《Journal of Controlled Release》：Nanobubble based sonobiopsy reveals circulating protein signatures of BBB opening in healthy and glioblastoma-bearing mice
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聚焦超声（FUS）联合微泡可瞬时增加血脑屏障（BBB）通透性，然而血脑屏障开放（BBBO）的验证主要依赖于对比增强磁共振成像（MRI），该方法对屏障调节的分子后果提供的洞察有限。声学生物活检利用FUS诱导的BBBO将脑源性分子释放至血流中，提供了基于血液样本的
聚焦超声（FUS）联合微泡可瞬时增加血脑屏障（BBB）通透性，然而血脑屏障开放（BBBO）的验证主要依赖于对比增强磁共振成像（MRI），该方法对屏障调节的分子后果提供的洞察有限。声学生物活检利用FUS诱导的BBBO将脑源性分子释放至血流中，提供了基于血液样本的分子读数。纳米气泡（NBs）作为一种更小的制剂，在脑微血管中循环更有效，并已显示出在毛细血管中增强BBBO的效果。在此，研究人员建立了基于NB的声学生物活检平台，以增强生物标志物的外流和分子灵敏度，并将其应用于定义健康和胶质母细胞瘤（GBM）模型中BBBO的蛋白质组特征。收集FUS介导的NB处理前后血浆进行基于数据非依赖采集（DIA）的质谱分析，揭示了健康小鼠和荷瘤小鼠在BBBO后的蛋白质组变化。在健康队列中，77种蛋白质在BBBO后发生可重复改变。六种蛋白质（Dpysl3, Myl1, Mybpc1, Vsig4, Krt33a, Krtap6-5）仅在健康小鼠BBBO后可检测到。在005胶质瘤荷瘤小鼠中，健康动物中确定的BBBO特征得以保留，并能清晰区分处理前与处理后的样本。随后在微泡（MB）队列中评估了NB队列中鉴定的候选BBBO相关蛋白质，结果显示NB观察到的预处理到后处理的蛋白质变化在MB中未得到复现。这些发现确立了NB介导的蛋白质组声学生物活检作为一种在健康及疾病相关条件下验证BBBO的有前景的方法，并支持开发可扩展的分子读数用于BBBO确认。该平台还可补充专注于疾病的声学生物活检方法，包括神经肿瘤学中的蛋白质生物标志物研究。
该研究针对当前脑疾病治疗与诊断领域的关键瓶颈展开了深入探讨。尽管聚焦超声（FUS）介导的血脑屏障开放（BBBO）已成为极具前景的非侵入性技术，但其临床转化面临两大核心挑战：一是现有BBBO验证手段（如对比增强MRI、染料外渗）多为物理层面的确认，缺乏对分子后果的解析，且存在成本高昂或需终端取材的局限；二是传统声学生物活检多依赖微泡（MBs），且在蛋白质组层面的探索不足。鉴于纳米气泡（NBs）在毛细血管中增强BBBO的独特优势，研究人员旨在建立NB介导的蛋白质组声学生物活检平台，解析健康及胶质母细胞瘤（GBM）模型下BBBO的循环蛋白特征，以期为BBBO验证提供新的分子标尺。该研究成果已发表于《Journal of Controlled Release》。
为实现上述目标，研究人员采用了几项关键技术方法：首先，构建了005胶质瘤干细胞（GSC）系的小鼠GBM模型，并通过立体定向注射建立对照组（Sham）。其次，分别制备了用于BBBO的纳米气泡（NBs，约160-180 nm）和微泡（MBs，约1.5 μm）。接着，利用FUS系统（850 kHz）结合静脉内注射的NBs或MBs进行声学生物活检干预。最后，采集处理前后的血清样本，利用数据非依赖采集（DIA）模式的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行全局蛋白质组学分析，并结合生物信息学与统计学方法筛选差异表达蛋白。
研究结果部分详细阐述了以下内容：
1. 全局蛋白质组变化（Global proteomic changes following FUS-mediated BBBO）
通过对健康小鼠FUS介导NB处理后血清的质谱分析，研究人员检测到1754种蛋白质。差异分析显示广泛的丰度变化，其中10种蛋白质具有极高的统计学意义（p < 0.001）和较大的倍数变化（FC, log?FC > 3.5）。功能富集分析（Proteomaps）表明，BBBO触发了涉及中枢碳代谢、生物合成、蛋白质折叠与降解、细胞骨架重塑及囊泡运输的系统性生理反应，具体包括糖酵解、紧密连接调节、细胞周期进程和外泌体形成等通路的激活。
2. 稳健BBBO相关蛋白标志物的鉴定（Identification of robust protein markers associated with BBBO）
为确保标志物的可重复性，研究人员在健康小鼠中独立进行了两次蛋白质组实验。通过设定严格的筛选标准（p值 < 0.05且FC > 1.5），最终确定了77种在两次实验中均发生一致变化的蛋白质。进一步分析显示，其中24种蛋白质表现出高调控幅度（平均log? FC ≥ 2），特别是Dpysl3、Myl1、Mybpc1、Vsig4、Krt33a和Krtap6-5这六种蛋白，仅在BBBO后的样本中稳定检出，构成了核心分子特征。
3. 肿瘤模型中的组织学验证（Verification of BBBO in tumor-bearing mice using histological analysis）
在病理模型验证阶段，通过伊文思蓝（EB）染料外渗实验证实，虽然GBM模型本身存在一定程度的血管渗漏（肿瘤相关泄漏），但FUS联合NBs处理显著增强了血管通透性，证明了该方案在复杂肿瘤微环境下的有效性。H&E染色进一步确认了肿瘤组织的存在及处理的安全性。
4. 候选蛋白标志物在模型中的验证（Validation of candidate protein markers in sham and GBM models）
利用前述77种蛋白特征对健康小鼠和005胶质瘤小鼠进行主成分分析（PCA），结果显示处理前与处理后的样本在两组中均能清晰分离，表明该分子特征在病理状态下依然适用。针对六种核心候选蛋白的定量分析显示，在Sham组和GBM组中，这些蛋白在BBBO后均显著上调（p < 0.01至p < 0.0001），尽管肿瘤组变异性较大，但趋势一致，验证了其在跨生理状态下的稳健性。
5. MB队列中NB衍生标志物的评估（Assessment of NB-derived BBBO markers in an MB cohort）
为了对比不同制剂的效果，研究人员在MB介导的声学生物活检队列中评估了上述标志物。结果显示，四种共有的候选蛋白（Dpysl3, Myl1, Mybpc1, Krt33a）在MB处理后，无论是Sham组还是GBM组，均未表现出显著的预处理到后处理变化，且Vsig4和Krtap6-5在MB队列中根本未检出。这表明NB诱导的蛋白组声学生物活检信号具有独特的制剂依赖性。
讨论部分总结了该研究的核心贡献与意义。研究人员成功建立了NB介导的蛋白质组声学生物活检技术，首次证明NB-FUS可在循环中诱导可重复的蛋白质组特征。相较于MBs，NBs能更有效地释放特定的脑源性蛋白进入循环，这可能源于其优异的毛细血管穿透能力。这一发现不仅提供了一种替代传统物理成像的“分子读out”，用于验证BBBO的发生，还揭示了Dpysl3、Myl1等蛋白作为潜在的神经血管激活或通透性敏感哨兵标志物。在GBM模型中保留的健康BBBO特征，证明了该方法的临床转化潜力，即未来可通过简单的血液检测辅助MRI引导下的FUS治疗监测，减少昂贵影像学的依赖。此外，该技术也为神经肿瘤学中难以通过传统手段获取的脑源性蛋白标志物提供了新的液体活检策略。尽管研究受限于成本、样本量及未进行MRI安全性评估，但它为优化FUS参数、理解BBBO生物学后果以及开发下一代脑部药物递送监测系统奠定了坚实的分子基础。
