发酵过的菊花茎叶通过调节肠道微生物群和肠道屏障功能，在DSS诱导的结肠炎模型中支持肠道健康

《Journal of Functional Foods》：Fermented chrysanthemum stems and leaves support intestinal health by modulating gut microbiota and barrier function in a DSS-induced colitis model

　　应倩|宣江|雷静江|方芳程|闵叶曲|开封伟|魏风尧|李张|明亮高|慧燕|陈培东
中国医药资源产业化江苏省协同创新中心，南京中医药大学药学院，南京210023，中国

**摘要**
菊花茎叶是丰富的农业副产品，尽管其含有丰富的植物化学成分，但仍未得到充分利用。本研究采用植物乳杆菌（Ligilactobacillus plantarum）进行食品级发酵，以增强菊花茎叶对肠道健康的支持作用。通过UPLC–MS代谢组学方法分析了发酵引起的成分变化，并在硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠模型中评估了发酵产物（FCSL）的功能效果。代谢组学分析显示，菊花茎叶的植物化学成分发生了显著变化，尤其是黄酮类和酚酸。膳食补充FCSL可减轻DSS引起的肠道损伤，表现为疾病活动指数降低、结肠缩短程度减轻以及组织病理学特征改善。这些效果与炎症反应的调节有关，包括促炎细胞因子的减少和IL-10表达的增加。FCSL补充还保持了杯状细胞的丰度，上调了MUC2的表达，并通过增加紧密连接蛋白的表达增强了肠道屏障的完整性。肠道微生物群分析表明，FCSL改变了微生物群落组成，表现为植物乳杆菌的增加和普雷沃氏菌（Prevotella）的减少。粪便微生物组移植进一步支持了微生物群调节在观察到的肠道益处中的贡献作用。此外，粪便代谢组学分析表明，DSS相关的代谢紊乱部分得到正常化，尤其是在脂质代谢途径中。总体而言，这些发现表明乳酸菌发酵是一种有前景的策略，可以增强菊花茎叶生物体的功能价值，支持其作为促进肠道健康的功能性食品成分和可持续农业副产品利用的潜力。

**1. 引言**
菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是东亚广泛食用的可食用和药用植物，长期以来被用于传统饮食和草药制剂中，以缓解与热相关的不适症状，如头痛、头晕和炎症性疾病（H. Yuan等人，2020；K. Liu等人，2024）。迄今为止，菊花的利用主要限于其花朵，而茎叶在收获后通常被丢弃，导致大量生物量浪费。值得注意的是，菊花茎叶富含生物活性成分，包括黄酮类、酚酸、萜类和多糖（Nugroho, Lim, Choi, & Park, 2013；Sassi等人，2014），并且其植物化学成分与花朵高度相似（Y. Li等人，2022）。先前的研究表明，从这些地上部分提取的化合物具有抗氧化、抗炎和调节胃肠道的功能（Tao等人，2017），表明它们是未被充分开发的功能性食品资源。
炎症性肠病（IBD），特别是溃疡性结肠炎（UC），是一种慢性复发性疾病，其特征是持续的肠道炎症、上皮屏障损伤和免疫反应失调（Wangchuk, Yeshi, & Loukas, 2024；Yue等人，2020）。近年来，UC的全球发病率和患病率显著增加，对公共卫生产生了日益严重的负担（Y. Liu等人，2024；Y. Li等人，2022）。尽管传统的药物干预可以缓解症状并诱导缓解（Aden等人，2019；Hyun, 2021；Luo等人，2019），但越来越多的证据表明，肠道微生物群组成和微生物代谢的紊乱在肠道炎症过程中起着核心作用（Seidel, Azcárate-Peril, Chapkin, & Turner, 2017；Zeng等人，2025），这突显了饮食策略和针对微生物群的方法对支持肠道健康的重要性（Cai, Wang, & Li, 2021；Feng等人，2023）。
发酵已成为一种有效的食品级策略，可以增强植物源材料的功效（Ma, Wang, Wan, Wang, & Jiang, 2025）。特别是，益生菌介导的生物转化可以提高植物化学物质的生物可利用性，生成新的代谢物，并调节肠道微生物群（Gong等人，2020；Hu等人，2025；J. Li等人，2022）。基于乳酸菌的发酵已被报道可以增加酚酸和黄酮类化合物的含量，包括槲皮素、木犀草素、山柰酚和芦丁（Zhang等人，2023），从而增强抗氧化和抗炎潜力（Mokhtar等人，2023；Nasr, Yosuf, Turki, & Abozeid, 2023）。发酵的草药产品通常与肠道环境的相容性更好，使其成为促进肠道健康的功能性食品的有吸引力的候选者。
由于菊花茎叶富含植物化学成分，它们是微生物发酵的有希望的底物。然而，它们在益生菌发酵后的功能特性及其在调节肠道炎症、肠道微生物群和宿主代谢中的潜在作用尚未得到充分探索。特别是，发酵是否可以通过协调调节炎症相关反应、微生物稳态和代谢途径来增强菊花茎叶对肠道健康的支持作用，仍有待系统研究。
在本研究中，使用植物乳杆菌对菊花茎叶进行发酵，并优化了发酵条件以富集黄酮类和酚酸。通过硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠模型评估了发酵前后植物化学成分的变化以及发酵和未发酵制剂的功能效果。此外，还分析了肠道微生物群组成和粪便代谢物谱型，以探索潜在机制。本研究旨在提供一种适用于食品的发酵策略，以利用菊花茎叶生物体，并支持将发酵后的菊花茎叶开发为促进肠道健康的功能性食品成分。

**2. 方法和材料**
2.1. 试剂和化学品
从江苏省盐城市射阳县的一个药用菊花种植基地收集了新鲜的菊花（Chrysanthemum morifolium）叶子。植物乳杆菌由中国工业微生物菌种保藏中心提供。硫酸葡聚糖钠（DSS，分子量36,000-50,000；目录号60316ES60）购自上海YEASEN生物技术有限公司。色谱分离使用的是Waters公司的C18分析柱。质谱用甲醇和甲酸均来自Thermo Fisher Scientific公司。
2.2. 发酵菊花茎叶粉的制备
将新鲜的菊花茎叶研磨成细粉，并通过1号筛网过滤以确保均匀性。然后将所得粉末分散在无菌水中（1克：20毫升，w/v），并通过高压灭菌进行消毒。消毒后，用植物乳杆菌（OD??? = 0.8）接种，并在37°C下进行厌氧发酵，时间根据预定条件确定，以获得发酵制剂。
为了优化菊花茎叶粉的发酵条件，首先进行了单因素实验，研究固液比、接种量和发酵时间对总黄酮类和总酚酸含量的影响。在固定条件下（固液比1:20，接种量1%，发酵时间24小时），分别改变每个因素。测试了不同的固液比（1:100、1:50、1:25、1:12.5和1:6.25）；评估了不同的接种量（1%、5%、15%、25%和35%）；以及不同的发酵时间（1、2、3、4和5天）。在整个实验过程中，总黄酮类和总酚酸含量被用作评估指标。
基于单因素实验的结果，采用正交实验设计来确定最佳发酵工艺。使用以下公式计算每个指标的隶属度（L），以标准化数据以便进行综合评估：
L=Ci–Cmin/Cmax?Cmin
其中Ci表示每个指标的测量值，Cmin和Cmax分别表示该变量的下限和上限。通过汇总所有参数的加权隶属度来计算总体评估分数，总黄酮类和总酚酸含量的权重系数均为0.5。正交数组设计中使用的具体实验因素及其相应水平见表1。

**表1. 菊花茎叶生物体发酵工艺参数的正交实验结果**
| 实验运行 | ABCT | 总黄酮含量（mg/g） | 总酚酸含量（mg/g） | 综合得分 |
|-------|--------|-----------|-------------|---------|
| 1 | 1 | 10.375 | 21.83 | 10.88 |
| 2 | 12 | 10.91 | 22.49 | 30.91 |
| 3 | 13 | 12.46 | 20.98 | 74 |
| 4 | 13 | 13.11 | 21.37 | 92 |
| 5 | 12 | 12.68 | 22.77 | 80.99 |
| 6 | 13 | 12.78 | 12.17 | 10.67 |
| 7 | 13 | 16.84 | 23.11 | 10.67 |
| 8 | 13 | 23.92 | 17.97 | 0.75 |
| 9 | 13 | 29.57 | 11.73 | 0.75 |
| 10 | 1 | 12.78 | 22.35 | 2.62 |
| 11 | 2 | 2.75 | 2.65 | 2.62 |
| 12 | 2 | 2.17 | 2.70 | 3.24 |
| 13 | 10.92 | 0.78 | 0.87 | 0.87 |
| 14 | 0.92 | 0.78 | 0.87 | 0.87 |
| 15 | 0.72 | 0.90 | 0.82 | 0.90 |
| 16 | 0.20 | 0.11 | 0.05 | 2.3 |

**2.3. 发酵前后化学成分的分析**
为了评估发酵对菊花茎叶化学成分的影响，对未发酵和发酵样品进行了LC–MS分析，以评估成分差异。使用70%甲醇进行超声提取（1小时），然后离心（12,000 rpm，10分钟）。上清液冻干，重新溶解在50%甲醇中，通过0.22 μm尼龙膜过滤，然后进行LC–MS分析。

**2.4. 动物实验**
所有动物实验均经过南京中医药大学伦理委员会的审查和批准（批准号202501A003），并按照国家研究委员会发布的《实验动物护理和使用指南》进行。实验所用的是7周大的雄性C57BL/6 J小鼠（22–24克），由江苏省青龙山生物技术有限公司提供。每组五只小鼠被饲养在通风良好的笼子中，保持稳定的温度和湿度，光照每12小时在光照和黑暗之间交替。
适应一周后，将雄性C57BL/6 J小鼠（22–24克）分为九组：对照组、DSS模型组、5-ASA（100毫克/千克）组以及CSL或FCSL组（剂量分别为100、200或400毫克/千克）。通过向饮用水中添加2.5%（w/v）DSS诱导溃疡性结肠炎，持续七天（对照组除外）（图1）。本研究中使用的剂量浓度基于先前发表的文献（Huang等人，2022；Shin等人，2022；Zhai, Niu, Liu, Lin, & Wu, 2021）。从第8天开始，每天口服CSL、FCSL或5-ASA一周。每天记录体重、粪便形态和出血迹象，并根据表S1计算DAI分数。实验结束时，取出结肠测量长度，称重脾脏以计算指数（脾脏/体重），并保存血液、结肠和盲肠样本进行分析。

**图1. 单因素实验结果。**
(A) 底物与溶剂比例对菊花茎叶生物体发酵过程中黄酮类和酚酸积累的影响。
(B) 不同发酵持续时间下菊花茎叶发酵产物中总黄酮类和酚酸水平的变化。
(C) 接种浓度对菊花茎叶发酵过程中总黄酮类和酚酸含量的影响。

**2.5. ELISA**
通过ELISA检测血清和结肠匀浆液中的细胞因子。从眼后静脉丛抽取血液样本，在4°C下储存约6小时，然后以2000 rpm离心30分钟以分离血清。结肠片段在冷磷酸盐缓冲液（PBS）中匀浆，并在4°C下以1200 rpm离心20分钟以获得上清液。使用YFX商用ELISA试剂盒（中国）根据供应商的协议测定IL-1β、IL-6、IL-10、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α的浓度。吸光度读数使用Synergy 2微孔板读数仪（BioTek，Vermont，美国）记录。

**2.6. 组织学分析**
使用Alcian blue染色法评估杯状细胞和上皮细胞的数量（Wang等人，2023）。每只小鼠的每个结肠切片分析十个隐窝，每个样本评估五个切片。组织学分析中，结肠样本保存在4%甲醛中，包埋在石蜡中，切片厚度为4 μm。切片脱蜡、水化，然后依次进行染色——用hematoxylin染色显示细胞核，用eosin染色显示细胞质和结构对比。脱水并清除后的样本在显微镜下观察。

**2.7. 免疫荧光（IF）染色**
免疫荧光协议遵循我们之前的出版物（Ma等人，2023）中的方法。结肠组织浸泡在4%甲醛中固定，通过石蜡包埋，切成4-μm的切片。复水后，使用柠檬酸缓冲液暴露抗原表位。通过在室温下用5% BSA孵育1小时防止非特异性相互作用。随后，将切片在4°C下暴露于指定的一抗过夜，然后在室温下与荧光二抗孵育1小时。使用Hoechst 33342进行核染色。使用Thunder荧光显微镜（Leica Microsystems，德国）从每个样本的三个到五个随机选定的区域捕获荧光信号。

**2.8. 流式细胞术分析**
从牺牲的小鼠中分离结肠组织，用磷酸盐缓冲液（PBS）彻底清洗，并修剪成1厘米的片段。结肠组织在含有0.5 M EDTA、0.1 M DTT、1 M HEPES、胶原酶VIII（2 mg/mL）、DNase I（10 mg/mL）和10% FBS的RPMI-1640培养基中进行酶解。酶解反应在37°C下温和搅拌（150 rpm）进行40分钟，产生异质细胞混合物。通过尼龙网过滤去除残留的组织碎片，将所得悬浮液用40% Percoll稀释，然后覆盖在70% Percoll梯度上进行密度分馏。经过梯度离心（3000转/分钟，30分钟）后，富集了白细胞的界面层被分离出来，通过洗涤进行纯化，最后悬浮在PBS中以备后续实验使用。细胞被标记上用于检测表面标记物的荧光染料连接的单克隆抗体混合物，这些抗体能够识别CD45、CD11b、Ly6C、Ly6G、F4/80、CD3、CD4和CD8。染色反应在4°C的黑暗条件下进行了30分钟。用含有2% FBS的PBS洗涤两次后，荧光谱在CytoFLEX分析仪（Beckman Coulter）上记录下来，并使用FlowJo v10.8.2.9进一步分析。

**粪便微生物群移植（FMT）**
粪便微生物群移植（FMT）是根据既定协议（J. Wu等人，2020年）进行了少量修改后进行的。简而言之，从供体小鼠无菌收集新鲜粪便样本，并在移植前将它们混合在一起。粪便（50毫克）以1:10（w/v）的比例重新悬浮在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，充分混合后以2000转/分钟的速度离心6分钟。上清液被收集作为移植材料。新鲜的移植材料在移植当天口服前立即准备并使用。

**受体小鼠的处理**
受体小鼠在FMT前5天接受了含有抗生素的饮用水处理，这些抗生素包括氨苄西林（1克/升）、甲硝唑（1克/升）、万古霉素（0.5克/升）和新霉素（0.5克/升），之后再饮用普通水3天。粪便移植是通过每隔一天口服200微升的移植材料来进行的，共持续7天。

**2.10. 16S核糖体RNA基因测序**
粪便微生物的16S rRNA基因测序由BioTree有限公司（中国上海）完成。通过严格的质量控制标准，读取的序列被组装成操作分类单元（OTUs），其核苷酸同一性截止值为97%。通过描述样本内丰富度和样本间组成变化的指数来量化群落异质性，这些指数对应于α-多样性和β-多样性指标。在属和科的级别上分析了分类学分辨率和相对丰度，并使用LEfSe分析确定了显著富集的微生物类群。

**2.11. 统计分析**
所有定量结果均以平均值±标准误差（SEM）的形式呈现。统计评估使用GraphPad Prism版本9.0（GraphPad Software，美国加利福尼亚州）进行。实验组间的差异通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后多重比较程序来确定。p值低于0.05被认为具有统计学意义。

**3. 结果**
**3.1. 菊花茎和叶的最佳发酵条件**
根据图1，单因素分析显示总黄酮类和酚酸产量的变化呈双相趋势：随着固液比、接种量和发酵时间的增加，产量最初上升随后下降。最佳条件确定为固液比为1:25、接种量为15%、发酵时间为2天。基于这些结果，随后采用了正交实验设计来全面评估变量之间的相互作用。R值分析表明，这些参数影响的顺序为：A（固液比）> B（发酵时间）> C（接种量）。K值评估进一步表明，最佳组合是A1B3C1，即固液比为1:25、发酵时间为1天、接种量为5%（表1和表S2）。这种差异是合理的，因为单因素结果反映了局部最优值，而正交结果反映了多因素条件下的整体最优值。重复三次的验证实验得出的平均综合得分为0.978±0.008（表S3），确认这一条件是菊花茎和叶发酵的最佳条件。

**3.2. 发酵后菊花茎和叶代谢物组成的比较分析**
使用LC–MS对发酵前（CSL）和发酵后（FCSL）的菊花茎和叶的代谢组成进行了表征，相应的总离子色谱图（TICs）显示在图2A–D中。共鉴定出107种代谢物。具体来说，FCSL中检测到90种化合物，包括29种酚酸、50种黄酮类和其他11种化合物；而CSL中检测到88种化合物，包括28种酚酸、49种黄酮类和其他11种化合物。热图分析显示，与CSL相比，FCSL中大多数黄酮类和酚酸的标准化相对丰度更高，主要包括木犀草素和芹菜素相关的代谢物、槲皮素、山柰酚、绿原酸和二咖啡酰奎宁酸衍生物。相比之下，几种结合型黄酮类化合物，如乙酰乙酰苯胺-7-O-葡萄糖醛酸苷、黄烷酮-7-O-葡萄糖醛酸苷和吴茱萸苷，在发酵后显示出下降趋势（图S4）。PCA分析区分了CSL和FCSL，揭示了整体代谢组成的显著变化（图2E，F）。

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**图2. CSL和FCSL之间的代谢谱型和组成差异。**
(A, B) CSL和FCSL在负离子模式下获得的总离子色谱图（TICs）。
(C, D) CSL和FCSL在正离子模式下获得的总离子色谱图（TICs）。
(E, F) 分别在负离子和正离子模式下显示CSL和FCSL之间整体代谢差异的PCA得分图。
(G, H) 在负离子和正离子电离条件下显示代谢谱型分离的PLS-DA得分图。
(I) 显示CSL和FCSL之间有显著差异的11种代谢物的聚类热图（VIP > 1，p < 0.05，|倍数变化| ≥ 2）。

PLS-DA用于识别对样本间差异贡献最大的代谢物。构建的模型在负离子（R2Y = 0.990，Q2 = 0.987）和正离子（R2Y = 1，Q2 = 0.999）电离模式下都表现出稳健的区分能力和预测能力，证实了其统计可靠性（图2G，H）。应用预定义的统计过滤器（VIP > 1，p < 0.05，|倍数变化| ≥ 2）后，鉴定出11种差异丰度显著的代谢物（图2I）。其中，乙酰乙酰苯胺、二氧甲基苯甲酰苯胺、木犀草素、山柰酚和3,5-二咖啡酰奎宁酸在FCSL中富集，而鸟苷、腺苷、2′-脱氧腺苷和DL-色氨酸在CSL中相对富集。KEGG通路富集分析显示，这些差异代谢物主要参与嘌呤代谢和叶酸的一个碳池，其中嘌呤代谢是富集最显著的通路（图S6）。总体而言，这些发现表明发酵显著重塑了菊花茎和叶的化学谱型，并指出了可能增强FCSL生物活性的特定代谢物。

**3.3. FCSL减轻了DSS诱导的小鼠结肠炎中的炎症相关症状和组织损伤**
DSS诱导的小鼠结肠炎是一个广泛接受的模型，能够再现人类溃疡性结肠炎中的病理病变和临床表现（Chassaing, Aitken, Malleshappa, & Vijay-Kumar, 2014）。在DSS诱导的结肠炎模型中，C57BL/6小鼠接受2.5% DSS处理7天，随后用正常水恢复7天。FCSL和FCSL以每天100、200或400毫克/公斤的剂量口服给药，而5-ASA（100毫克/公斤）作为阳性对照（图3A）。所有给药样本在给药前都通过0.22微米膜过滤器过滤。FCSL上清液的平板培养未检测到可培养的菌落（图S7）。此外，还评估了发酵介质对照组（FM）的效果。与DSS组相比，FM处理没有显著改善结肠长度、脾指数、组织学评分、杯状细胞与上皮细胞的比例或H&E和Alcian Blue染色结果（图S8）。DSS挑战显著损害了生理状态，导致体重下降、DAI值升高、结肠收缩以及相对于健康组的脾脏明显增大（图3B–F）。

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**图3. FCSL缓解了DSS诱导的小鼠结肠炎症状和组织损伤。**
(A) 总结DSS诱导的溃疡性结肠炎及其相应治疗干预措施的实验流程图。
(B, C) 在整个实验期间监测每组的相对体重（B）和DAI评分（C）的变化过程。
(D) 代表不同实验组的结肠形态图像。
(E) 不同队列的结肠长度测量。
(F) 各实验组的脾指数数据比较。
(G) H&E染色的显微图显示结肠内的上皮破坏和炎症浸润（比例尺：概述用500微米，细节用50微米）。
(H) Alcian Blue染色显示结肠黏膜中的黏液层结构和杯状细胞定位（比例尺：500微米和50微米）。
(I) 从组织切片中量化杯状细胞与上皮细胞的比例。所有定量结果表示为平均值±标准误差（n = 5）。统计解释：+p < 0.05，CSL vs. FCSL；### p < 0.001 vs. 对照组；* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001 vs. DSS组。
（关于此图例中颜色的解释，请参阅文章的网络版本。）

值得注意的是，虽然CSL和FCSL都显示出保护作用，但FCSL在中等和高剂量下表现更为显著。FCSL随着剂量的增加而表现出渐进的保护效果，与DSS模型组相比，接受中等和高剂量的动物显示出显著的改善。组织学分析进一步显示，DSS诱导了严重的结肠损伤，包括黏膜侵蚀、隐窝破坏和炎症细胞浸润。FCSL显著减轻了这些组织病理变化，其效果与5-ASA相当（图3G，I）。Alcian Blue组织化学染色表明，DSS挑战破坏了肠道黏液屏障并减少了杯状细胞，而这些变化在FCSL的作用下得到了显著逆转，促进了黏液更新和杯状细胞增殖（图3H，J）。此外，FCSL的治疗效果与参考化合物5-ASA相当，表明发酵过程可能增强了菊花茎和叶的药理活性，可能是通过提高成分的生物利用度或促进生物活性代谢物的形成。

**3.4. FCSL干预减轻了DSS诱导的小鼠结肠中的黏膜免疫激活和炎症细胞募集**
平衡的细胞因子信号对于维持肠道免疫耐受性至关重要（Pastorelli, De Salvo, Mercado, Vecchi, & Pizarro, 2013）。血清细胞因子的定量分析表明，DSS挑战引发了强烈的促炎倾向，表现为IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF升高，同时IL-10降低。FCSL补充剂逆转了这种模式，以剂量依赖的方式抑制了促炎介质并恢复了IL-10的表达，效果与5-ASA相似（图4A，B）。与CSL相比，发酵制剂表现出更强的免疫调节作用。与血清结果一致，FCSL还降低了结肠中的IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF水平，同时增加了IL-10的产生（图4C–H）。

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**图4. FCSL减轻了DSS诱导小鼠的炎症和免疫细胞浸润。**
(A) 热图显示了实验组间血清细胞因子的分布，包括IL-10、GM-CSF、IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-6。
(B) DSS暴露组和治疗组之间血清细胞因子浓度的比较评估。
(C) 结肠组织中IL-10（C）、GM-CSF（D）、IL-1β（E）、TNF-α（F）、IFN-γ（G）和IL-6（H）的定量测量。
(I, J) 从结肠样本中分离的CD4+（I）和CD8+（J）T细胞亚群的流式细胞术谱型。
(K) 结肠内CD4+和CD8+ T淋巴细胞的比例分布。
(L–N) 浸润免疫细胞的量化，包括CD11b+Ly6C+单核细胞（L）、CD11b+Ly6G+中性粒细胞（M）和CD11b+F4/80+巨噬细胞（N）。结果显示为平均值±标准误差（n = 5）。显著性测试：+p < 0.05，CSL vs. FCSL；### p < 0.001 vs. 对照组；* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001 vs. DSS处理组。

认识到趋化因子驱动的免疫细胞迁移在结肠炎发展中的核心作用（L. Li等人，2020；Lv等人，2021；G. Li等人，2021），我们通过流式细胞术分析了结肠中T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的浸润。流式细胞术显示，DSS暴露导致CD4+ T细胞数量显著增加，而CD8+ T细胞数量略有变化。FCSL处理显著减少了CD4+ T细胞的积累，同时对CD8+ T细胞数量的影响较小（图4I–K）。此外，FCSL干预显著限制了DSS暴露引起的单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的募集，从而减轻了与结肠炎症相关的髓系细胞浸润。相比之下，CSL的调节作用较弱，而FCSL在限制免疫细胞浸润方面表现出更强的效力（图4L–N，图S1）。

此外，FCSL给药还减轻了肠道的上皮损伤，并有助于保持黏膜屏障的完整性。免疫荧光成像显示，DSS暴露破坏了上皮屏障的完整性，导致Claudin-1、ZO-1、Occludin和MUC2的表达降低。FCSL给药以剂量依赖的方式逆转了这些变化，恢复了这些蛋白质的丰度和上皮定位（图S2 A–E）。此外，相关性分析显示，FCSL发酵改变的代谢物——包括乙酰乙酰苯胺、二氧甲基苯甲酰苯胺、木犀草素和山柰酚等黄酮类以及3,5-二咖啡酰奎宁酸等酚酸——与免疫细胞浸润呈负相关，包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞（图S2F）。其中，黄酮类显示出最强的负相关。同样，这些代谢物与TNF-α、IFN-γ、IL-6、GM-CSF、IL-1β呈负相关，但与IL-10、木犀草素、山柰酚和3,5-二咖啡酰奎宁酸呈正相关，其中木犀草素、山柰酚和3,5-二咖啡酰奎宁酸的相关性最为显著（图S2G）。综合这些发现表明，FCSL通过重新平衡细胞因子信号传导、缓解异常的T细胞反应、抑制单核细胞-巨噬细胞-中性粒细胞的浸润以及保护上皮屏障功能来减轻DSS引起的结肠炎症。3.5. FCSL重塑了肠道微生物群落。肠道微生物环境的紊乱被认为是UC病理学形成的基础因素，而恢复微生物共生关系往往可以减轻炎症反应（Han等人，2023年）。为了明确FCSL对DSS诱导的结肠炎的保护作用是否是通过重塑肠道微生物生态实现的，研究人员采用了16S rRNA测序技术。DSS处理导致微生物多样性显著下降，表现为Pielou均匀度、Chao丰富度、Shannon熵和Goods覆盖率的降低。相比之下，FCSL的摄入——尤其是在中等和较高剂量下——部分恢复了这些生态指标（图5A-D）。LEfSe分析进一步揭示了各组之间的微生物群落结构差异，FCSL处理后某些细菌类群的丰度发生了变化（图5E）。社区条形图分析显示，在属水平上发生了明显的组成变化，DSS导致了显著的破坏，而FCSL的施用则使细菌群落向更平衡的状态转变（图5F）。值得注意的是，FCSL处理显著降低了Prevotella的丰度，同时相对于DSS处理组，Ligilactobacillus的丰度有所增加（图5G, H）。总之，FCSL的摄入似乎能够重新组织肠道微生物生态，提高群落异质性，并促进DSS挑战小鼠中有益细菌群落的生长。下载：下载高分辨率图像（831KB）下载：下载全尺寸图像图5. FCSL调节了肠道微生物组成。（A-D）基于Pielou均匀度指数评估了各组肠道微生物社区的α多样性。（A）Chao丰富度（B）Shannon多样性（C）和Goods覆盖率（D）指标。（E）使用LEfSe筛选出实验组间有显著差异的细菌类群（LDA得分>4，p<0.05）。（F）实验组间粪便微生物社区的属水平分布图。（G, H）各组中Ligilactobacillus（G）和Prevotella（H）的相对丰度。3.6. FCSL在DSS处理的小鼠模型中的代谢调节。代谢重编程被广泛认为是UC的一个定义性特征（Ning等人，2023年）。为了阐明FCSL处理在DSS诱导的结肠炎模型中引起的代谢变化，进行了非靶向LC–MS分析以表征血清代谢组学谱型。在正负离子化条件下，对照组、DSS组和FCSL处理组之间出现了明显的分离，热图和PLS-DA得分分布显示了全球代谢模式的显著改变（图6A-E；图S3AD）。此外，比较对照组和DSS组的层次聚类热图突出了DSS引起的显著代谢紊乱（图S3E）。与DSS组相比，FCSL（400 mg kg?1）处理显著减轻了这些代谢紊乱，这通过多种失调代谢物的恢复得到了证实（图6A, G）。KEGG富集分析显示，大多数代谢物变化与脂质相关途径有关，如不饱和脂肪酸的生物合成、丁酸盐代谢处理和脂肪酸分解（图6F）。相关性分析探讨了肠道微生物组成与脂肪酸代谢途径之间的关联。有趣的是，Ligilactobacillus的丰度与脂肪酸代谢物呈负相关，而Prevotella则呈正相关（图6H）。进一步的综合相关性分析显示，肠道微生物群、脂质代谢物和炎症细胞因子之间存在显著关联。包括TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-1β和GM-CSF在内的促炎细胞因子通常彼此正相关，并且也与几种不同的细菌类群和脂质代谢物正相关。值得注意的是，Prevotella与这些促炎细胞因子总体呈正相关，而Ligilactobacillus则呈负相关（图S5B）。这些结果表明，肠道微生物组成的重建与关键血清代谢物的变化密切相关，表明FCSL的保护作用可能部分由微生物群-代谢物相互作用驱动。总体而言，这些发现表明FCSL通过协调调节肠道微生物群、脂质代谢和炎症反应来缓解DSS诱导的结肠炎。下载：下载高分辨率图像（747KB）下载：下载全尺寸图像图6. FCSL对血清代谢组学的影响。（A）热图显示了DSS组和FCSL处理组之间差异最大的20种代谢物的层次聚类（VIP>1，p<0.05）。（B, C）分别在负离子和正离子模式下对DSS组和对照组小鼠的血清代谢物进行PLS-DA分析。（D, E）PLS-DA得分表示在两种离子化条件下DSS挑战组和FCSL处理组（400 mg kg?1）小鼠之间血清代谢物分布的明显分离。（F）KEGG通路富集显示了DSS组和FCSL组（400 mg kg?1）之间差异调节的代谢物。（G）热图显示了DSS组和FCSL组（400 mg kg?1）小鼠中与脂肪酸代谢相关的代谢物。（H）热图显示了差异微生物类群与脂肪酸衍生物代谢物之间的相关性。3.7. FCSL介导的肠道微生物群调节减轻了DSS诱导的结肠损伤并恢复了肠道免疫功能。为了确定FCSL调节的肠道微生物群是否参与减轻DSS诱导的结肠炎，进行了粪便微生物群移植（FMT）研究。总之，将来自对照组、DSS暴露组和FCSL处理组的粪便提取物引入经过抗生素处理的受体小鼠体内，随后这些小鼠接受了DSS处理，从而形成了对照-DSS、DSS-DSS和FCSL-DSS实验组（图7A）。值得注意的是，移植了FCSL处理供体微生物群的小鼠相比接受DSS-DSS组微生物群的小鼠，其DAI值显著降低，同时结肠长度明显恢复，脾指数显著下降（图7B-E）。组织学评估进一步证实，FCSL-DSS组的小鼠表现出较低的组织学评分和更高的杯状细胞与上皮细胞比例，表明肠道黏膜结构得到保护（图7F-H）。流式细胞术分析显示，接受FCSL处理供体微生物群的小鼠（FCSL-DSS组）的CD11b+髓系细胞（包括单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞）显著减少（图7I, K–M）。同时，FCSL-DSS组小鼠的CD4+ T细胞扩张减少，CD8+ T细胞比例降低，表明结肠组织内的过度免疫激活受到抑制（图7J, N–O）。总之，这些结果表明，FCSL调节的粪便微生物群的移植显著减轻了DSS诱导的结肠炎，改善了临床指标，保持了黏膜结构，并减少了促炎免疫细胞的浸润。下载：下载高分辨率图像（966KB）下载：下载全尺寸图像图7. FCSL调节的肠道微生物群减轻了DSS诱导的结肠损伤并恢复了肠道炎症环境。（A）粪便微生物群移植（FMT）程序概述。（B）所有实验组中DAI值的评估。（C）来自不同处理组的结肠组织代表性图像。（D）各组结肠长度的测量。（E）实验组小鼠的脾指数值。（F）结肠损伤的组织病理学评分。（G）结肠切片中杯状细胞与上皮细胞的比例量化。（H）用H&E和Alcian Blue染色的代表性结肠切片。比例尺：50 μm。（I）流式细胞术谱显示结肠组织中的CD45+CD11b+Ly6C+单核细胞、CD45+CD11b+F4/80+巨噬细胞和CD45+CD11b+Ly6G+中性粒细胞。（J）从结肠样本中分离出的CD4+和CD8+ T细胞群体的代表性流式细胞图。（K–M）单核细胞（K）、中性粒细胞（L）和巨噬细胞（M）频率的统计比较。（N, O）结肠样本中CD4+（N）和CD8+（O） T细胞比例的定量评估。数值表示为平均值±SEM。显著性水平：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001与DSS-DSS组相比。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）4. 讨论在本研究中，我们系统评估了发酵菊花茎叶制剂（FCSL）在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中对肠道健康的相关影响。我们还从功能性食品的角度探讨了其潜在机制。膳食补充FCSL与结肠炎相关结果的显著改善、黏膜炎症反应的减弱以及肠道上皮完整性的保持有关。总体而言，这些发现表明，作为乳酸菌发酵的植物衍生产品，FCSL可能是一种有前景的功能性食品成分，有助于支持肠道健康。本研究的一个主要发现是，发酵显著改变了菊花茎叶的植物化学成分。Ligilactobacillus plantarum的发酵显著改变了菊花茎叶的植物化学组成，这一点通过UHPLC–MS分析得到了证实。图S4中的代谢组学热图清楚地显示了CSL和FCSL之间的差异。差异代谢物分析进一步显示，FCSL富含乙酰素、塔克西酚、木犀草素、山柰酚和3,5-二咖啡酰奎宁酸，这些化合物通常与抗炎、抗氧化和肠道屏障保护活性相关（Bu等人，2024年；Qu等人，2021年；Xue等人，2023年）。相比之下，CSL显示出相对较高的鸟苷、腺苷、2′-脱氧腺苷和DL-色氨酸水平，这些与嘌呤和初级氨基酸代谢更密切相关（Kutryb-Zajac, Mierzejewska, Slominska, & Smolenski, 2020年；Xing等人，2025年）。最佳发酵条件可能促进结合酚类化合物的释放和某些黄酮苷的酶促水解，从而增加游离黄酮类和酚酸的相对丰度，这可能有助于提高这些化合物的潜在生物利用度（Huynh, Van Camp, Smagghe, & Raes, 2014年）。先前的研究表明，发酵可以通过包括植酸酶、单宁酶和糖苷酶在内的酶的作用减少抗营养因子的水平，如植酸和单宁，并通过酶介导的生物转化提高生物活性化合物的生物可利用性或潜在生物利用度（K. Li等人，2020年）。总体而言，这些发现表明，发酵使代谢谱向潜在的生物活性植物化学物质转变，这可能部分解释了FCSL增强功能的机制。肠道炎症是结肠炎的标志，通常伴随着免疫失调，其特征是促炎细胞因子的升高和抗炎介质的降低。与先前的报告一致（S.-N. Yuan等人，2023年；Nakase, Sato, Mizuno, & Ikawa, 2022年），DSS暴露显著增加了IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平，同时降低了IL-10的表达。FCSL部分逆转了这些变化，表明其对DSS诱导的结肠损伤的保护作用与炎症反应的减弱和免疫失调的部分纠正有关。这一发现还得到了结肠组织研究的支持，其中FCSL调节了炎症细胞因子（图4C-H）并保持了Cldn-1、ZO-1、Ocln和MUC2的表达（图S2 A-E），表明上皮屏障完整性和黏液屏障功能得到改善。相关性分析进一步表明，发酵引起的代谢变化可能与炎症标志物之间存在潜在关联，这意味着代谢调节也可能有助于FCSL的抗结肠炎效果。此外，肠道微生物群的失调被认为是UC发展的重要因素（Alzahrani等人，2025年；Gyriki等人，2024年）。除了其对炎症和肠道屏障完整性的影响外，FCSL还可能通过调节肠道微生物群提供保护。在本研究中，FCSL的施用重塑了肠道微生物群并显著减轻了DSS诱导的失调。具体来说，FCSL增加了Ligilactobacillus的相对丰度，同时降低了Prevotella的丰度。鉴于某些Ligilactobacillus物种的抗炎和屏障支持作用（Y. Wu等人，2022年；Vich Vila, Zhang, Liu, Faber, & Weersma, 2024年；Yiyou等人，2025年），它们的富集可能与FCSL的肠道益处有关。然而，由于Prevotella包含分类学和功能上多样的物种和菌株，其减少应谨慎解释，可能反映了炎症相关类群的抑制（Iljazovic等人，2021年；Tett, Pasolli, Masetti, Ercolini, & Segata, 2021年）。PICRUSt2进一步表明，FCSL干预后微生物的功能潜力发生了变化，特别是在与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、膜转运和遗传信息处理相关的途径中（图S5A）。然而，这些预测的功能变化仍需要实验验证。宿主代谢调节也可能有助于FCSL的有益效果。与先前将代谢紊乱（尤其是脂质失调）与结肠炎相关肠道功能障碍联系起来的证据一致，本研究的非靶向代谢组学显示FCSL部分逆转了DSS诱导的代谢异常（Kwon, Lee, Heo, Kim, & Hyun, 2021年；Wang等人，2021年）。KEGG分析突出了与不饱和脂肪酸代谢和丁酸盐相关代谢过程相关的途径。此外，相关性网络分析表明肠道微生物群、脂质代谢物和炎症细胞因子之间存在显著关联。值得注意的是，Ligilactobacillus与脂肪酸代谢物和促炎细胞因子呈负相关，而Prevotella则通常与促炎细胞因子呈正相关。这些发现共同支持了FCSL干预后微生物重塑、代谢改变和炎症反应之间的密切关系。总体而言，这项研究表明，乳酸菌发酵增强了菊花茎叶的功能价值。FCSL的补充与炎症反应、肠道微生物群组成和宿主代谢谱型的协调调节有关。这些发现支持将发酵后的菊花茎叶生物质作为功能性食品成分来促进肠道健康，并强调了微生物发酵作为可持续利用植物副产品的增值策略。进一步的研究需要结合靶向代谢组学和分子生物学方法，以明确具体的生物活性成分及其在微生物群与宿主相互作用中的作用。5. 结论 总之，乳酸菌的发酵显著增强了菊花茎叶制品的功能特性。与未发酵的制品相比，食用FCSL（发酵后的菊花茎叶制剂）在DSS（迪氏溃疡模型）诱导的小鼠模型中与改善结肠炎相关结果相关，包括减轻黏膜炎症反应、保持肠道屏障完整性和调节肠道微生物组成。此外，FCSL的补充还与部分恢复DSS相关的代谢紊乱有关，特别是与脂质代谢相关的紊乱，这突显了肠道微生物群、宿主代谢和肠道功能之间的协调作用。总体而言，这些发现表明微生物发酵提高了菊花茎叶的功能价值，并支持将发酵后的菊花茎叶生物质开发为功能性食品成分，以促进肠道健康，同时有助于菊花的可持续增值。

**作者贡献声明**
钱颖：撰写 – 审阅与编辑、撰写 – 原稿、方法学、数据管理。
江轩：方法学、实验设计、数据管理。
江乐静：软件应用、实验设计。
程芳芳：软件应用、资源管理。
曲敏业：软件应用、资源管理。
魏凯峰：软件应用、资源管理。
姚卫峰：软件应用、资源管理。
张莉：软件应用、资源管理。
高明亮：撰写 – 审阅与编辑、软件应用、资源管理。
严慧：撰写 – 审阅与编辑、监督、软件应用。
陈培东：撰写 – 审阅与编辑、软件应用、资源管理。

**伦理声明**
所有动物实验均经过南京中医药大学伦理委员会的审查和批准（批准编号：202501A003），并按照国家研究委员会发布的《实验动物护理和使用指南》进行。

**资助**
本研究得到了以下项目的支持：
- 国家重点研发计划（项目编号：2025YFC3509100）；
- 国家自然科学基金（项目编号：82374037, 82404832）；
- 中药一级学科科学研究计划（项目编号：ZYXPY2024–003）；
- 农业部与农业农村部联合支持的农业研究体系（项目编号：CARS-21）；
- 江苏省“333”高层次人才培训项目；
- 江苏省高校“蓝色计划”；
- 南京中医药大学重点中医药学科建设项目；
- 江苏省中医药疫病研究中心开放项目（项目编号：JSYB2024KF02）；
- 国家重点研发计划（项目编号：2023YFC3504200）；
- 财政部中央专项（项目编号：2060302）。