《Journal of Electroanalytical Chemistry》：Electrocatalytic oxidation of “electroactive” and “non-electroactive” protein amino acids by transition metal hexacyanoferrates
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康斯坦丁·V·比比克 | 埃琳娜·V·苏普伦 | 亚历山大·S·布兹拉科夫 | 塔蒂亚娜·D·罗曼佐娃 | 安娜·S·安德烈耶娃 | 达里亚·V·沃赫米亚尼娜 | 阿尔卡季·A·卡里亚金莫斯科国立大学M.V.罗蒙诺索夫化学系，列宁山，1/3，莫斯科119991，俄罗斯摘要研究发现
康斯坦丁·V·比比克 | 埃琳娜·V·苏普伦 | 亚历山大·S·布兹拉科夫 | 塔蒂亚娜·D·罗曼佐娃 | 安娜·S·安德烈耶娃 | 达里亚·V·沃赫米亚尼娜 | 阿尔卡季·A·卡里亚金
莫斯科国立大学M.V.罗蒙诺索夫化学系，列宁山，1/3，莫斯科119991，俄罗斯
摘要 研究发现，过渡金属六氰铁酸盐(II)（MHCF，其中M为Fe(III)、Co(II)、Ni(II)或Cu(II)）是有效的电催化剂，可用于氧化“电活性”和“非电活性”的蛋白质氨基酸。研究中使用了通过电合成法改性的碳纳米颗粒电极（SPE）。循环伏安法和安培流式注射分析（FIA）显示，pH值对MHCF的稳定性和氨基酸的分析信号有显著影响。CuHCF仅在强酸性环境（pH 1–3）下稳定；FeHCF（普鲁士蓝，PB）仅在酸性介质（pH 1–6）下稳定；CoHCF和NiHCF在较宽的pH范围内（pH 1–9）稳定。在大多数情况下，CoHCF在中性和碱性pH下催化氨基酸氧化的能力优于NiHCF。作为例外，在酸性介质中，使用PB或CuHCF时记录到半胱氨酸的阳极电催化电流值最高。通过选择合适的MHCF电极改性剂、电解质pH值和施加电位，可以灵敏且选择性地检测个别氨基酸。随着电极上MHCF覆盖率的增加（0–3 nmol/cm2），氨基酸的分析信号也随之增强。在蛋白质氨基酸中（半胱氨酸除外），在pH 8.0条件下，使用SPE/CoHCF进行安培流式注射分析时，精氨酸、赖氨酸、天冬酰胺和丝氨酸的催化效果最佳，电流增强了20倍。使用MHCF改性的电极获得的多数氨基酸校准曲线位于微摩尔和毫摩尔浓度范围内，检测限为微摩尔级别；这些曲线非线性，并具有催化反应特有的平台区。用MHCF改性电极表面后，几乎可以在接近生理pH值的条件下检测到所有蛋白质氨基酸的信号，这对于灵敏检测游离氨基酸（尤其是“非电活性”氨基酸）以及肽和蛋白质非常重要。
引言 除了是蛋白质的构成单元外，许多氨基酸对于某些生命过程也是不可或缺的，或者具有自身的特定功能[1]。它们可以作为神经递质、神经递质和其他重要代谢物的前体，还能刺激激素释放，并参与器官间的氮运输和氮排泄。因此，通过饮食或局部补充来调节游离氨基酸的水平可以支持和调节这些特定功能[1]。除了游离氨基酸外，生物活性肽还是药物设计的优秀来源，在制药、营养补充剂和化妆品领域得到广泛应用[2][3][4][5]。最近，源自食品的短链生物活性肽因其潜在的健康益处和安全性而受到广泛关注[6]。这些肽由2–20个氨基酸组成，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗菌、抗高血压和免疫调节作用[6]。从结构特性来看，脯氨酸（Pro）和甘氨酸（Gly）是生物活性肽中的主要氨基酸[5]。由Gly和Pro残基组成的肽被称为“甘氨酰脯氨酸”[4]。疏水性氨基酸对于血管紧张素转换酶和二肽基肽酶IV的抑制以及抗氧化肽至关重要[5]。值得注意的是，抗氧化肽的C端残基常含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和组氨酸（His）[5]。然而，由于氨基酸残基数少且极性范围广，传统的蛋白质组学方法不适合高效分离和准确鉴定短链肽[7][8]。
电分析方法似乎是通过氨基酸的氧化反应来检测和研究游离氨基酸和短链肽的有前景的方法[9]。在蛋白质氨基酸中，含硫的甲硫氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）和胱氨酸（Cys-Cys），以及芳香族氨基酸Trp、His和Tyr通常被认为是“电活性”的（易于氧化的）[9][10]。在阳极伏安图中，Cys、Tyr和Trp在0.5–1 V时显示出明确的信号，而His、Met和Cys-Cys在较高正电位（1–1.5 V，相对于Ag/AgCl，中性pH）时仅显示微弱信号[9][10]。对于其他蛋白质氨基酸，几十年来它们一直被认为是“非电活性”的[9][10][11][12][13]。人体血浆中的氨基酸浓度通常在微摩尔范围内[10]。某些遗传性代谢疾病，如苯丙酮尿症、酪氨酸血症和高甘氨酸血症，会改变体内的氨基酸水平。如今，评估生物介质（如血液、汗液、尿液和唾液）中的氨基酸水平为预防和治疗代谢性疾病（如糖尿病、肥胖和心血管疾病）以及传染病（包括病毒性疾病）、神经系统功能障碍和不孕症提供了新的方法[10]。鉴于氨基酸在营养、生物技术和临床方面的重大意义，大量研究致力于开发有效可靠的氨基酸分析方法[10]。氨基酸的分析信号不仅可用于检测和研究氨基酸本身，还可用于研究肽和蛋白质。为了改善电化学检测氨基酸的分析性能，测试了许多不同的电极表面改性剂，但直到最近，“可氧化”氨基酸的列表并未显著扩展[14][15]。目前仍然存在六种“可氧化”蛋白质氨基酸的刻板印象。然而，为了检测短链生物活性肽，所有蛋白质氨基酸的分析信号将非常有用。
最近，我们的团队在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中，使用裸碳纳米颗粒电极（SPE）和用普鲁士蓝（PB，六氰铁酸盐(II)，Fe?[Fe(CN)?]?）改性的电极，通过安培流式注射分析（FIA）证明了几乎所有蛋白质氨基酸（谷氨酸（Glu）除外）在0.95 V电位下的直接和电催化氧化[16]。除了游离氨基酸外，用PB改性碳纳米颗粒电极还显著提高了肽和蛋白质的检测灵敏度[16]。有趣的是，对于缺乏“电活性”Tyr-10残基的β-淀粉样肽（Aβ，例如Aβ(1–16)），PB表现出明显的催化效果，而含有Tyr-10的Aβ突变体则几乎没有PB的催化效果[17]。根据PB的研究结果，可以推测其他已知的或新型的氧化还原材料也可能具有催化氨基酸氧化的能力，特别是基于过渡金属离子的复合物。特别是镍-姜黄素复合物[18]、铜微纳米颗粒[19][20]和氧化银纳米颗粒[21]已被证明可以催化某些“非电活性”氨基酸的氧化。然而，除了PB[16]外，这些改性剂尚未针对所有蛋白质氨基酸进行全面测试。
本研究的目的是比较某些过渡金属（M）六氰铁酸盐(II)（MHCF，其中M为Fe(III)、Co(II)、Ni(II)或Cu(II)）对21种蛋白质氨基酸的氧化电催化活性。此前已证明MHCF可以催化一些有机和无机化合物的氧化[22][23][24][25][26][27][28][29][30][31]。据我们所知，尚未进行过关于MHCF（PB类似物）作为所有蛋白质氨基酸氧化反应电催化剂的全面研究。研究使用了通过电合成法改性的碳纳米颗粒电极，以及循环伏安法和安培流式注射分析方法。研究了背景电解质溶液（K-磷酸盐缓冲液，pH 5–9；HCl + KCl，pH 1或3）的pH值和分析物浓度对氨基酸分析信号的影响。为了更深入地了解所研究的SPE/MHCF传感器的行为，还拍摄了改性电极表面的扫描电子显微镜（SEM）图像。
节选 试剂 L-氨基酸混合物（分析纯度，目录编号LAA21）和L-二肽Pro-Gly（目录编号P0880）购自默克公司（德国，
https://www.sigmaaldrich.com ）。无机盐，特别是KH?PO?、K?HPO?、K?[Fe(CN)?]、KCl、NiCl?·6H?O、CoCl?·6H?O、FeCl?·6H?O和CuCl?·2H?O，从默克公司（德国）、Reachim（俄罗斯）或Chimmed（俄罗斯）购买，纯度最高，按收到状态使用。所有溶液均使用去离子水（18 MΩ）制备。
用金属六氰铁酸盐改性的电极对氨基酸进行循环伏安分析 研究了MHCF（其中M为Fe(III)、Co(II)或Cu(II)）对氨基酸的催化活性。图1展示了在裸碳纳米颗粒电极和四种类型MHCF改性的电极上，1 mM Cys的代表性阳极循环伏安图（扫描速率，5 mV/s），分别为SPE/FeHCF（磷酸盐缓冲液，pH 6.0，图A）、SPE/CoHCF（磷酸盐缓冲液，pH 6.0，图B）、SPE/NiHCF（磷酸盐缓冲液，pH 6.0，图C）和SPE/CuHCF（0.001 M
结论 总结来说，证明了各种MHCF对蛋白质氨基酸电催化氧化的催化效果。pH值对MHCF的稳定性和氨基酸的分析信号有显著影响。CuHCF仅在强酸性环境（pH 1–3）下稳定；PB仅在酸性介质（pH 1–6）下稳定；CoHCF和NiHCF在较宽的pH范围内（pH 1–9）稳定。在大多数情况下，CoHCF在中性和碱性pH下催化氨基酸氧化的能力优于NiHCF
CRediT作者贡献声明 康斯坦丁·V·比比克： 可视化、验证、方法学、研究。埃琳娜·V·苏普伦： 撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、方法学、研究、数据管理、概念化。亚历山大·S·布兹拉科夫： 验证、研究。塔蒂亚娜·D·罗曼佐娃： 验证、研究。安娜·S·安德烈耶娃： 可视化、研究。达里亚·V·沃赫米亚尼娜： 验证、研究。阿尔卡季·A·卡里亚金： 撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿
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