供了强有力的证据，表明可以在不失去分析深度或定量准确性的情况下逐步淘汰氯仿。具体来说，异戊基乙酸酯可能是最有前途的“绿色”替代品，因为它在所有识别的STLs中表现良好，并且经常超过传统溶剂。通过AGREEprep进行的定量可持续性评估证实了这些发现，异戊基乙酸酯的表现优于氯仿（0.69对比0.54），因为它具有更高的可再生性和操作安全性。结合nano-LC系统的最小废物，这种方法完全符合绿色分析化学的核心原则。这项研究可以为洋蓟副产品的质量控制和营养评估建立一个稳健的、环境负责的框架，也可以用于其他复杂植物基质。作为未来的方向，这些结果为开发用于定量分析洋蓟中识别的STLs的LC-DAD方法奠定了初步基础。数据可用性数据将应要求提供CRediT作者贡献声明A. P. Sobolev：撰写——原始草稿、方法学、调查、正式分析、数据管理。C. Dal Bosco：撰写——审阅与编辑、概念化、正式分析。G.D’Orazio：撰写工作——原始草稿的撰写、研究方法的设计、数据收集与分析、审稿与编辑、项目监督以及概念框架的构建。
与本文相关的补充材料可在线版本中找到。
CRediT作者贡献声明：
A.P. Sobolev：审稿与编辑、原始草稿的撰写、数据整理与分析；
C. Dal Bosco：审稿与编辑、原始草稿的撰写以及概念框架的构建；
G. D’Orazio：审稿与编辑、原始草稿的撰写、项目监督、研究方法的设计以及概念框架的构建。