来自柑橘皮的γ-萜品烯能够增强线粒体的生物能量代谢，并保护神经元细胞免受谷氨酸引起的损伤

《Journal of Functional Foods》：γ-Terpinene from citrus peel enhances mitochondrial bioenergetics and protects neuronal cells from glutamate-induced injury

　　徐慕荣|蔡清毅|王胜阳
国立中兴大学林业系，台湾台中402

**摘要**
柑橘加工会产生大量的果皮残渣，这些残渣逐渐被视为生物活性化合物的可持续来源。柑橘果皮精油富含单萜类化合物，具有抗氧化和神经调节作用；然而，它们对神经元能量代谢和线粒体功能的影响仍不明确。谷氨酸是中枢神经系统中的主要兴奋性神经递质，而谷氨酸引起的线粒体功能障碍和氧化应激是导致神经退行性疾病的主要因素。本研究评估了柠檬（Citrus limon）、青柠（Citrus aurantifolia）、甜橙（Citrus sinensis）、 Ponkan（Citrus reticulata）和 Hirami 柠檬（Citrus reticulata var. depressa）的精油，重点关注 γ-萜品烯。利用谷氨酸诱导的 PC12 细胞毒性模型来评估 γ-萜品烯的神经保护作用，并阐明其潜在的药理机制。结果表明，谷氨酸暴露显著降低了细胞活力和线粒体功能，同时增加了氧化应激和细胞损伤。γ-萜品烯显著缓解了谷氨酸引起的细胞毒性，恢复了线粒体功能和 ATP 水平，并部分逆转了多巴胺和去甲肾上腺素的合成减少。从机制上看，γ-萜品烯激活了 AMPK-SIRT1-PGC-1α-TFAM 信号通路，促进了线粒体生物发生并改善了细胞能量代谢。值得注意的是，这是首次证明 γ-萜品烯在谷氨酸诱导的神经元应激下调节线粒体生物能量和神经递质稳态的研究。从功能性食品的角度来看，本研究强调了柑橘果皮衍生的单萜类化合物作为有前景的生物活性化合物，并为柑橘加工副产品的可持续利用提供了科学依据。

**1. 引言**
柑橘是全球重要的农作物，具有很高的经济价值。在台湾，它们是水果产业的重要组成部分，对区域产量和总经济价值都有显著贡献。然而，在榨汁和工业加工过程中，大约 50% 的果实生物质作为残渣被丢弃，包括果皮、种子和膜组织，其中果皮占最大比例（Nieto 等，2021；K. Sharma 等，2019）。这些残渣的不当处理不仅对环境造成挑战，还增加了废物管理成本。近年来，人们越来越关注将柑橘加工副产品转化为功能性成分的潜力。在这些副产品中，柑橘果皮作为一种高价值的农业残渣，在食品、制药、饲料添加剂、生物技术和农业领域具有潜在应用（Rezzadori 等，2012；Richa 等，2023；Zema 等，2018）。柑橘果皮含有丰富的生物活性化合物，包括黄酮类、酚酸和精油，具有抗氧化、抗炎、抗菌和代谢调节作用（Agarwal 等，2022；Li 等，2024；Yang & Park，2025）。因此，柑橘果皮精油作为潜在的功能性食品成分和天然生物活性来源引起了越来越多的关注。γ-萜品烯是柑橘精油中的主要单萜类化合物之一，表现出多种药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌、镇痛和抗癌作用（Acikgul 等，2024；de Oliveira Ramalho 等，2015；Silva 等，2025；Souza 等，2024）。尽管有这些发现，γ-萜品烯在细胞能量代谢和线粒体调节中的潜在作用仍大部分未被探索。越来越多的证据表明，线粒体功能障碍在氧化应激相关的细胞损伤和神经退行性疾病中起着核心作用。因此，识别能够稳定线粒体功能并维持细胞能量稳态的食品来源生物活性化合物已成为功能性食品科学的重要研究方向。

谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中的主要且最丰富的兴奋性神经递质（Shen，2013）。在生理条件下，谷氨酸介导神经元间的突触信号传递，在学习、记忆和突触可塑性中起关键作用。然而，突触间隙中谷氨酸的过度释放或积累导致细胞外浓度异常升高，可引发兴奋性毒性。这一病理过程会导致细胞内钙（Ca2+）流入过多，促进活性氧（ROS）的生成，并损害线粒体功能，最终激活凋亡途径，这种现象称为谷氨酸诱导的兴奋性毒性（Pereira & Oliveira，1997；Verma 等，2022）。谷氨酸兴奋性毒性被认为是阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病以及抑郁症等情绪障碍的关键病理机制（Cui 等，2024；McIntyre & Jain，2024；Wu 等，2025）。因此，抑制谷氨酸的过度释放或减轻谷氨酸诱导的兴奋性毒性已成为神经保护研究的核心焦点。

鉴于阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病以及抑郁症等情绪障碍的发病率不断增加，研究天然化合物作为神经保护剂已成为关键的研究方向。PC12 细胞来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，具有可逆的分化潜能和稳定的神经递质合成能力（Greene & Rein，1977）。由于这些类似神经元的特性，PC12 细胞被广泛用作研究神经元分化、神经毒性和神经保护的体外模型。特别是，谷氨酸诱导的 PC12 细胞损伤是一个公认的模型，用于模拟兴奋性神经元损伤，并已被广泛用于研究与神经退行性疾病相关的细胞反应（Xu 等，2025）。然而，应注意的是，PC12 细胞无法完全再现体内原代神经元或复杂的神经网络和神经元-胶质细胞相互作用。因此，虽然 PC12 细胞为机制研究提供了稳定且可重复的平台，但仍需要在其他神经元模型和体内系统中进一步验证。

本研究调查了从常见台湾柑橘果实（包括柠檬（Citrus limon）、青柠（Citrus aurantifolia）、甜橙（Citrus sinensis）、 Ponkan（Citrus reticulata）和 Hirami 柠檬（Citrus reticulata var. depressa）果皮中提取的精油。因此，本研究的目的是探讨柑橘衍生的 γ-萜品烯是否可以通过调节线粒体生物能量和能量代谢来保护神经元细胞，从而为柑橘果皮衍生生物活性化合物的功能潜力提供新的见解。

**2. 材料与方法**
2.1. 试剂和材料
RPMI 1640 培养基（cytiva，美国，AL30835576）、胎牛血清（Gibco，美国）、100 mM 丙酮酸钠（Corning，美国，25-000CI）、青霉素和链霉素（Gibco，美国，15140–122）、ATP 检测试剂盒-荧光（Cayman Chemical，美国）、多标签微孔板读取器（Hidex，芬兰）、微孔板分光光度计（BioTek，美国，μQuant）、DMSO（D2650，Sigma-Aldrich，德国）、涡旋混合器（Scientific Industries，美国，Vortex-Genie 2）、增强型细胞计数试剂盒 8（Elabscience，中国，E-CK-A362）、pierce RIPA 缓冲液（Thermo Fisher Scientific，美国）、蛋白酶抑制剂混合物（HC100–007，Goalbio，台湾）、磷酸酶抑制剂混合物（HC100–008，Goalbio，台湾）、牛血清白蛋白（Gibco，美国）、BioRad 蛋白质检测染料浓缩液（BioRad，美国）、5× 蛋白质样品染料（GM47-b，GeneMark，台湾）、PVDF 转移膜（Revvity，美国）、EZblocker（GenePure，台湾）、WesternBright? ECL（Advansta，美国）、8 孔板（80,841，ibidi，德国）、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（KTA4001，Abbkine，中国）、10% 中性磷酸盐缓冲福尔马林（Leica Surgipath，美国）、包埋介质（50,001 ibidi，德国）、姜黄素（R5010，≥99% HPLC，Sigma-Aldrich，德国）、H?DCF-DA（2,7-二氯荧光素二乙酸酯，D6883，Sigma-Aldrich，德国）、L-谷氨酸（G8415-100G，Sigma-Aldrich，美国）。

2.2. 柑橘精油提取
本研究中使用的柑橘果实包括柠檬（Citrus limon，CL）、青柠（Citrus aurantifolia，CA）、甜橙（Citrus sinensis，CS）和 Ponkan（Citrus reticulata，CR），这些果实购自新竹县农民协会的直销站。Hirami 柠檬（Citrus reticulata var. depressa，CD）于 2023 年从永新合作社获得。首先将果实榨汁，然后将包括果皮和膜组织在内的残渣切成小块并称重。接着通过水蒸馏法从果皮中提取精油。具体来说，将果皮材料放入蒸馏装置的圆底烧瓶中，加入 1–1.5 L 的蒸馏水以确保至少 90% 的材料被浸没，然后加热约 6 小时以获得精油。

2.3. 柑橘果皮精油的 GC–MS 分析
在水蒸馏得到的柑橘果皮精油中，按 1:1000 的比例加入 HPLC 级乙酸乙酯（EA）进行稀释，然后按照先前报道的方法（Wang 等，2025）进行 GC–MS 分析。使用配备 DB-5MS 非极性毛细管柱的气相色谱仪-质谱仪进行 GC–MS 分析。每个样品注入 1 μL。色谱条件如下：使用氦气作为载气，流速为 1 mL/min；初始炉温为 45°C，保持 3 分钟，然后以 3°C/min 的速率升温至 180°C，再以 10°C/min 的速率升温至 280°C，最后保持 3 分钟。质谱分析采用电子撞击（EI）电离方式，离子源温度设为 250°C，扫描范围为 50–600 m/z。在 EI 条件下，每种化合物根据其分子结构产生特征碎片离子，生成独特的质谱图。Kovats 指数（KI）根据保留时间计算，并与 NIST（美国国家标准与技术研究院）数据库中的文献值进行比较。使用 authentic 标准品对精油成分进行最终确认，以确保准确的化学鉴定。

2.4. 细胞培养
高度分化的 PC12 细胞购自 iCell Bioscience（iCell-r024，中国）。细胞在 RPMI 1640 培养基（Cytiva，美国，AL30835576）中培养，补充 10%（v/v）胎牛血清（FBS）、1%（v/v）青霉素-链霉素（Gibco，美国，15140–122）和 3.7 g/L 碳酸氢钠（NaHCO?）。细胞在 37°C、5% CO? 的湿润培养箱中培养。

2.5. 谷氨酸诱导的 PC12 细胞损伤和处理
谷氨酸诱导的 PC12 细胞损伤模型被广泛用于模拟与神经退行性疾病和情绪障碍相关的神经毒性机制，是评估药物或天然化合物神经保护效果的常用体外模型（Liu, Zhao 等，2017）。在本研究中，我们需要确定损伤模型的 L-谷氨酸浓度。

L-谷氨酸（G8415-100G，Sigma-Aldrich，美国）以 0.1 M 的储备浓度制备在培养基中。调整溶液 pH 至 7.2–7.4，然后使用涡旋混合器和超声波处理确保完全溶解。溶液通过 0.22 μm 注射器过滤器灭菌，并进一步用培养基稀释至所需的最终浓度。PC12 细胞分别用 5、10、15、20 和 25 mM 的 L-谷氨酸处理 24 小时，之后评估细胞活力。

对于神经保护实验，PC12 细胞以 2 × 10^4 个细胞/孔的密度接种在 96 孔板中。柑橘果皮精油及其主要成分溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。所有实验组中的最终 DMSO 浓度保持在 0.1%（v/v）。细胞用样品处理后，暴露于 10 mM L-谷氨酸 24 小时，然后评估细胞活力。

2.6. 细胞活力测定
使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8；WST-8）进行细胞活力测定，其中含有水溶性四唑盐 WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium，单钠盐]。在活细胞中，WST-8 被细胞脱氢酶还原生成橙色的甲臙染料。颜色强度通过 450 nm 处的吸光度测量，与活细胞数量成正比。细胞活力测定时，培养基替换为含有 1%（v/v）增强型细胞计数试剂盒-8 的新鲜培养基。细胞在 37°C 下培养 1 小时，然后使用微孔板分光光度计（μQuant，BioTek，美国）测量 450 nm 处的吸光度（Shu & Zhang，2019）。

2.7. ATP 测定
使用基于荧光的 ATP 测定方法（Liu, Liu 等，2017）测定 PC12 细胞内的 ATP 含量。根据制造商的说明，使用 ATP 检测试剂盒-荧光（Cayman Chemical，美国）进行 ATP 测定。荧光在 535 nm 处测量，使用多标签微孔板读取器（Hidex，芬兰）进行检测。ATP 浓度根据标准曲线计算，并以对照组（设为 100%）进行归一化。

2.8. 线粒体膜电位测定
使用 JC-1 染料 [5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide] 测定分化 PC12 细胞的线粒体功能，这是一种阳离子荧光探针，以膜电位依赖的方式在线粒体中积累。实验程序根据先前描述的方法（S. Sharma 等，2020）进行调整。使用 JC-1 线粒体膜电位测定试剂盒（Abbkine，中国；KTA4001）和制造商的协议进行线粒体膜电位评估。荧光成像使用带 40× 物镜的 upright 荧光显微镜（ECLIPSE Ci，Nikon，日本）进行。图像使用显微成像系统（SGHD-3.6，SAGE Vision，台湾）捕获，并通过 SG Image V2.3 软件（台湾）进行处理。荧光强度的定量和通道合并使用 ImageJ（美国国立卫生研究院）进行。

2.9. 细胞内活性氧（ROS）测定
使用荧光探针 2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（H?DCF-DA）测定 PC12 细胞内的活性氧（ROS）积累，根据先前报道的方法（Masaki 等，2009）进行了少量修改。对于细胞内 ROS 测定，先去除培养基，然后用 1× PBS 洗涤细胞两次。H?DCF-DA被溶解在PBS中，最终浓度为30 μM，然后加入每个孔中。在37°C的黑暗环境中孵育30分钟后，使用多标签微孔板读数器（Hidex，芬兰）在485/535 nm的激发/发射波长下测量荧光强度。ROS生成的百分比使用以下公式计算：ROS生成百分比 (%) = (处理组A485/535 / 对照组A485/535) × 100。

2.10. 过氧化丙二醛（MDA）测定
过氧化丙二醛（MDA）是脂质过氧化的主要终产物，常被用作氧化应激和细胞损伤的指标（Hosseini等人，2016年）。细胞内MDA水平使用脂质过氧化检测试剂盒（CheKine? Micro Lipid Peroxidation Assay Kit，Abbkine，美国）进行测定。简要来说，PC12细胞首先用25、50或100 μM的γ-terpinene处理，然后暴露于10 mM的L-谷氨酸24小时。随后收集细胞，进行裂解和离心，收集上清液进行分析。蛋白质浓度使用BCA测定法测定。根据试剂盒说明通过比色反应测量MDA水平，并记录532 nm和600 nm处的吸光度。校正后的吸光度值通过OD532-OD600计算得出，减去空白值后得到。MDA浓度随后使用以下公式计算：A = (OD532 - OD600) - ODblank。MDA浓度（nmol/mg蛋白质）= A × 51.6 / 蛋白质浓度（mg/mL）。

2.11. 乳酸脱氢酶（LDH）测定
乳酸脱氢酶（LDH）是一种细胞内代谢酶，当细胞膜受损时会释放到培养基中，因此被广泛用作细胞膜完整性和细胞毒性的指标（Xie等人，2023年）。在本研究中，使用Pierce LDH测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）基于比色偶联反应测量LDH活性。LDH催化乳酸氧化为丙酮酸，生成NADH，后者进一步还原INT形成红色甲花青。产生的甲花青量与LDH活性成正比。PC12细胞以每孔2 × 10^4个细胞的密度接种在96孔板中，先用25、50或100 μM的γ-terpinene预处理，然后暴露于10 mM的L-谷氨酸24小时。之后，将50 μL的培养上清液与50 μL的反应混合物混合，并在黑暗中孵育30分钟。使用ELISA读数器在490 nm（主波长）和680 nm（参考波长）测量吸光度，并计算相对LDH水平。使用以下公式计算：LDH相对含量 (%) = [(样品OD490 – 样品OD680) / (对照组OD490 – 对照组OD680)] × 100。

2.12. 神经递质分析
多巴胺（DA）和去甲肾上腺素（NE）是中枢神经系统中的关键神经递质，在情绪调节、应激反应和认知功能中起关键作用（Paredes-Rodriguez等人，2020年；Zhou等人，2023年）。DA和NE的浓度使用多巴胺ELISA试剂盒和去甲肾上腺素ELISA试剂盒（FineTest，中国）根据制造商的协议进行测定。简要来说，PC12细胞先用25、50或100 μM的γ-terpinene处理，然后暴露于10 mM的L-谷氨酸24小时。处理后，收集细胞培养上清液和裂解液。将标准品或样品加入预包被的96孔板中，随后依次与生物素标记的抗体和HRP-链霉亲和素溶液孵育。经过多次洗涤步骤后，加入TMB底物溶液进行显色反应，并用终止溶液终止反应。在450 nm处测量吸光度，并根据标准曲线确定DA和NE的浓度。结果以ng/mL表示。

2.13. 西部印迹（Western blot）分析
进行西部印迹分析以评估PC12细胞中与线粒体生物发生和紧密连接蛋白相关的表达，修改基于先前描述的方案（Gureev等人，2019年；Palabiyik & Palabiyik，2025年）。
对于蛋白质提取，细胞用冷PBS洗涤，刮下细胞并在添加了1%蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液（Pierce?，Thermo Fisher Scientific，美国）中裂解。裂解液在冰上孵育并间歇性涡旋，然后高速离心。收集上清液并储存在-80°C。使用BCA测定法确定蛋白质浓度，并调整至90 μg/mL。样品在95°C下变性5分钟，然后进行电泳。
蛋白质在12% SDS-PAGE凝胶上分离，并在300 mA的电压下转移到PVDF膜上（Revvity，美国）1小时。膜用TBST洗涤并在室温下用EZBlocker（GenePure，台湾）封闭90分钟。然后将膜在4°C下与针对以下抗原的一抗孵育过夜：TFAM（1:10,000；22,586–1-AP，Proteintech，中国），PGC-1α（1:10,000；66,369–1-lg，Proteintech，中国），AMPKα1（1:1000；07–350，Millipore Sigma，美国），p-AMPKα（1:1000；2535，Cell Signaling Technology，美国），SIRT1（1:1000；9475s，Cell Signaling Technology，美国），Nrf2（1:1000；12,721，Cell Signaling Technology，美国），β-actin（1:5000；SC-47778，Santa Cruz，英国）。
在一抗孵育后，膜用TBST洗涤，并与物种特异性的HRP结合的二抗孵育：山羊抗小鼠IgG（1:10,000；ARG65350，Arigo Biolaboratories，中国）或兔IgG（1:10,000；abs-22-200，Asia Bioscience，台湾）在室温下轻轻摇晃2小时。最后用TBST洗涤后，使用WesternBright? ECL底物（Advansta，美国）可视化免疫反应条带，并通过化学发光检测。

2.14. 统计分析
所有数据均以至少三次独立实验的平均值±标准差（SD）表示（n ≥ 3），除非另有说明。每个实验的确切n值在相应的图例中注明。统计分析使用GraphPad Prism 8.0软件（Dotmatics，美国）进行。两组之间的比较使用非配对t检验进行，而多组之间的比较使用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey的 honestly significant difference（HSD）事后检验。p值< 0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果
3.1. 柑橘皮精油的化学成分分析
为了表征柑橘皮精油的化学成分，本研究选择了台湾常见的五种柑橘水果：柠檬（Citrus limon，CL）、青柠（Citrus aurantifolia，CA）、甜橙（Citrus sinensis，CS）、 Ponkan（Citrus reticulata，CR）以及台湾特有物种hirami lemon（Citrus reticulata var. depressa，CD）。从果皮中提取精油并使用GC–MS进行分析。柑橘皮精油主要由单萜及其衍生物组成，包括d-柠檬烯、γ-terpinene和β-蒎烯，这些成分不仅赋予柑橘特有的香气，还具有抗氧化、抗炎和神经保护作用。通过GC–MS分析，并与NIST质量光谱库和真实标准品进行比对来鉴定化合物。图1显示了五种柑橘物种精油的代表性色谱图。
图1. 从五种柑橘皮中提取的精油的GC–MS色谱图。(A) 柠檬（CL），(B) 青柠（CA），(C) 甜橙（CS），(D) Ponkan（CR），(E) Hirami lemon（CD）。化合物：1, β-蒎烯；2, d-柠檬烯；3, γ-terpinene；4, α-萜品醇；5, α-香叶醇；6, β-蒎烯；8, 薄荷醇。
五种柑橘皮精油的详细成分见补充表1–5。在柠檬油（CL）中，主要成分是d-柠檬烯（70.60%）、γ-terpinene（6.24%）和α-萜品醇（5.47%）。青柠油（CA）的主要成分是d-柠檬烯（63.76%）、γ-terpinene（13.29%）和β-蒎烯（7.69%）。甜橙油（CS）主要由d-柠檬烯（95.98%）、β-蒎烯（1.26%）和薄荷醇（0.61%）组成。Ponkan油（CR）的主要成分是d-柠檬烯（96.43%）、薄荷醇（1.72%）和β-蒎烯（1.34%）。Hirami lemon油（CD）的主要成分是d-柠檬烯（47.62%）、γ-terpinene（28.79%）和薄荷醇（5.51%）。

3.2. 谷氨酸浓度对PC12细胞活力的影响
谷氨酸是中枢神经系统中的主要兴奋性神经递质，过量释放或细胞外水平升高可导致神经元损伤。为了确定后续实验的适当浓度，PC12细胞暴露于5、10、15、20和25 mM的谷氨酸中，并评估细胞活力。如图2所示，10 mM的谷氨酸处理使细胞活力降至约40–50%，提供了评估柑橘皮精油及其主要成分在谷氨酸诱导的细胞损伤模型中的保护效果的适当细胞毒性水平。

3.3. 柑橘皮精油及其主要成分在谷氨酸诱导的应激下对PC12细胞活力的影响
首先使用CCK-8测定法评估五种柑橘皮精油和姜黄素对PC12细胞的细胞毒性。先前的研究表明，姜黄素通过抑制ROS介导的凋亡途径保护PC12细胞免受谷氨酸引起的氧化损伤和线粒体功能障碍（Chang等人，2014年），因此在本研究中用作阳性对照。如图3A所示，用CD、CL、CR和CS的精油在12.5–100 μg/mL的浓度处理24小时后，与对照组相比，细胞活力没有显著差异，表明这些精油在测试浓度范围内对PC12细胞无毒。
图3. 不同浓度的柑橘皮精油及其主要成分对10 mM谷氨酸诱导的PC12细胞活力的影响。(A) 用柑橘皮精油处理的PC12细胞活力。(B) 用10 mM谷氨酸诱导的柑橘皮精油处理的PC12细胞活力。(C) 用d-柠檬烯、γ-terpinene和β-蒎烯处理的PC12细胞活力。(D) 用d-柠檬烯、γ-terpinene和β-蒎烯以及10 mM谷氨酸处理的PC12细胞活力。数据以三次独立实验的平均值±SD表示（n = 3）。使用单因素ANOVA后进行Tukey的HSD事后检验。###p < 0.001与对照组相比。**p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001与谷氨酸组相比。姜黄素用作阳性对照。
为了进一步评估柑橘皮精油在谷氨酸诱导的细胞毒性下的神经保护潜力，PC12细胞暴露于10 mM的谷氨酸。如图3B所示，10 mM的谷氨酸使细胞活力降至约50%，证实了神经毒性模型的建立。用不同的柑橘皮精油处理部分恢复了细胞活力。值得注意的是，100 μM的甜橙（CS）和50–100 μM的青柠（CA）显著恢复了细胞活力，其保护效果与阳性对照姜黄素相当，表明青柠皮精油具有更强的神经保护潜力。
进一步研究了青柠皮精油的主要成分d-柠檬烯、γ-terpinene和β-蒎烯。这些化合物在12.5–100 μM的浓度下均未表现出细胞毒性（图3C）。在谷氨酸应激下，50 μM的d-柠檬烯显著提高了细胞活力，而γ-terpinene在50 μM时显示出显著的保护作用，在100 μM时效果更明显（图3D），表明其在测试化合物中具有最高的神经保护潜力。
总体而言，青柠皮精油及其主要成分减轻了谷氨酸引起的PC12细胞损伤，其中γ-terpinene表现出最明显的保护作用，并被选为后续机制研究的对象。

3.4. γ-terpinene改善谷氨酸诱导的PC12细胞中的线粒体功能
线粒体膜电位（Δψm）是细胞能量代谢和活力的关键指标，与ATP合成密切相关。使用JC-1染色法评估γ-terpinene在10 mM谷氨酸诱导的PC12细胞损伤中对Δψm的影响。谷氨酸处理显著降低了红/绿荧光比值，表明线粒体功能障碍（图4A-B）。与γ-terpinene（25、50、100 μM）共处理部分恢复了线粒体膜电位（Δψm）。在中等和高剂量组（50和100 μM）观察到显著改善，而低剂量组（25 μM）与模型组相比没有统计学差异。这些结果表明主要在中等至高浓度范围内存在剂量相关效应。

图4. γ-terpinene对谷氨酸诱导的PC12细胞中线粒体膜电位和ATP产生的影响。(A) 通过JC-1染色评估的线粒体膜电位的代表性荧光图像。红色荧光表示JC-1聚集体（健康的线粒体），绿色荧光表示JC-1单体（去极化的线粒体）。细胞核用DAPI染色。图像使用40倍物镜的荧光显微镜捕获。(B) 基于红/绿荧光比值量化线粒体膜电位。(C) γ-terpinene处理后测量细胞内ATP水平。箭头指示不同组间JC-1红光和绿光信号差异的区域。数据以三次独立实验的平均值±SD表示（n = 4）。使用单因素ANOVA后进行Tukey的HSD事后检验。#p < 0.05，###p < 0.001与对照组相比；*p < 0.05，**p < 0.01与谷氨酸组相比。姜黄素被用作阳性对照。（关于此图例中颜色参考的解释，读者可以参考本文的网络版本。）ATP水平也进行了类似的评估，以检查γ-萜品烯对细胞能量产生的影响。谷氨酸暴露使细胞内ATP含量减少了50%，显示出能量代谢的显著受损（图4C）。γ-萜品烯（25–100 μM）处理剂量依赖性地增加了ATP水平，其中50和100 μM浓度达到了显著的增强效果。这些结果表明，γ-萜品烯有效缓解了谷氨酸引起的线粒体功能障碍和能量耗竭，从而对其神经保护作用有所贡献。

3.5. γ-萜品烯对PC12细胞氧化应激和细胞损伤的影响
活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）和乳酸脱氢酶（LDH）是氧化应激和细胞损伤的关键指标。为了评估γ-萜品烯对谷氨酸引起的氧化损伤的保护作用，在PC12细胞中测量了ROS、MDA和LDH的水平。谷氨酸显著增加了细胞内ROS水平，表明存在氧化应激，而γ-萜品烯（25, 50, 100 μM）剂量依赖性地减少了ROS的积累（图5A）。谷氨酸暴露还显著提高了LDH的释放，表明细胞膜完整性受损；然而，所有测试浓度的γ-萜品烯处理都显著减轻了LDH的泄漏（图5B）。一致地，γ-萜品烯降低了MDA含量，反映了脂质过氧化的减轻（图5C）。这些结果表明，γ-萜品烯有效减少了谷氨酸引起的氧化应激，抑制了脂质过氧化，并保持了膜完整性，表明其在该实验模型中的强抗氧化和神经保护作用。

下载：下载高分辨率图像（200KB）
下载：下载全尺寸图像
图5. γ-萜品烯在谷氨酸诱导的PC12细胞中的抗氧化能力。γ-萜品烯对（A）ROS、（B）LDH和（C）MDA在谷氨酸诱导的PC12细胞中的水平的影响。数据表示为三次独立实验的平均值±标准差（n = 3）。统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey's HSD事后检验。##p < 0.01，###p < 0.001与对照组相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001与谷氨酸组相比。姜黄素被用作阳性对照。

3.6. γ-萜品烯对PC12细胞中神经递质水平的影响
为了研究γ-萜品烯对神经传递的影响，在PC12细胞的上清液和细胞内部分测量了多巴胺（DA）和去甲肾上腺素（NE）的水平。谷氨酸显著降低了上清液（图6A）和细胞内（图6B）中的DA含量，而γ-萜品烯剂量依赖性地恢复了DA水平。同样，谷氨酸显著降低了上清液（图6C）和细胞内（图6D）中的NE水平，γ-萜品烯处理显著逆转了这些降低。这些结果表明，γ-萜品烯有效缓解了谷氨酸引起的DA和NE的耗竭，并支持其在PC12细胞中的合成和分泌功能的恢复。

下载：下载高分辨率图像（325KB）
下载：下载全尺寸图像
图6. γ-萜品烯在谷氨酸诱导的PC12细胞中的神经递质作用。γ-萜品烯对（A）上清液和（B）细胞内部分中的多巴胺水平，以及（C）上清液和（D）细胞内部分中的去甲肾上腺素水平的影响。数据表示为三次独立实验的平均值±标准差（n = 3）。统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey's HSD事后检验。#p < 0.05，##p < 0.01，###p < 0.001与对照组相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001与谷氨酸组相比。姜黄素被用作阳性对照。

3.7. γ-萜品烯在谷氨酸诱导的PC12细胞中改善线粒体生物发生
为了研究γ-萜品烯是否通过调节与线粒体功能相关的信号通路来缓解谷氨酸引起的细胞损伤，评估了包括SIRT1、PGC-1α、Nrf2、p-AMPK/AMPK和TFAM在内的关键调节蛋白的表达水平。与对照组相比，谷氨酸显著降低了SIRT1、p-AMPK/AMPK、PGC-1α和Nrf2的水平，而TFAM的水平基本保持不变（图7A-F）。γ-萜品烯剂量依赖性地恢复了SIRT1、p-AMPK/AMPK、PGC-1α和Nrf2的表达，其中100 μM的效应最为显著（图7B-D, F）。尽管TFAM的水平没有达到统计显著性，但观察到了增加的趋势（图7E）。这些发现表明，γ-萜品烯有效对抗了谷氨酸对线粒体生物发生和抗氧化防御关键蛋白的损伤，从而有助于神经元保护。

下载：下载高分辨率图像（444KB）
下载：下载全尺寸图像
图7. γ-萜品烯在谷氨酸诱导的PC12细胞中对线粒体生物发生蛋白表达的影响。（A）SIRT-1、PGC-1α、Nrf2、p-AMPK、AMPK和TFAM的Western blotting图像。（B）PC12细胞中（C）SIRT-1，（D）p-AMPK/AMPK，（E）PGC-1α，（F）Nrf2的相对蛋白表达水平。β-actin被用作蛋白质加载对照。数据表示为三次独立实验的平均值±标准差（n = 3）。统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey's HSD事后检验。#p < 0.05，###p < 0.001与对照组相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001与谷氨酸组相比。姜黄素被用作阳性对照。

4. 讨论
本研究使用谷氨酸诱导的PC12神经元损伤模型评估了来自常见栽培台湾柑橘皮精油的保护潜力，旨在确定关键活性成分并阐明其作用机制。柑橘皮是果汁加工后产生的大量农业废弃物；如果未得到适当利用，它们会增加环境负担并降低资源利用效率。从循环经济的角度来看，本研究整合了神经能量学和线粒体生物学，探索了柑橘皮精油的附加值潜力，突显了它们的工业和生物医学相关性。在测试的五种柑橘皮精油中，青柠（Citrus aurantifolia）皮油表现出最明显的保护作用。GC–MS分析显示其主要成分是d-柠檬烯、γ-萜品烯和β-蒎烯。尽管d-柠檬烯是柑橘油中最丰富的单萜，并具有已知的抗氧化和抗炎活性，但其支持ATP产生的能力有限，在高浓度下甚至可能阻碍能量代谢。相比之下，γ-萜品烯显著增强了细胞活力和ATP水平，表明其在线粒体能量调节方面具有明显优势，并确定其为青柠皮油的关键生物活性成分。这些发现表明，在复杂的天然精油系统中，功能效力不一定与最丰富的成分相关，而可能取决于特定的活性分子。谷氨酸是中枢神经系统中的主要兴奋性神经递质；其过量释放可引起兴奋毒性，这是与多种神经退行性疾病（包括帕金森病、阿尔茨海默病和中风后神经元损伤）的发病机制密切相关的（Cui et al., 2024; Wu et al., 2025）。
谷氨酸引起的神经毒性涉及Ca2+内流、线粒体功能障碍和能量代谢受损（Pereira & Oliveira, 1997; Verma et al., 2022）。在我们的研究中，10 mM的谷氨酸诱导的PC12细胞模型成功再现了这些病理特征，包括细胞活力降低、线粒体膜电位抑制、ATP水平下降和氧化应激增加。尽管这一浓度超过了生理水平，但基于我们的剂量-反应结果（图2），选择这一浓度是为了在PC12细胞中实现稳定且可重复的IC50。由于PC12细胞系中功能性NMDA受体相对缺乏，通常需要毫摩尔浓度来触发毒性，主要是通过氧化应激而不是急性离子毒性（Chang et al., 2014; Jiang et al., 2014）。因此，该模型反映了急性氧化损伤，而不是阿尔茨海默病或帕金森病典型的慢性神经退行性变，线粒体衰竭和ATP耗竭是这两种疾病的共同病理机制。γ-萜品烯在急性应激下维持ATP平衡的有效性突显了其对抗长期神经元衰退的累积代谢缺陷的潜力。虽然这些发现证明了其在急性环境中的强大神经保护潜力，但需要在原代神经元或体内慢性模型中进行进一步验证，以确认其在渐进性神经退行性疾病治疗中的全部转化相关性。鉴于神经元的高能量需求，线粒体功能障碍被认为是兴奋毒性和神经退行性的早期和关键事件。线粒体通过氧化磷酸化产生ATP，大约80%的脑能量消耗支持突触传递和神经元兴奋性，强调了能量稳态对神经元存活和突触可塑性的重要性（Harris et al., 2012）。线粒体功能受损或ATP产生不足会进一步破坏突触信号传导，并导致神经退行性变，这是帕金森病和阿尔茨海默病的关键病理机制（Guzman et al., 2010; Lin & Beal, 2006）。我们的结果表明，γ-萜品烯处理显著恢复了谷氨酸诱导的PC12细胞中的细胞内ATP水平和线粒体膜电位，从而改善了线粒体功能和能量代谢。这种增强的ATP产生可能支持离子稳态、膜修复和神经递质合成，从而对其神经保护作用有所贡献。

在神经传递水平上，多巴胺（DA）和去甲肾上腺素（NE）是中枢神经系统中的主要儿茶酚胺类神经递质，其合成、囊泡装载和释放高度依赖于线粒体ATP产生和氧化还原稳态（Teleanu et al., 2022）。先前的研究表明，兴奋毒性和氧化应激会损害线粒体功能和ATP产生，从而限制多巴胺（DA）和去甲肾上腺素（NE）的生物合成，并最终破坏神经元信号传导和情绪稳态（Park et al., 2018; Pa? et al., 2020）。一致地，在谷氨酸诱导的损伤模型中，PC12细胞中的细胞内DA和NE水平显著下降。γ-萜品烯处理恢复了线粒体膜电位，增加了细胞内ATP，并逆转了儿茶酚胺水平的下降。这种恢复可能反映了能量依赖的机制，因为ATP的可用性是囊泡单胺运输和神经递质合成的关键限速因素。鉴于囊泡装载、离子梯度维持和突触囊泡回收都依赖于ATP，维持线粒体生物能量对于儿茶酚胺类神经传递至关重要。这些发现表明，γ-萜品烯可能通过增强线粒体能量转换效率和减轻ROS积累来保持神经元能量供应和神经递质稳态。先前的研究主要关注γ-萜品烯的抗炎、抗氧化和情绪稳定作用（Agarwal et al., 2022; Singh et al., 2021），而其在能量代谢和神经保护中的作用则较少探索。我们的结果表明，γ-萜品烯可能与SIRT1-AMPK-PGC-1α-TFAM信号轴相关，伴随线粒体生物发生和能量代谢蛋白的上调，有助于恢复线粒体膜电位和ATP产生。AMPK作为关键的能量传感器，而SIRT1去乙酰化并激活PGC-1α，促进线粒体基因的转录（Alattar et al., 2022）。同时，Nrf2的激活可以与PGC-1α协同作用，增强细胞抗氧化防御，减少ROS和脂质过氧化介导的线粒体损伤（Gureev et al., 2019）。因此，γ-萜品烯可能通过调节线粒体生物发生和抗氧化途径来促进线粒体功能恢复和稳定能量代谢。这种协调调节可能有助于维持氧化还原稳态，并帮助在线粒体兴奋毒性下保持线粒体质量。值得注意的是，先前的研究还表明，γ-萜品烯在C2C12肌母细胞中促进了线粒体生物发生，显著增强了线粒体膜电位和ATP含量（Wang et al., 2025），表明其在不同细胞类型中的潜在能量促进作用。此外，尽管AMPK-SIRT1-PGC-1α相关蛋白表达的变化表明了途径的参与，但本研究未使用药理学抑制剂或基因方法进行直接因果验证。因此，未来的功能实验（例如药理学抑制或基因沉默）将进行，以加强这一机制的证据。

尽管γ-萜品烯的线粒体调节和神经保护作用提供了重要证据，但仍应承认一些局限性。目前的发现主要基于PC12细胞模型。尽管该模型被广泛使用，但它并不能完全代表原代神经元或体内神经系统的复杂性，包括神经元-胶质细胞相互作用和神经网络动态。未来使用其他神经元模型（如SH-SY5Y和HT-22细胞）以及动物模型进行的研究将有助于验证和扩展这些发现。此外，尽管细胞内钙超载是谷氨酸诱导的兴奋毒性的关键介质，但本研究未评估钙动态，因为主要关注点在于线粒体功能和能量代谢。尽管如此，先前的研究表明，γ-萜品烯可能通过调节钙通道来调节神经元活动，支持钙信号传导的潜在相关性（Pina et al., 2022）。然而，这些机制是否涉及当前的体外系统仍不清楚，需要进一步研究。此外，直接证明线粒体生物发生、mtDNA复制和血脑屏障（BBB）穿透的证据仍有待建立。在分子水平上，这些线粒体效应的调节机制尚不清楚。未来结合转录组学方法（如RNA-seq）的研究将有助于识别差异表达的基因，并进一步阐明γ-萜品烯效应的分子机制。尽管新兴的体内证据表明γ-萜品烯在动物模型中表现出神经活性和抗炎作用（Pina et al., 2022），但其在大脑中的分布和BBB通透性尚未直接评估。作为一种单萜，γ-萜品烯具有相对较低的分子量和较高的脂溶性，这些特性通常被认为有利于其通过BBB的被动扩散。此外，某些单萜类化合物（如莰醇）已被报道可以通过调节紧密连接蛋白和外排转运蛋白来改变血脑屏障的通透性（Zheng等人，2018年），这表明结构相似的化合物可能具有中枢神经系统效应。然而，关于γ-萜烯的直接实验验证仍然缺乏，需要进一步的研究。从功能性食品的角度来看，γ-萜烯是一种天然存在的单萜类化合物，在柑橘皮中含量丰富，并且通常通过柑橘制品和饮料少量摄入。由于首过代谢、快速生物转化以及有限的系统生物利用度，像γ-萜烯这样的单萜类化合物在口服后体内的循环浓度通常较低。因此，在体外实验中通常需要较高的浓度来弥补代谢和分布方面的限制（Schmidt，2015年）。γ-萜烯可能不是作为一种急性药物起作用，而是一种温和的细胞生物能量调节剂，有助于长期的代谢平衡和神经细胞的韧性。未来研究生物利用度、脑内分布以及体内功能结果对于将这些机制性见解转化为基于证据的功能性食品应用至关重要。

总之，γ-萜烯主要作为一种线粒体生物能量调节剂发挥作用，而不仅仅是抗氧化剂，它通过以线粒体为中心的能量调节来保护神经细胞的存活。本研究证明，从柑橘皮残渣中提取的γ-萜烯可以通过改善线粒体功能、增强ATP生成和减少氧化应激来缓解谷氨酸引起的神经损伤。这些发现表明柑橘单萜类化合物具有调节代谢的作用，能够增强神经细胞的韧性，并为柑橘加工残渣的高价值利用提供了科学依据。此外，由于柑橘衍生的单萜类化合物通常通过柑橘水果和饮料摄入，饮食中的γ-萜烯暴露可能有助于长期调节细胞生物能量。

**5. 结论**
总之，本研究表明柑橘皮精油在谷氨酸诱导的PC12细胞损伤模型中具有神经保护作用，其中青柠皮精油表现出最明显的活性。γ-萜烯被确定为关键的生物活性成分，能够恢复线粒体膜电位、增强ATP生成并减少氧化应激。其作用主要通过调节线粒体生物发生途径（AMPK-SIRT1-PGC-1α-TFAM和Nrf2）、维持线粒体功能和细胞能量稳态以及稳定多巴胺和去甲肾上腺素水平来实现。总体而言，这些发现突显了从柑橘加工副产物中提取的γ-萜烯的功能价值，为开发天然生物活性物质和农业残渣的高价值利用提供了科学依据。

**作者贡献声明**
徐莫荣：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、软件使用、方法学设计、实验实施、数据分析。蔡清毅：撰写——初稿、方法学设计。王胜阳：数据可视化、资源获取、方法学设计、资金申请、数据分析。

**伦理声明**
作者声明在提交本手稿的过程中没有涉及任何伦理问题，且所有作者均同意该手稿的发表。我代表我的合作者声明，所描述的工作是原创性的，尚未在其他地方发表或考虑发表。