来自葱属植物Allium macrostemon Bunge的Macrostemonoside T通过调节PKA/CREB/BDNF通路，缓解了慢性应激性溃疡（CUMS）小鼠的抑郁样行为

《Journal of Functional Foods》：Macrostemonoside T from Allium macrostemon Bunge alleviates depressive-like behaviors in CUMS mice by modulating the PKA/CREB/BDNF pathway

　　魏星丁|李明泽|刘龙|张丽军|李红燕|董瑞|李伟|张静|王璐璐
吉林农业大学中药资源学院，长春130118，中国

**摘要**
本研究评估了从葱属植物Allium macrostemon Bunge中分离得到的新型螺甾烷皂苷Macrostemonoside T（MST）的抗抑郁作用。通过慢性不可预测轻度应激（CUMS）诱导的小鼠抑郁模型以及皮质醇（CORT）诱导的HT22海马神经元损伤模型进行了实验。雄性和雌性昆明鼠被随机分配到对照组、模型组、MST高剂量组（10 mg/kg/天，口服）、MST低剂量组（5 mg/kg/天）和MST与PKA抑制剂H-89联合组（0.5 mg/kg/天，腹腔注射）。经过6周的CUMS处理后，进行了行为测试（蔗糖偏好、开放场试验、高架十字迷宫试验、尾部悬吊试验、强迫游泳试验），并进行了海马单胺类物质（5-HT、DA、NE）、氧化应激标志物（SOD、CAT、GSH-Px、MDA）的生化分析，以及PKA/CREB/BDNF通路蛋白的Western blot检测。同时，在CORT处理前，HT22细胞被预先用MST（1或5 μM）处理，以评估细胞活力、ROS水平、凋亡情况（Hoechst 33258，流式细胞术）和通路蛋白表达。结果表明，MST剂量依赖性地改善了CUMS诱导的抑郁样行为和神经元损伤，恢复了单胺类物质和氧化还原平衡，并在体内和体外上调了PRKACA、p-CREB和BDNF的水平。H-89的联合使用显著阻断了MST的行为和分子效应，表明其作用依赖于PKA通路。这些结果证明，MST通过调节PKA/CREB/BDNF通路、减少氧化应激和凋亡以及恢复单胺类物质传递，表现出多模式的抗抑郁活性，为其作为预防抑郁症的功能性成分提供了依据。

**1. 引言**
重度抑郁症（MDD）是一种慢性且反复发作的精神疾病，具有生命威胁性，全球约有3亿人受到影响，已成为导致精神健康障碍的主要因素，给全球公共卫生系统带来了巨大负担。临床上，MDD表现为持续的低落情绪、认知障碍、快感缺失、无价值感和社交退缩等症状。严重病例常伴有自杀念头。尽管几十年来单胺假说主导了抑郁症的病理生理学研究，但目前的一线治疗方法（如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂SSRIs）存在起效延迟（2–4周）、持续不良反应和缓解率不高的问题（Deussing & Arzt, 2018; Licinio & Wong, 2005）。因此，亟需开发更安全、更有效的抗抑郁疗法。

近年来，人们对天然可食用产品越来越感兴趣，因为它们具有较好的临床疗效和较少的副作用。Allium macrostemon Bunge是一种属于石蒜科葱属的多年生草本植物，在中国民间烹饪中广泛使用，以其独特的辛辣气味而闻名。在传统中医中，其地下鳞茎被用作重要的草药，具有显著的膳食和药用价值（Commission, 2020; Wu, Li, et al., 2023）。研究表明，从AMB中提取的甾体皂苷具有多种生物活性，包括抗血小板聚集（Chen et al., 2010）、降脂作用（Xie et al., 2008; Zhou et al., 2007）、心肌保护作用（Wu et al., 2024）和抗抑郁作用（Zhao et al., 2022）。我们的研究团队从这种传统药用植物中分离出了新型螺甾烷皂苷MST。最新研究表明，MST具有显著的抗氧化能力（清除DPPH、ABTS和O??·自由基），并对海马神经元中的谷氨酸诱导损伤具有神经保护作用（Ding, Sun, et al., 2025; Wu et al., 2024; Wu, Wang, et al., 2023）。此外，我们之前的研究已经证实了AMB总螺甾烷皂苷部分的抗抑郁活性（Ding, Wang, et al., 2025），但MST本身的具体抗抑郁机制尚待探索。

我们之前的研究通过网络药理学和体外实验探讨了葱属植物中总螺甾烷型皂苷的抗抑郁和神经保护作用机制，结果表明cAMP蛋白激酶A（PKA）可能是关键靶点，PKA/cAMP反应元件（CREB）/脑源性神经营养因子（BDNF）信号通路可能是相关通路。鉴于CREB和BDNF与抑郁发作密切相关，本研究分别使用CUMS和皮质醇（CORT）在体内模拟抑郁样行为和体外模拟神经元损伤，以验证MST的抗抑郁效果。本研究旨在为MST和AMB作为膳食补充剂和功能性食品的进一步开发和应用提供参考。

**2. 材料与方法**
2.1. **材料与试剂**
MST（化学式：spirostane-25(27)-en-2α,3β-diol-3-O-β-d-xylopyranosyl-(1 → 3)-β-d-glucopyranosyl-(1 → 4)-β-D-galactopyranoside，图1A）由我们的团队从Allium macrostemon Bunge中分离并纯化，纯度达到≥99.5%，通过HPLC验证。MST的分离和纯化方法已在之前的论文中详细描述（Wu, Wang, et al., 2023）。分析时，使用Agilent TC-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和蒸发光散射检测器（HPLC–ELSD）进行HPLC分析，温度设定为35°C，进样体积为20 μL，流速为0.8 mL·min?1。ELSD参数如下：蒸发温度90°C，气体流速2.0 L·min?1，增益值3。流动相由0.05%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）组成。洗脱梯度如下：0–5 min，5%–10% B；5–10 min，10%–15% B；10–13 min，15%–18% B；13–25 min，18%–21% B；25–40 min，21%–25.5% B；40–43 min，25.5%–26.5% B；43–45 min，26.5%–27% B；45–52 min，27%–27.5% B；52–55 min，27.5%–28% B；55–58 min，28% B；随后为70–78 min，30%–75% B；78–85 min，75%–85% B；85–90 min，85%–90% B；90–110 min，90% B。根据峰面积计算，MST的纯度约为99.56%（见附录A，补充数据，图S1）。

实验植物于2021年从长春中药店购买。吉林农业大学中药学院的张静教授鉴定其为葱属植物Allium macrostemon Bunge，并将凭证标本（20210971）保存在学校的中药标本馆中。主要试剂包括：RIPA裂解缓冲液、PMSF（100 mM）、通用蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（50×）和BCA蛋白测定试剂盒（增强型，Beyotime Biotechnology）；二甲基亚砜（DMSO，Solarbio Science & Technology Co., Ltd.，北京）；β-actin（兔抗鼠抗体）、PKA、CREB、BDNF、Bcl-2、BAX抗体和HRP标记的山羊抗兔IgG（H + L，Wanlei Biotechnology，沈阳）；5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）和多巴胺（DA）ELISA试剂盒（Jingmei Biotechnology，江苏）。其他材料包括：DAPI染料、PBS缓冲液和TBST缓冲液（Servicebio Biotechnology，武汉）；免疫荧光一抗（PRKACA、Bcl-2，UBPBio，深圳）；荧光二抗（Zhongshan Jinqiao Biotechnology，北京）；CCK-8测定试剂盒（Biosharp，合肥）；胎牛血清（FBS，Gibco，美国）；DMEM培养基和青霉素-链霉素混合物（Hyclone，美国）。生化检测试剂来自Solarbio（北京）：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂和Hoechst 33258荧光染料。

2.2. **动物与处理**
昆明鼠（雄雌各半，8周龄，体重23克）由Yisi Experimental Animal Technology Co., Ltd.提供（SCXK (Ji) 2023–0002，长春，中国）。所有动物实验均获得吉林农业大学动物伦理委员会的批准（批准号20230613005）。实验前，小鼠在控制条件下适应1周（25 ± 1.5°C，12小时光照/12小时黑暗周期），可自由摄取食物和水。

**实验1**：小鼠随机分为五组（每组10只）：对照组、模型组、MST高剂量组（10 mg/kg）、MST低剂量组（5 mg/kg）和氟西汀组（10 mg/kg）。分组前，小鼠接受了蔗糖适应训练。第1天提供两瓶1%蔗糖水，第2天提供一瓶1%蔗糖水和一瓶普通饮用水，第3天禁食和禁水24小时后，提供一瓶1%蔗糖水和一瓶普通饮用水，之后交换瓶子的位置并记录体重。蔗糖偏好率（%）计算公式为（蔗糖摄入量 / 总液体摄入量）× 100。

**实验2**：为了验证PKA抑制剂H-89的作用，小鼠分为四组（每组10只）：对照组、模型组、MST高剂量组（10 mg/kg）和MST高剂量+H-89组（0.5 mg/kg）。蔗糖适应训练过程与实验1相同。

**2.3. 模型建立**
CUMS模型基于先前方法（Guo et al., 2019）进行改良。应激因素包括笼子倾斜（45°，12小时）、24小时禁食、24小时禁水、足部电击（3次）、50 mL离心管束缚（2小时）、尾部夹紧（3分钟）、冰水游泳（10分钟）、新物体暴露、12小时夜间光照和潮湿垫料。每天随机施加四种应激因素，持续6周。建模后第1周起，对照组和模型组每天通过口服给予0.1 mL生理盐水/体重。MST低剂量组和高剂量组分别给予相应剂量的MST，H-89组每天通过腹腔注射给予0.1 mL H-89/体重。从CUMS第4周开始，氟西汀口服给药2周。模型成功通过监测体重、蔗糖偏好和行为测试来验证。

**2.4. 行为测试**
2.4.1. **蔗糖偏好测试（SPT）**
建模6周后，重复进行蔗糖偏好测试以计算各组的偏好率。

2.4.2. **开放场试验（OFT）**
使用50 × 50 × 50 cm的开放场 Arena评估运动活动和类似焦虑的行为，该Arena分为25个相等的小方格。小鼠置于中心适应后，使用Taimeng行为分析系统（成都，中国）记录5分钟内的总移动距离和中央区域停留时间。试验间用75%乙醇清洁Arena。

2.4.3. **高架十字迷宫试验（EPM）**
EPM装置包括一个中央平台（5 × 5 cm）、两个开放臂（30 × 5 cm）和两个封闭臂（30 × 5 cm，壁高10 cm）。小鼠放置在中央平台面向一个开放臂，自由探索5分钟，记录进入开放臂的次数和停留时间。试验间用75%乙醇消毒迷宫。

2.4.4. **尾部悬吊试验（TST）**
将小鼠尾巴尖端（距末端1 cm）用胶带固定在水平杆上，使其悬空15厘米。连接塑料管以防攀爬。记录6分钟测试最后4分钟的不动时间。

2.4.5. **强迫游泳试验（FST）**
TST后24小时，将小鼠单独放入装有10厘米深（25°C）水的圆柱形容器中浸泡6分钟。记录最后4分钟内小鼠的不动时间（头部保持在水面上且肢体几乎不动）。

2.5. **海马单胺类物质和氧化应激标志物的检测**
行为测试后，小鼠用戊巴比妥钠麻醉，打开每组小鼠的头骨，取出整个脑组织并提取海马。将海马组织与9倍体积的PBS缓冲液混合后离心（6000 r/min，20分钟），收集上清液。根据5-HT、NE和DA ELISA试剂盒的说明，使用全波长酶标记仪器（BMG LABTECH，奥芬堡，德国）测量这些物质的水平。海马组织同样与9倍体积的PBS缓冲液混合后离心（6000 r/min，20分钟），收集上清液，使用SOD、CAT、GSH-PX和MDA试剂盒严格按说明检测SOD、CAT、GSH-PX和MDA的水平。**HE染色和Nissl染色**
海马组织经4%戊二醛固定后，进行石蜡包埋、切片（4 μm），并用苏木精和伊红（H&E）染色。在显微镜（Leica TCS SP8，Solms，德国）下观察病理变化。切片在乙醇-氯仿（1:1）中浸泡过夜，然后通过分级乙醇脱水，并用结晶紫染色（37°C，10分钟）。冲洗并用二甲苯处理后，切片用中性树脂封片（Leica TCS SP8，Solms，德国）。使用ImageJ在显微镜成像下量化Nissl小体。

**HE和Nissl染色的定量分析**
从海马背侧选择每个动物的三个冠状切片。每组使用三只小鼠。根据解剖标志物识别CA1和CA3亚区。图像分析由一名对组别分配不知情的观察者完成。

**2.7. 细胞分组和处理**
HT22海马神经元（上海细胞库，中国科学院）在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养，温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。细胞分为对照组、CORT组（300 μM）、CORT + MST组（1 μM）和CORT + MST（5 μM）。MST预处理在CORT处理前24小时进行。

**2.8. 细胞活力测定**
使用CCK-8试剂测定细胞活力。HT22细胞以5×10^3个细胞/孔的密度接种在96孔板上，并允许其粘附24小时。CORT或MST处理24小时后，向每个孔中加入10 μL CCK-8试剂，然后在黑暗中孵育1小时。在450 nm处测量吸光度以确定细胞存活率。

**2.9. ROS检测**
使用荧光探针试剂盒定量细胞内活性氧（ROS）水平。细胞加载10 μM DCFH-DA并在37°C下黑暗中孵育20分钟。用PBS洗涤三次后，使用倒置荧光显微镜（Leica TCS SP8，Solms，德国）观察荧光。使用ImageJ软件分析荧光强度。

**2.10. Hoechst 33258染色**
为了评估表明细胞凋亡的核形态，细胞先用甲醇固定（15分钟），然后用Hoechst 33258（10 μM溶于PBS）在37°C的黑暗中染色10分钟。洗涤后，在荧光显微镜（Leica TCS SP8，Solms，德国）下观察细胞，以检测显示亮蓝色荧光的浓缩（凋亡）核。

**2.11. 流式细胞术分析凋亡**
根据制造商的方案，使用Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）双染色试剂盒评估凋亡率。处理后，收集HT22细胞，在37°C的黑暗中用5 μL Annexin V-FITC/PI染色15分钟，然后立即在FACS Calibur流式细胞仪（BD Biosciences，美国）上进行分析。

**2.12. 免疫荧光染色**
在24孔板中培养的HT22细胞先用4%戊二醛固定，然后用0.5% Triton X-100渗透，再用5%牛血清白蛋白封闭。随后在4°C下过夜孵育一夜与一抗（针对PRKACA、Bcl-2）。接着孵育Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗。用显微镜（Leica TCS SP8，Solms，德国）拍摄荧光图像。

**2.13. 西部印迹**
海马组织或细胞裂解液用冰冷的PBS洗涤后，加入RIPA缓冲液（含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂）匀浆，然后在冰上孵育30分钟。离心（12,000 rpm，30分钟，4°C），收集上清液。等量的蛋白质通过SDS-PAGE（8%或12%凝胶）分离，并电转移到PVDF膜上。膜在27°C下用5%无脂牛奶封闭1.5小时，然后用一抗在4°C下过夜孵育，随后用HRP标记的二抗在27°C下孵育1.5小时。使用化学发光（Tanon 5200系统）检测蛋白质条带，并用ImageJ软件进行密度定量分析。

**2.14. 分子对接**
从蛋白质数据库（www.pdb.org）检索PKA（PDB ID: 1APM）和CREB（PDB ID: 2D82）的晶体结构。使用AutoDock Tools 1.5.6去除配体和水分子后，构建蛋白质结构，并添加氢原子。使用ChemBioDraw 3D构建三维结构，转换为MOL2格式，再转换为PDBQT格式进行对接。使用AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接模拟。结果对接构象使用PyMOL和Discovery Studio 3.5进行可视化和分析。

**2.15. 统计分析**
数据以平均值±标准差表示。使用ImageJ分析染色图像。使用GraphPad Prism 9.0进行单因素方差分析（ANOVA）评估组间差异，并相应地绘制结果。统计显著性设定为P < 0.05。

**3. 结果**
**3.1. MST对CUMS小鼠体重变化的影响**
如图1B所示，在实验期间，对照组的体重显著增加。模型组的体重增长率明显低于对照组（P < 0.001）。然而，MST-L（5 mg/kg）、MST-H（10 mg/kg）和Flu组在不同程度上缓解了CUMS引起的体重下降（P < 0.05和P < 0.01）。

**3.2. MST对CUMS诱导的抑郁样行为的影响**
SPT结果显示，在CUMS建模前各组之间的蔗糖偏好基线无显著差异（图1C，P > 0.05）。建模后第6周，模型组的蔗糖偏好显著降低（图1D，P < 0.001），证实了抑郁模型的成功建立。氟西汀和MST-H（10 mg/kg）显著逆转了这种快感缺失（P < 0.01和P < 0.001），表明MST具有抗抑郁潜力。OFT数据显示，模型组在中区花费的时间更少，移动的距离更短（图1E-G，P < 0.001）。MST和氟西汀组显著改善了在中区的探索行为（P < 0.01和P < 0.01）。在EPM测试中，模型组的开放臂进入次数减少，开放臂停留时间缩短（图1H-J，P < 0.01和P < 0.01）。MST和氟西汀以剂量依赖的方式增强了开放臂的探索（P < 0.05，P < 0.01和P < 0.01）。TST和FST结果显示模型组的不动时间延长（图1K-L，P < 0.01和P < 0.01）。MST以剂量依赖的方式减少了不动时间（P < 0.05，P < 0.01和P < 0.01），其中MST-H的效果与氟西汀相当。值得注意的是，MST并未显著改变OFT中的总移动距离（见附录A，补充数据，图S2），这表明TST和FST中的不动时间减少不太可能是由于一般的运动刺激，而是反映了真正的抗抑郁效果。总体而言，这些发现表明MST在缓解CUMS引起的抑郁样和焦虑样表型方面有效。

**3.2.1. MST减轻海马神经元损伤并恢复Nissl小体水平**
海马切片的HE染色（图2A、C和D）显示对照组CA1和CA3区域的神经元密集排列且形态完整。相比之下，模型组表现出神经元丢失、排列紊乱和形态异常（例如，锥体或多边形改变）。MST和氟西汀组在神经元结构上显示出显著改善，包括有序排列、清晰的细胞膜、均匀的细胞质染色和减少的神经元损伤。

**3.2.2. MST对海马单胺神经递质水平的影响**
单胺神经递质的下调与抑郁样行为密切相关。如图3A-C所示，模型组的海马5-HT、DA和NE水平显著低于对照组（P < 0.01和P < 0.001）。Flu和MST处理组（低剂量和高剂量）有效逆转了这些异常。具体来说，Flu、MST-L和MST-H组的5-HT水平显著升高（P < 0.05和P < 0.001）。DA水平在Flu和MST-H组显著增加（P < 0.05和P < 0.001），而NE水平在所有处理组中都升高（P < 0.05和P < 0.001）。这些结果表明MST通过恢复海马单胺能稳态发挥抗抑郁作用。

**3.2.3. MST对抗氧化酶活性和MDA水平的影响**
图3D-F显示，模型组的SOD、CAT和GSH-Px活性显著低于对照组（P < 0.001）。MST和Flu处理以剂量依赖的方式恢复了这些抗氧化酶活性（P < 0.05，P < 0.01和P < 0.01）。相反，MDA水平——脂质过氧化的标志物——在模型组显著升高（图3G，P < 0.001）。MST（5 mg/kg和10 mg/kg）和Flu显著抑制了MDA的产生（P < 0.01和P < 0.01），表明MST能够减轻CUMS引起的氧化应激和海马神经元损伤。

**3.2.4. MST调节PKA/CREB/BDNF通路并减轻神经元凋亡**
配体与其受体之间的结合强度和相互作用模式对受体激活和随后的信号转导至关重要。我们研究了MST与PKA和CREB的相互作用，这两种蛋白质是PKA/CREB/BDNF通路的关键成分。结合能是配体-受体亲和力的直接指标，较低的（更负的）值表示更强的相互作用。结合能阈值
**3.2.5. PKA抑制剂拮抗MST的抗抑郁效果**
为了验证MST通过PKA/CREB/BDNF通路介导的抗抑郁机制，在CUMS建模期间，将PKA抑制剂H-89与MST-H（10 mg/kg）一起腹腔注射。如图5A所示，MST显著减轻了CUMS引起的体重下降（P < 0.01），而MST + H-89组的体重恢复减弱，生长率显著降低（P < 0.05）。行为测试（图5B-K）证实MST-H改善了蔗糖偏好、OFT中区活动（距离和持续时间）、EPM开放臂探索（进入次数和时间）以及TST/FST中的不动时间（P < 0.05，P < 0.01和P < 0.01）。然而，H-89的共同处理消除了这些改善（P < 0.05，P < 0.01和P < 0.01），表明PKA抑制阻断了MST的抗抑郁效果。PKA抑制剂H-89可以逆转MST诱导的BDNF上调和抗凋亡效应。与先前的研究结果一致，MST-H显著逆转了CUMS诱导的海马区PRKACA、CREB、p-CREB和BDNF蛋白水平的下降（P < 0.05、P < 0.01和P < 0.001）。与H-89联合使用H-89可以抑制这些效应（P < 0.05和P < 0.01）。此外，H-89增加了BAX/Bcl-2的比例（P < 0.001），表明MST的抗凋亡效应依赖于PKA（图6）。在OFT条件下，总行驶距离与对照组相比，ns P > 0.05。下载：下载高分辨率图片（1MB）；下载全尺寸图片。补充图S3：MST调节HT22细胞（n=3）中的PKA/CREB/BDNF通路。(A) PRKACA、CREB、p-CREB和BDNF蛋白表达的Western Blot分析。(B) PRKACA免疫荧光染色（绿色：PRKACA；蓝色：细胞核；放大倍数：400×和2000×）。(D-H) 相对蛋白表达水平的统计分析。ns P > 0.05，###P < 0.001 vs. 对照组；* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs. CORT组。CRediT作者贡献声明：丁伟星：撰写——原始草案、方法学、数据管理、概念构思。李明泽：方法学、数据管理。刘龙：方法学、概念构思。张丽军：方法学、概念构思。李红艳：方法学、概念构思。董瑞：方法学、概念构思。李伟：方法学、概念构思。张静：监督、资金获取。王璐璐：监督。伦理声明：所有动物实验均获得了吉林农业大学动物伦理委员会的批准（批准编号：20230613005）。