使用UHPLC-MS/MS方法研究拟除虫菊酯类和苯胺吡啶类农药在红葡萄酒和白葡萄酒中的稳定性

《Journal of Food Composition and Analysis》：Stability of pyrethroid and anilinopyrimidines pesticides in red and white wines using UHPLC-MS/MS

　　安娜·保拉·费雷拉·德·奥利维拉（Ana Paula Ferreira de Oliveira）|玛丽亚·卢伊莎·费雷拉·多斯·桑托斯（Maria Luiza Ferreira dos Santos）|若泽·阿伊尔顿·贡萨尔维斯（José Ailton Gon?alves）|若泽·爱德华多·贡萨尔维斯（José Eduardo Gon?alves）|伊莎贝拉·科斯塔·塞萨尔（Isabela Costa César）
巴西米纳斯吉拉斯联邦大学药学院制药产品系，总统安东尼奥·卡洛斯大道6627号，贝洛奥里藏特，MG州，邮编31270-901

**摘要**
在全球化的市场中，为了确保产品质量，葡萄种植中普遍使用农药来防止寄生虫侵害，因此葡萄酒中经常检测到农药残留。为此，本研究开发了一种UHPLC-MS/MS方法，用于分析拟除虫菊酯类（联苯菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯）和苯胺嘧啶类（氰丙啶和嘧菌酯）农药在葡萄酒中的含量。这些农药通过液-液萃取法进行提取，并应用该验证方法对红葡萄酒和白葡萄酒中的农药稳定性进行了为期360天的研究。结果表明，拟除虫菊酯类农药的稳定性较低，尤其是在冷藏条件下储存时更为明显，这可能与低温下的沉淀作用及酯键水解有关。而苯胺嘧啶类农药的降解程度较低，表现出更好的稳定性。本研究的主要贡献在于开发了一种新的UHPLC-MS/MS方法用于葡萄酒中的农药分析；此外，这些结果有助于评估消费者的暴露风险，因为农药的减少对消费者健康具有积极意义。

**1. 引言**
葡萄种植在许多国家具有重要的社会经济和文化意义。欧盟是全球葡萄酒生产的领导者，其葡萄园覆盖了广阔的区域并适应多种气候条件。为了保证葡萄酒的质量，控制和管理葡萄园中的病虫害至关重要，因为葡萄容易受到多种寄生虫的侵袭（Marinho等人，2020年）。真菌病害是影响葡萄质量和产量的主要问题，尤其是在所有成熟阶段，由不同种类的真菌引起。为了解决这一问题，生产者使用了多种农药，其中杀菌剂占使用量的96%（Marinho等人，2020年；Syrgabek和Alimzhanova，2022年）。Syrgabek和Alimzhanova（2022年）研究了用于控制葡萄病虫害的主要农药。环境因素（如光照、温度和湿度）对农药的行为有显著影响。拟除虫菊酯类农药被广泛使用，苯胺嘧啶类农药也是常用品种（图1）。拟除虫菊酯类农药占葡萄种植中使用的农药总量的11%（Syrgabek和Alimzhanova，2022年）。联苯菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯可能含有从除虫菊中提取的天然成分或其合成衍生物，这些农药的最大残留限量（MRL）分别为0.3 mg/kg、0.5 mg/kg和0.08 mg/kg（Matsuo，2019年；FAO，2024年）。苯胺嘧啶类杀菌剂通过抑制氨基酸合成发挥作用（Mosbach等人，2017年）。嘧菌酯和氰丙啶是这类农药中最常用的两种。目前，它们在葡萄园中的最大残留限量分别为6.0 mg/kg和3.0 mg/kg（Castro等人，2020年；FAO，2024年）。

农药可能存在于加工产品中，如葡萄汁和葡萄酒，因为它们能够在果实生长过程中渗透植物组织，并在收获后仍然存在于葡萄中，并能耐受发酵过程（Patil等人，2009年；Wang和Cheung，2016年）。这些物质还可能抑制发酵过程，影响葡萄酒的感官品质，并对消费者健康构成风险（He等人，2019年）。事实上，农药的广泛使用引发了人们对环境破坏及其对人体潜在或已知毒性的担忧（Liviz等人，2025年）。Santana-Mayor等人（2020年）分析了来自西班牙的84款红葡萄酒，发现仅有3.6%的样本完全不含农药；91.7%的样本中存在多种农药残留，其中58.3%的样本中含有超过六种农药残留。最常见的农药包括戊唑醇、博斯卡利德、代森锰锌、异丙菌胺、二甲四氯、噻吩酰胺和嘧菌酯。Kosma等人（2021年）使用基于QuEChERS萃取和LC-MS/MS的多残留方法分析了希腊市场上的葡萄酒样本，结果发现其中含有两种杀菌剂（氰丙啶和代森锰锌）。He等人（2019年）分析了64款葡萄酒样本，检测到6种霉菌毒素和24种农药残留，其中赭曲霉毒素A和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检出率分别为42.19%和53.13%。在某些研究中，虽然某些农药的浓度低于最大残留限量，但作者强调需要监测葡萄酒中的农药残留，以评估消费者的每日摄入量和相关健康风险。

各国允许在葡萄园使用的农药清单及其最大允许限量各不相同。在国际层面，联合国粮食及农业组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）致力于制定每种农药的可接受每日摄入量（ADI）和最大残留限量（MRL）。尽管许多国家遵循这些指南，但实现全球统一仍是一个持续的过程（联合国粮食及农业组织FAO，2024年）。然而，全球化的葡萄酒市场要求对农药进行检测和监测，以确保食品安全并降低对消费者的健康风险（Moeder等人，2012年）。在这种情况下，开发具有高样本通量、适中成本和低定量限的分析方法变得至关重要（Castro等人，2018年）。同时使用多种农药的情况较多，因此需要通过开发多残留方法在单次分析中检测多种化合物（Pelaji?等人，2016年）。此外，许多食品样本在分析前需要预处理，因为污染物浓度较低且基质较为复杂。此外，由于监管机构要求的检测限较低，高效的样品制备、痕量识别和检测是分析方法的重要参数（Picó等人，2007年）。虽然有多种方法可用于检测葡萄酒中的农药，但关于其在葡萄酒中的稳定性的信息却很少。评估消费者暴露风险并确保食品安全至关重要。缺乏关于葡萄酒中污染物残留的稳定性研究凸显了开发敏感且选择性的分析方法的重要性，以便定量检测农药并评估其在葡萄酒中的稳定性。本研究量化并评估了红葡萄酒和白葡萄酒中拟除虫菊酯类和苯胺嘧啶类农药的稳定性。开发了一种新的UHPLC-MS/MS方法用于葡萄酒中的农药分析，该验证方法被应用于在不同条件下储存的葡萄酒样本分析中。

**2. 材料与方法**
2.1. 化学品和试剂
α-氰戊菊酯（CAS 67375-30-8；纯度98.70%）、β-氰戊菊酯（CAS 1224510-29-5；纯度99.80%）、联苯菊酯（CAS 82657-04-3；纯度99.20%）、氰丙啶（CAS 121552-61-2；纯度99.19%）、溴氰菊酯（CAS 52918-63-5；纯度99.40%）和嘧菌酯（CAS 53112-28-0；纯度99.21%）参考标准品购自Dr. Ehrenstorfer GmbH（德国奥格斯堡）。甲醇（CAS 67-56-1；纯度>99.9%）和乙腈（CAS 75-05-8；纯度>99.9%）为HPLC级，购自Tedia（美国俄亥俄州费尔菲尔德）。超纯水由Millipore系统（美国马萨诸塞州贝德福德）提供。其他所有化学品均为分析级：乙酸铵（CAS 631-61-8；纯度>97.0%）、甲酸（CAS 64-18-6；纯度>95.0%）、二氯甲烷（CAS 75-09-2；纯度>99.5%）和无水硫酸钠（CAS 7757-82-6；纯度>99.0%）。有机红葡萄酒来自Da Casa Garibaldi（巴西南里奥格兰德州加里巴尔迪），有机白葡萄酒来自Jorge Mariani（巴西南里奥格兰德州加里巴尔迪）。

2.2. 色谱条件
UHPLC-MS/MS分析使用的是Shimadzu色谱系统（日本京都）和AB SCIEX? QTRAP 4000质谱仪（美国马萨诸塞州弗拉明汉姆），配备电喷雾模式的Turbo Ionspray源。分离使用的是Shimadzu（日本京都）的Shim-pack XR-ODS II柱（100 × 2.0 mm，2.2 μm），温度为60°C。流动相由含有0.1%甲酸的10 mM乙酸铵缓冲液（A）和甲醇（B）组成，流速为0.5 mL/min。采用线性梯度洗脱程序：0分钟时100%甲醇（溶剂B），0至7分钟时50-80%甲醇（B），7至11分钟时80%甲醇（B），11至13分钟时80-50%甲醇（B）。进样量为9 μL。质谱检测采用正离子化模式的电喷雾离子源。氮气同时用作雾化气和脱溶剂气。离子源参数如下：毛细管电压5.5 kV，探针温度500°C，帘幕气压力20 psi，雾化器气体压力30 psi，碰撞气体压力8 psi。MRM数据由质谱仪收集，各分析物的参数见表1。

**表1. 用于五种农药分析的UHPLC-MS/MS方法的色谱和质谱参数**
| 农药 | 拴留时间（分钟） | 定量转换（T1）（m/z） | 合格转换（T2）（m/z） | DP（V） | CE（V） | CXP（V） |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| 联苯菊酯 | 9.5 | 40.10 - 18 | 1.20 | 44 | 0.10 - 18 | 1.20 | 44 |
| | 59 | 1.20 | 46 | 0.10 - 16 | 6.20 | 46 |
| | 19 | (T1) | 59 | (T2) | 10 | 10 |
| 氰戊菊酯 | 8.2 | 33.10 - 19 | 0.90 | 43 | 3.10 - 19 | 9.90 | 43 |
| | 10 | (T1) | 36 | (T2) | 21 | 16 | 16 |
| | 18 | (T1) | 21 | (T2) | 18 | 18 |
| 氰丙啶 | 4.8 | 26.10 - 92.90 | 22 | 6.10 - 92.90 | 81 | 45 | (T1) | 63 |
| | 14 | (T1) | 51 | (T2) | 34 | 23 |
| 溴氰菊酯 | 8.3 | 22.90 - 28 | 0.70 | 52 | 22 | 9.40 | 51 |
| | (T1) | 23 | (T2) | 51 | 23 | (T2) | 51 |
| 嘧菌酯 | 3.0 | 200.19 - 106.90 | 200.19 - 82.00 | 96 | (T1) | 81 |
| | 33 | (T1) | 35 | (T2) | 10 | 10 | (T2) |
| | 8 | (T1) | 8 | (T2) | DP - 去聚势；CE – 碰撞能量；CXP - 碰撞池出口电位 |

2.3. 样品制备
每种农药的储备溶液在乙腈中的浓度为1000至2000 μg/mL，然后用相同溶剂稀释成工作溶液，浓度为100 μg/mL。这些工作溶液用于添加到有机红葡萄酒和白葡萄酒样品中，使联苯菊酯、氰丙啶、溴氰菊酯和嘧菌酯的最终浓度达到0.1 μg/mL，α-氰戊菊酯和β-氰戊菊酯的最终浓度达到0.05 μg/mL。
测试了三种样品制备方法以提取葡萄酒中的农药：液-液萃取（LLE）、直接注入和微型分散固相萃取（d-SPE）。对于LLE，将5 mL的样品和5 mL的超纯水加入锥形管中，然后加入10 mL的二氯甲烷，以1500 rpm的速度涡旋2分钟；加入5 g无水硫酸钠，再次以1500 rpm的速度涡旋2分钟，随后以4000 rpm的速度离心10分钟。上清液转移至小瓶中并注入色谱系统。
直接注入法用于α-氰戊菊酯和β-氰戊菊酯的样品制备，包括样品的连续稀释后注入。具体步骤为：将5 mL的样品稀释在5 mL的超纯水中，涡旋1分钟后以4000 rpm的速度离心9分钟；取500 μL的上清液进一步用500 μL的乙腈:水（1:9）稀释后注入系统。另一种方法是d-SPE：将5 mL的样品稀释在5 mL的超纯水中，涡旋1分钟后以4000 rpm的速度离心9分钟；取500 μL的上清液用500 μL的乙腈:水（1:9）稀释后注入系统。
所有实验均重复三次，测定每种方法的回收率。

2.4. 方法验证
根据欧盟委员会2017年发布的关于食品和饲料中农药残留分析的质量控制及方法验证指南，对所开发的分析方法进行了验证。通过注入空白葡萄酒样本并与添加了农药的样本的色谱图进行比较，评估潜在的干扰峰（这些干扰峰的保留时间与目标农药相同）。该方法使用了两个质谱转换点，一个用于定量，另一个用于定性。
对于线性验证，将含有五种农药的标准工作溶液稀释到有机葡萄酒中，达到六个浓度水平：0.05；0.08；0.11；0.14；0.17；0.20 μg/mL。根据所研究农药的最大残留限量（MRL）确定工作范围，并绘制每个分析物的浓度与峰面积比值的校准曲线（重复三次）。如果校准标准在标称浓度的±20%范围内，使用普通最小二乘法（Ordinary Least Squares Method），则认为曲线是可接受的。精确度和准确度分别在0.05、0.15和0.20 μg/mL的浓度下进行了评估。通过分析每个浓度下的六个重复实验（n = 6）来评估实验内精确度和准确度，而实验间测定则在三次连续运行中进行（n = 18）。结果以相对标准偏差（RSD%）表示精确度，以回收率（R%）表示准确度。灵敏度是基于方法的检测限（LOD）和定量限（LOQ）来评估的，这些限值是根据信噪比（S/N）计算得出的。对于LOD，要求S/N ≥ 3；而对于LOQ，则要求S/N ≥ 10。

2.5 稳定性研究
为了进行稳定性研究，选择了三种代表拟除虫菊酯类的农药（氰戊菊酯、联苯菊酯和溴氰菊酯）和两种代表苯胺嘧啶类的农药（氰丙啶和嘧嘧菌胺）。将添加了农药的红色和白色葡萄酒样本储存在不同的条件下，以评估温度、光照和时间对农药稳定性的影响。每种红色和白色葡萄酒采用了以下储存条件：（1）冷藏（4 oC），在原始葡萄酒瓶中；（2）室温（23 oC），在原始葡萄酒瓶中；（3）室温（23 oC），在透明瓶中（表2）。在添加农药后立即以及在第45天、90天、135天、180天、225天、270天、315天和360天收集每个样本的等分样品（5 mL）。使用经过验证的UHPLC-LC/MS方法提取并分析样品，确定葡萄酒中每种农药的浓度。

表2. 五种农药在葡萄酒样本中的稳定性研究储存条件
| 样本类型 | 葡萄酒类型 | 储存条件 |
| --- | --- | --- |
| A1 | 红色 | 冷藏（4 oC），原始葡萄酒瓶 |
| A2 | 红色 | 室温（23 oC），原始葡萄酒瓶 |
| A3 | 红色 | 室温（23 oC），透明瓶 |
| B1 | 白色 | 冷藏（4 oC），原始葡萄酒瓶 |
| B2 | 白色 | 室温（23 oC），原始葡萄酒瓶 |
| B3 | 白色 | 室温（23 oC），透明瓶 |

2.6 统计分析
比较了稳定性研究样品中农药的浓度，涉及两种不同类型的葡萄酒（白色和红色）、三种不同的储存条件以及不同的时间点，最长至360天。通过重复测量方差分析（ANOVA；α = 0.05）进行统计分析，并对多重比较应用了Bonferroni校正。评估了每种农药的残差同方差性和正态性假设。

3 结果与讨论
3.1 方法开发
所开发的分析方法适用于五种分析农药的保留和分离。优化流动相洗脱梯度对于目标化合物的适当洗脱至关重要。此外，用甲酸酸化流动相对于确保适当的峰形和促进分析物在正离子模式下电离也很重要。因此，分析物的保留时间在3.0到9.5分钟之间（表1），总运行时间为12.0分钟。每种分析物都监测了两个产物离子，以实现定量和定性转换。定量转换基于强度最高的产物离子，以获得更高的分析方法灵敏度，而第二强度最高的峰则被选为定性转换。
已经有许多使用UHPLC-MS/MS的多残留方法用于食品样品中农药的测定。本研究开发的方法专注于拟除虫菊酯类和苯胺嘧啶类，这允许优化运行时间和检测参数，从而提高对五种目标分析物的灵敏度。在大多数多残留方法中，需要较长的运行时间才能充分洗脱样品中存在的所有农药（Wang和Cheung, 2016; Lee等人, 2018; Wen等人, 2026）。在本方法中，12分钟就足以获得高效的色谱运行，这有助于高通量常规分析。此外，仔细优化的色谱和检测参数使得五种分析农药的定量限达到了相当低的水平（0.010 μg/mL）。

3.2 样品制备的优化
最初，使用开发的UHPLC-MS/MS方法分析了用于研究的有机红色和白色葡萄酒，以验证五种目标农药的存在。作为对比，同时注射了添加了这些化合物（浓度为0.1 μg/mL）的葡萄酒样本。所有目标化合物的存在结果均为阴性。
先前的研究比较了有机葡萄酒和传统葡萄酒的成分，发现它们在多酚和黄酮类含量方面没有显著差异。此外，有机葡萄酒和传统葡萄酒在酚类谱型、抗氧化活性和元素组成上也相似（Garaguso和Nardini, 2015; Drava和Minganti, 2019; Gonzalez等人, 2021）。因此，有机葡萄酒可以被视为农药稳定性研究的合适空白基质，为分析测量提供清晰的背景，并最小化基质干扰。除了不含有农药外，有机葡萄酒还表现出与传统葡萄酒相似的物理化学特性。因此，有机葡萄酒可以有效地模拟传统葡萄酒的分析行为，适用于方法开发和验证以及样品分析。
最初使用的样品制备技术是液-液萃取。基于Ferrer等人（2011）的研究，还使用直接注射和d-SPE方法分析了添加了氰戊菊酯（浓度为0.10 μg/mL）的葡萄酒。这些分析的目的是评估一种简单易处理的程序的适用性，并将其结果与使用成熟的液-液萃取技术获得的结果进行比较。还评估了在分散固相萃取过程中添加PSA的效果，因为这一步可能有助于去除基质中的极性化合物，如有机酸、极性色素和糖类。PSA的机制涉及与含有羟基或羧基的化合物形成氢键（Anastassiades和Lehotay, 2003）。
使用液-液萃取、直接注射和d-SPE方法得到的氰戊菊酯的回收率分别为82.7%、64.6%和63.6%。尽管PSA具有报道中的优势，但在直接注射和d-SPE程序之间没有观察到显著差异。液-液萃取提供了更高的回收率和良好的重现性。尽管它更复杂且耗时较长，但由于其更好的回收结果，它被选为后续分析的方法。
LLE广泛用于从不同基质中提取农药。它使用多种萃取溶剂，可以提取不同极性的分析物。一些先前的研究描述了在食品样品中使用LLE提取农药，采用的溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、己烷和乙腈。然而，需要注意的是，LLE中使用有机溶剂会产生大量的危险废物，这与绿色化学的原则相悖（De Pinho等人, 2010; Wahab等人, 2022）。
众所周知，QuEChERS方法（快速、简单、便宜、有效、稳健且安全）常用于多种食品基质中的多农药分析样品制备（Moeder等人, 2012; Whang和Cheung, 2016）。QuEChERS方法通常能减少溶剂消耗并加快样品制备速度，使其比LLE更具成本效益和环保性。此外，这些方法非常适合复杂基质中的多残留分析，因为它们结合了萃取和净化步骤。另一方面，QuEChERS程序涉及更多的步骤，必须仔细优化才能获得高回收率和干净的提取物（He等人, 2019; Kosma等人, 2021; Yuan等人, 2023）。在本研究中，LLE方法是专门为葡萄酒中的拟除虫菊酯和苯胺嘧啶类农药开发的，提供了一种快速、选择性高且回收率高的程序。
值得一提的是，该方法没有使用内标，因为样品制备过程简单，涉及的步骤较少。然而，使用内标，特别是同位素标记的类似物，被广泛认为是提高LC–MS/MS方法性能的有效策略，可以通过校正基质效应、提高准确性和减少样品制备和仪器波动带来的变异来改善方法性能。然而，它们在多残留方法中的应用往往受到高成本和有限可用性的限制。在本研究中，即使没有使用内标，也实现了样品间的一致回收率和所有分析物的准确定量。
3.3 方法验证
该方法被证明是选择性的，因为在空白葡萄酒样品的色谱图中，在目标农药的相同保留时间没有观察到干扰峰。所有分析曲线显示浓度与分析信号之间存在线性关系，相关系数（R）≥ 0.98。所有反算的标准浓度与标称值的偏差都在20%以内，证明了该方法在0.05至0.20 μg/mL范围内的线性。本研究中获得的线性表明了令人满意的定量性能，与之前报道的葡萄酒中农药测定的分析方法一致（He等人, 2019; Kosma等人, 2021; Santana-Mayor等人, 2020; Yuan等人, 2023）。所有化合物观察到的线性行为表明该方法提供了分析物浓度与仪器响应之间的可靠比例关系。本方法的另一个优点在于反算浓度的评估，所有校准点都保持在标称值的±20%范围内。虽然一些研究主要依赖相关系数来证明线性，但当前的验证指南强调单个校准水平的准确性同样重要。此外，评估的线性范围（0.05–0.20 μg/mL）与农药残留分析中通常使用的浓度范围一致，证明了该方法适用于痕量水平的定量。
表3中展示了方法验证期间获得的相对标准偏差（RSD%）和回收率（R%）。RSD值低于20%，回收率在70%到120%之间，符合验证标准。高回收率表明使用优化的液-液萃取程序有效地从样品中提取了农药。与之前使用液-液萃取作为样品制备方法报告的结果相比，本研究中分析的农药回收率更高。Bedassa等人（2017）发现葡萄酒中农药的回收率在71%到101%之间，而Patil等人（2009）报告的值在47%到131%之间，某些情况下超过了推荐的上限。
3.4 稳定性研究
稳定性研究评估了农药在三种不同储存条件下白色和红色葡萄酒中的持久性，时间长达360天（表S1）。对于联苯菊酯，在所有储存条件下，红色葡萄酒样品中的浓度随时间显著下降（p < 0.05）。白色葡萄酒样品的浓度值略有下降，但没有统计学显著性。在室温下和在原始葡萄酒瓶中储存为联苯菊酯提供了更大的稳定性。Dor?evi?等人（2013）的研究评估了在不同条件下碾磨小麦中联苯菊酯的稳定性。观察到这种农药在23°C储存以及热处理过程中在样品中保持稳定。然而，由植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行的乳酸发酵导致样品中的联苯菊酯（bifenthrin）减少了多达42%。同样，本研究的结果也表明联苯菊酯在室温下具有更强的稳定性。氯氰菊酯（cypermethrin）的浓度在所有储存条件下随时间显著下降（p < 0.05），无论是红葡萄酒还是白葡萄酒样本。冷藏保存且使用原包装的红葡萄酒样本在研究期间显示出更高的氯氰菊酯降解率（81.6%）。总体而言，室温储存的样本中氯氰菊酯浓度略高，这表明冷藏可能加速了这种农药的降解。由于温度变化导致该化合物溶解度的改变可能是冷藏储存时葡萄酒中氯氰菊酯浓度降低的原因之一，因为较低的溶解度可能导致其沉淀。此外，这种农药极易发生水解反应，尤其是在酸性水环境中（Lin等人，2005年）。考虑到白葡萄酒的pH值在3.0到3.3之间，而红葡萄酒的pH值在3.3到3.5之间（Haseeb等人，2019年），氯氰菊酯的水解可能是本研究观察到的浓度降低的原因之一。分析显示，在所有条件下（p < 0.05），除室温下储存在透明瓶中的白葡萄酒样本外，溴氰菊酯（deltamethrin）的浓度随时间显著下降，其中冷藏保存且使用原包装的红葡萄酒样本的浓度下降幅度最大（61.4%）。总体而言，与联苯菊酯的结果类似，白葡萄酒中的溴氰菊酯浓度稳定性更好。与氯氰菊酯的情况一样，冷藏储存的样本显示出更强的降解趋势。Jiménez等人（2007年）评估了四种杀螨剂（包括溴氰菊酯）在葡萄酒酿造过程中的持久性和降解情况，发现拟除虫菊酯类农药（fenvalerate和deltamethrin）在葡萄酒中无法持久存在，且澄清过程减少了最终葡萄酒中检测到的农药及相关化合物的量。Radford等人（2018年）研究了有机磷和拟除虫菊酯类农药在纯净水、白葡萄汁和红葡萄酒中的降解情况，这些饮料中添加了包括溴氰菊酯在内的七种农药，并在2.5°C下储存15天后进行了检测。七种农药中有五种在所有基质中均显示出统计学上的显著损失，橙汁除外。可能解释农药损失的机制包括降解、挥发和吸附到玻璃储存容器壁上。根据Radford等人（2018年）的研究，由于样品是在2.5°C下储存的，挥发不是导致有机磷和拟除虫菊酯损失的原因。此外，对储存瓶子玻璃表面的吸附作用也被认为可以忽略不计。因此，化学降解是农药随时间损失的主要机制，主要是通过水解作用。在分析cyprodinil时，所有样品和储存条件下的其浓度均未出现显著下降（p > 0.05）。室温储存和使用原包装储存使得这种农药在白葡萄酒和红葡萄酒样本中更加稳定。我们的结果与Marin等人（2003年）的研究结果相反，他们评估了cyprodinil在生菜和葡萄中的稳定性，发现其在室温下21天后浓度显著下降，而在冷藏条件下仍保持在可检测水平。对于pyrimethanil的研究结果显示，这种农药在分析样本中具有良好的稳定性。只有室温下储存在透明瓶中的红葡萄酒样本显示其浓度随时间显著下降（p < 0.05）。与其他农药类似，冷藏储存的样本中也观察到了pyrimethanil浓度下降的趋势。Vanni等人（2006年）的研究评估了pyrimethanil在土壤样本中的降解情况，发现这种农药在光照条件下容易降解。这一先前的研究与我们的发现一致，即储存在透明瓶中的葡萄酒中pyrimethanil的降解更为严重。总体而言，拟除虫菊酯类农药（联苯菊酯、氯氰菊酯和溴氰菊酯）的稳定性较低，尤其是在冷藏条件下。如前所述，这一现象可能与低温下农药在葡萄酒中的沉淀有关。此外，拟除虫菊酯的化学结构中含有酯键（图1），这种键极易发生水解，特别是在葡萄酒的酸性环境下。苯胺嘧啶类农药（cyprodinil和pyrimethanil）在360天后没有表现出高降解水平，显示出比其他拟除虫菊酯更高的稳定性。在葡萄酒中检测这些农药变得至关重要，因为先前的研究表明，pyrimethanil从葡萄转移到葡萄酒中的量超过90%，而cyprodinil的转移率在1%到20%之间（Castro等人，2020年）。葡萄上的农药残留及其在葡萄酒中的持久性取决于多种因素，如葡萄品种、使用的农药浓度以及最后一次喷洒到收获的时间间隔。此外，农药的化学性质及其对化学或酶促降解的敏感性也是重要因素。葡萄中的农药残留可以转移到葡萄汁中，并影响酵母菌株的选择和生长。这些酵母还可以通过降低农药浓度或在发酵结束时以沉淀物形式吸附农药来影响葡萄酒中的农药含量（Caboni和Cabras，2010年；?u?等人，2010年）。对于消费者而言，葡萄酒中农药浓度随时间的降低是有益的，因为这减少了最初施用于葡萄园的农药量。然而，也有必要研究农药降解产生的代谢物的相对毒性。

**结论**
本研究成功开发并验证了一种快速、灵敏且可靠的UHPLC–MS/MS方法，用于检测红葡萄酒和白葡萄酒中的拟除虫菊酯类和苯胺嘧啶类农药，这是本研究的主要贡献。该方法的分析性能满足了所有验证标准，包括适当的选择性、线性、精度（RSD < 20%）和准确性（回收率在70%到120%之间），符合既定指南。低检测限（0.003 μg/mL）和定量限（0.010 μg/mL），加上较短的分析时间（12分钟），凸显了该方法的高灵敏度和高通量，使其适用于复杂葡萄酒基质中的常规多残留分析。稳定性研究表明，拟除虫菊酯类农药（联苯菊酯、氯氰菊酯和溴氰菊酯）随时间显著降解，尤其是在冷藏条件下，而苯胺嘧啶类农药（cyprodinil和pyrimethanil）相对稳定。这些发现强调了化学类别和储存条件对农药在葡萄酒中持久性的强烈影响。从实际角度来看，结果强调了持续监测葡萄酒中农药残留的重要性，不仅在生产时，而且在储存期间也是如此。经过验证的方法被证明是支持食品安全、法规合规性和葡萄酒行业质量控制的可靠工具。

**未引用的参考文献**
(Valera-Tarifa等人，2020年；Zhan等人，2020年)

**作者贡献声明**
Cesar Isabela Costa：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金获取、概念构思。
José Eduardo Gon?alves：撰写、审稿与编辑、项目监督、项目管理、概念构思。
José Ailton Gon?alves：验证、方法学研究、数据分析。
Maria Luiza Ferreira dos Santos：撰写初稿、验证、数据分析。
Ana Paula Ferreira de Oliveira：撰写初稿、验证、方法学研究、数据分析。