Neohesperidin 通过调节 Wnt/β-catenin 信号通路和肠道微生物群，减轻小鼠中的结肠炎相关结直肠癌

《Journal of Functional Foods》：Neohesperidin mitigates colitis-associated colorectal cancer in mice by modulating Wnt/β-catenin signaling and gut microbiota

　　**Leng Han|Xuting Wang|Qundi Wang|Chenlu Zhao|Jiying Zhang|Xingyao Long|Jianming He|Tenghui Zhang|Shanshan Chen|Zhigao Sun|Yujiao Cheng|Yanling Fan|Guijie Li**
**中国重庆西南大学柑橘研究所，400712**

**摘要**
结直肠癌（CRC）仍然是全球主要的健康负担。本研究探讨了从枳果中分离出的主要黄酮苷类化合物新橙皮苷（NHP）对阿佐氧甲基烷/硫酸葡聚糖钠诱导的小鼠结直肠癌发生的化学预防作用。通过改进的酶辅助水相萃取方法获得了高纯度的NHP。NHP处理显著减少了肿瘤数量，减轻了结肠和全身炎症，并降低了氧化应激标志物水平。它抑制了Wnt/β-连环蛋白信号通路，表现为β-连环蛋白在细胞核中的积累减少以及下游靶基因c-Myc和cyclin D1的表达下调。肠道微生物群的失调得到了逆转，恢复了厚壁菌门/拟杆菌门的比例，并丰富了Akkermansia和Dubosiella等有益菌属。计算机模拟分子对接分析表明NHP及其代谢物橙皮素可能与β-连环蛋白和Wnt受体发生相互作用。本研究强调了NHP通过同时调节炎症、氧化还原平衡、Wnt信号通路和肠道微生物群的有效性，为预防炎症相关的CRC提供了一种多机制策略。

**1. 引言**
结直肠癌（CRC）是全球最常见的癌症之一，发病率排名第三，癌症相关死亡率排名第二（Bray等人，2024年）。其病因是多因素的。生活方式选择，如吸烟、过量饮酒、肥胖、缺乏运动以及高脂肪/低纤维饮食起着重要作用；溃疡性结肠炎和克罗恩病等炎症性疾病也起到了作用（Arayici等人，2025年；Jang等人，2024年；Mohd Tamsir等人，2024年）。遗传和表观遗传改变进一步加剧了CRC的进展。例如，肿瘤抑制基因的丢失可引发结肠息肉。一个关键的例子是APC，它是Wnt/β-连环蛋白通路的调节因子。DNA错配修复基因（如MutS Homolog 2）的突变也有类似的影响（Gaynor等人，2025年；Kumari等人，2025年；Plut等人，2025年）。虽然手术仍然是主要的治疗手段，辅助化学药物用于对抗转移（Su等人，2024年），但现有疗法在晚期病例中的生存益处有限。
天然产物因其安全性、低毒性和成本效益而成为有前景的替代品（Dong等人，2024年；Pye等人，2017年）。其中，枳果（Fructus aurantii，Citrus aurantium L.的未成熟果实）传统上用于治疗胃肠道疾病，包括腹泻和腹部胀气（Luo等人，2023年）。临床前研究表明，枳果提取物可以减轻硫酸葡聚糖（DSS）诱导的小鼠结肠炎并预防结肠炎相关的癌变（Patil等人，2009年；Zhu等人，2020年）。从枳果中分离出的主要黄酮苷类化合物新橙皮苷（NHP）具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化和抗癌作用（Erdem等人，2024年；Wang等人，2021年）。尽管具有潜力，但NHP在结直肠肿瘤发生中的确切作用及其机制仍不明确。
随着CRC从正常结肠上皮长期发展为腺瘤，炎症微环境在肿瘤发生和进展中起着关键作用（Zhang, Huang等人，2024年）。这一过程受到肠道微生物群的显著影响，微生物群通过复杂的宿主-微生物相互作用积极塑造了炎症环境（Chang，2024年；Zhu等人，2025年）。特定的病原菌，如Fusobacterium nucleatum，以及促炎细菌，如Bacteroides fragilis，通过基因毒性和免疫抑制等机制直接促进致癌信号通路（Martin-Gallausiaux等人，2024年；Sears等人，2014年）。抗代谢疗法和免疫疗法，如5-氟尿嘧啶和抗CTLA-4抗体的使用，其效果因个体肠道微生物谱的不同而异，某些菌株可增强治疗效果，而另一些则会引起不良反应（Letertre等人，2020年；Zhou等人，2022年）。值得注意的是，肠道微生物群的失调现在被认为是CRC发病的驱动因素和结果。最近的机制研究表明微生物群在调节抗肿瘤免疫中的作用。产生丁酸盐的细菌增加了细胞毒性T细胞的浸润，而Akkermansia muciniphila促进了调节性T细胞的分化，以对抗过度炎症状态（Liu, Yang等人，2022年）。益生元纤维和多酚通过富集抗炎菌群来发挥化学预防作用，这些菌群产生丁酸盐以增强肠道屏障功能并抑制促肿瘤炎症（Cheng等人，2025年；Sreenesh等人，2025年；Zhang等人，2025年）。
我们之前的研究表明，NHP通过TLR4/NF-κB抑制途径抑制DSS诱导的结肠炎。然而，其对结肠炎相关结直肠癌（CAC）的影响尚不清楚。特别是，NHP是否与Wnt/β-连环蛋白通路相互作用或调节CAC中的肠道微生物群尚不清楚。本研究探讨了口服给药的枳果来源NHP在小鼠模型中减轻炎症驱动的结肠癌发生的能力。我们采用了改进的酶辅助水相萃取（eaATPE）方法获得高纯度NHP，随后进行了体内和计算机模拟研究，以探讨其与Wnt/β-连环蛋白通路关键调节因子的相互作用。同时进行了粪便微生物群分析，以评估微生物变化及其与癌症预防的关联。这些方法共同提供了NHP同时调节宿主信号通路和肠道微生物群的证据，从而提升了其作为CRC替代干预措施的潜力。

**2. 材料与方法**
2.1. 样品、化学品和试剂
干燥的枳果来自中国重庆的Tongliang。
化学品和溶剂：标准参考化合物（纯度≥98%）、NHP和橙皮素（HPT）购自ACMEC（中国上海）。无水乙醇、(NH4)2SO4、磷酸、乙腈、四氢呋喃（均为HPLC级）以及分析级羧甲基纤维素（CMC）、氯化钠、异丙醇、氯仿和甲醛购自Macklin（中国上海）、Honeywell（美国新泽西州）、Ever Bright Enterprise Development（中国上海）和Chuandong Chemical（中国重庆）。
生化试剂：阿佐氧甲基烷（AOM，Sigma，美国特拉华州）、硫酸葡聚糖（DSS，MP Biomedicals，中国上海）、阿司匹林（Cisen Pharmaceutical，中国山东）、Trizol（Thermo Fisher Scientific，美国）、无菌无内毒素水和PBS（Solarbio Science & Technology，中国北京）。
试剂盒：Hifair III 1st Strand cDNA合成SuperMix和Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（Yisheng Biotechnology，中国上海）；用于白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、单核细胞趋化因子1（MCP-1）、超氧化物歧化酶（SOD）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、髓过氧化物酶（MPO）和β-连环蛋白（Enzyme-linked Biotechnology，中国上海）的小鼠ELISA试剂盒。
免疫组化试剂：针对IL-1β（兔多克隆抗体，Abcam，ab9722）、TNF-α（兔单克隆抗体，Abcam，ab183218）、caspase-3（兔多克隆抗体，Abcam，ab4051）和β-连环蛋白（兔单克隆抗体，Abcam，ab32572）的一抗；HRP偶联的山羊抗兔二抗（Abcam，ab205718）；3,3'-二氨基苯啶（DAB）显色剂试剂盒（Gene Tech，GT1002）；用于抗原回收的柠檬酸缓冲液（pH 6.0）（Gene Tech，GT1003）；3%过氧化氢（Sigma-Aldrich，H1009）；山羊血清（Solarbio，SL038）；中性树脂 mounting medium（Solarbio，S2150）。
2.2. 使用eaATPE从枳果中提取NHP
提取方法基于我们之前的报告进行了修改（Li等人，2024年）。将干燥的枳果粉碎并通过40目筛网筛选。将0.5克筛过的粉末放入50毫升离心管中，加入4.2克硫酸铵和10.4克水以确保充分混合。随后加入5.4克乙醇和0.05克复合酶混合物（中性蛋白酶与果胶酶的比例为1:1，w/w），使用磁力搅拌器混合后，在50°C水浴中孵育2小时。然后进行137瓦的超声处理30分钟。提取物进行真空过滤，并在分离漏斗中分层。上层液体倾出并在4°C下过夜沉淀以去除大部分硫酸铵。在500×g下离心10分钟后，将上清液在氮气流下浓缩至5毫升。最后，溶液通过0.22微米微孔膜过滤。得到的eaATPE溶液在4°C下避光保存以备后续处理。
2.3. NHP的纯化
按照我们的方法，使用Newstyle（Hanbon Sci. & Tech., 江苏，中国）半制备型LC系统进行纯化和分离。色谱条件如下：反相C18柱（250毫米×9.4毫米，5微米）；流动相：甲醇/0.11摩尔/升醋酸水溶液（45:55，v/v，pH 3）；流速：3.5毫升/分钟；柱温：室温；检测器：双波长UV检测器（λ1 = 284纳米，λ2 = 330纳米）；样品注射：0.5毫升eaATPE提取物。收集11.8至12.8分钟之间洗脱的组分。纯化产物通过旋转蒸发（60°C，15毫巴）干燥，得到淡黄色粉末。为了鉴定和检查产品的纯度，将部分粉末溶解在甲醇中，然后分别在Agilent 1260 LC系统（美国圣克拉拉）和Bruker Impact II Q-TOF（德国不来梅）高分辨率质谱仪（HRMS）上进行UV光谱扫描和正离子模式的全扫描分析，m/z范围为50–1300。
2.4. 动物实验
动物实验遵循ARRIVE指南和国家研究委员会的实验室动物护理标准，并获得了重庆教育学院儿童营养与健康发展合作创新中心的动物实验伦理委员会批准（批准号2024022603B，2024年2月26日）。
体重为25.0±2.5克的雄性C57BL/6小鼠适应一周，可自由获取水和标准颗粒饲料。将40只小鼠随机分为四组：正常对照组、AOM/DSS模型组、阿司匹林组和NHP组，每组10只。适应期后，除正常组外的所有小鼠均接受腹腔注射AOM（10毫克/千克）。注射一周后，小鼠自由饮用超纯水七天，随后替换为2.5% DSS溶液七天。之后，小鼠饮用普通自来水14天。这个21天的周期重复三次。在三个周期中，每天通过胃灌胃给正常组和模型组小鼠注射0.2毫升0.5% CMC-Na水溶液，而阿司匹林组和NHP组分别给予等量的阿司匹林和NHP（100毫克/千克体重，溶于0.5% CMC-Na水溶液中）。实验结束时，通过眶静脉穿刺采集血液样本，并在4°C下以1500×g离心15分钟，然后分离血清并储存在-80°C。切除整个结直肠，并记录肿瘤数量和结肠长度。部分结肠用4%甲醛固定。测量肝脏、肾脏和脾脏的重量，并计算器官指数（器官重量/体重比）。

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**图1. NHP的分子结构和光谱特性以及动物实验的设计。**
(A) NHP的化学结构；从枳果中提取和纯化的NHP的UV吸收光谱和HRMS。
(B) 动物实验流程图，包括分组、给药和每个治疗的关键时间点。
2.5. 小鼠血清和组织中蛋白质水平的测定
结肠组织在PBS中匀浆，收集上清液用于实验。根据ELISA试剂盒的说明，测定组织和小鼠血清样本中的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17和MCP-1以及氧化应激指标SOD、iNOS、MPO和MMP-2的浓度。使用ELISA试剂盒测定结肠组织中的β-连环蛋白浓度。
2.6. 结肠组织的组织学和免疫组化分析
为了进行组织病理学评估，结肠组织用4%甲醛固定，包埋在石蜡中，切成4微米厚的切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色。
对于免疫组化（IHC）染色，切片在二甲苯中脱蜡，通过分级乙醇系列重新水化，然后在柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中微波处理15分钟进行抗原回收。用3% H2O2封闭内源性过氧化物酶活性10分钟，随后在室温下用3%山羊血清孵育30分钟以减少非特异性结合。切片在4°C下与IL-1β、TNF-α、caspase-3和β-连环蛋白的一抗（1:200稀释）孵育过夜。用PBS洗涤后，切片在室温下与HRP偶联的山羊抗兔二抗孵育1小时。使用3,3'-二氨基苯啶（DAB）作为显色剂显色，然后用苏木精复染。最后，切片脱水、透明处理并用中性树脂封片。
**2.7. 结肠组织中mRNA表达的测定**
通过qPCR测定小鼠结肠组织中GSK-3β、β-连环蛋白、E-钙粘蛋白、Lgr5、CD44、c-Myc、cyclin D1和survivin的mRNA表达水平。小鼠结肠组织用Trizol试剂匀浆。均质化后，加入200微升氯仿，充分混合溶液，然后将混合物置于冰上15分钟。离心后，加入异丙醇，再次充分混合溶液，静置20分钟。接着在4°C下以18,600×g的离心力离心20分钟。弃去上清液，加入75%乙醇洗涤RNA，然后以18,600×g的离心力离心15分钟。使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。按照以下顺序向8孔板的每个孔中加入试剂：10微升SYBR Green PCR Master Mix、4微升无菌超纯水、2微升引物（见表S1）和2微升cDNA。实时PCR仪器设置初始变性温度为95°C，持续10分钟，随后进行40个循环：95°C变性15秒、60°C退火30秒、60°C延伸30秒。最后，使用2-ΔΔCt方法计算目标基因mRNA的表达水平，以β-actin作为内参基因。

2.8. 肠道微生物群分析
使用SDS方法从小鼠粪便样本中提取基因组DNA。使用引物515F和806R扩增16S rRNA基因的V4高变区。PCR扩增在Bio-Rad T100 Thermal Cycler（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）上进行。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用GeneJET Gel Extraction Kit（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）进行纯化。纯化的扩增子通过Illumina HiSeq平台（Illumina，San Diego，CA，USA）进行双端测序。原始测序数据使用QIIME 2软件进行处理，包括DADA2插件进行质量过滤、嵌合体去除和去噪。将重复序列归类为具有99%同一性的扩增子序列变异体（ASVs）。进一步进行生物信息学分析，包括Venn图分析、α和β多样性分析、分类组成分析以及线性判别分析效应大小（LEfSe）分析。

2.9. 分子对接
采用Forli等人（2016年）的方法，通过分子对接预测NHP和HPT与Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白（如β-catenin）的结合行为。实验使用AutoDock 4.2软件进行。从RCSB蛋白质数据库中获取蛋白质3D结构，去除共结晶配体和水分子后上传到对接平台。配体3D构象来自PubChem数据库的SDF文件，通过Gasteiger方法分配氢原子和电荷。对接采用刚性受体/柔性配体协议，允许配体在蛋白质结合腔内的网格框内自由移动。应用Lamarckian遗传算法，默认参数下最大化结合模式的数量至100种。分析排名最高的结合姿势和亲和力，并使用Biovia Discovery Studio 24.1可视化具有最高亲和力的最佳蛋白质-配体复合物。

2.10. 统计分析
数据使用R统计软件4.3.0进行分析，并用GraphPad Prism 8.0可视化。连续变量以平均值±标准差表示。首先通过Shapiro–Wilk检验评估数据分布的正态性，然后使用Levene检验评估方差齐性。对于方差齐性的正态分布数据，进行单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey的诚实显著差异（HSD）检验。当假设不成立或分析非正态分布数据时，应用Welch的ANOVA，然后进行Games–Howell事后检验以考虑方差不等性。统计显著性定义为p < 0.05。

3. 结果
3.1. 通过eaATPE高效高纯度分离NHP
eaATPE是一种分离技术，利用目标化合物在不相溶水相之间的选择性分配，实现一步同时提取和初步纯化（Ahmed等人，2021年）。酶促水解使用特定酶催化目标物质的特定化学结构降解。这种方法具有高效、反应条件温和、产物结构可控和环境影响低等优点。通过整合这些方法，我们采用酶辅助的水相两相萃取eaATPE从FA原料中分离NHP。植物组织通过蛋白酶/果胶酶水解分解，嵌入的黄酮类化合物（包括NHP）在超声作用下被释放并提取。NHP进一步通过半制备色谱纯化，HRMS分析显示准分子离子峰位于m/z 633.1787，对应[M + Na]+（图1A），去卷积后的分子式为m/z 611.1976（C28H34O15）。此外，紫外吸收光谱结果与NHP参考标准一致。纯化产品的纯度超过99.5%，产量为每克干FA粉末92.27 ± 2.13毫克NHP，优于我们之前开发的超声辅助ATPE过程和其他传统方法（详见补充图S1）。这种优化后的方案能够生产足够量的高纯度NHP，以满足动物实验的需求。

3.2. NHP减轻小鼠CRC的表型特征
与正常对照组相比，接受AOM/DSS处理的小鼠表现出慢性结肠炎样病理变化，表现为极度显著的体重下降（-29.02%，p < 0.0001）和结肠缩短（-23.39%，p < 0.0001）（图2A和B）。NHP的效果与阿司匹林相当，显著逆转了这些效应，增加了结肠长度并减轻了体重下降。组织病理学评估显示AOM/DSS模型组小鼠的远端结肠和直肠区域有肿瘤。与未处理的模型小鼠相比，NHP和阿司匹林处理的小鼠肿瘤数量显著减少（p < 0.0001），肿瘤体积也较小（图2C）。系统器官指数（定义为器官重量与体重的比率）在模型小鼠中显著升高（肝脏和肾脏：p < 0.0001；脾脏：p < 0.01），反映了全身炎症。NHP和阿司匹林均使这些指数恢复正常（图2D-F）。这些发现表明NHP具有抗炎和抗肿瘤作用。

3.3. NHP改善结肠组织的炎症、氧化应激和组织病理学特征
与正常小鼠相比，AOM/DSS模型小鼠的促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17和MCP-1）水平显著升高（图3A），反映了炎症反应的加剧。同时，图3B显示的氧化应激参数表明SOD活性降低，这是抗氧化能力的指标，而iNOS、MPO和MMP-2的表达升高，共同表明氧化损伤和细胞外基质重塑增加。NHP处理有效地将这些促炎细胞因子和氧化应激标志物恢复正常，其效果与阿司匹林处理相当。

3.4. NHP对小鼠血清中炎症和氧化生物标志物的影响
如表1所示，模型组的SOD血清水平显著降低，而其他蛋白质水平在所有组中最高（p < 0.05）。这些结果证实了模型小鼠的全身炎症和氧化应激状态。经过阿司匹林和NHP处理后，SOD血清水平升高，而其他生物标志物的水平不同程度降低。与阿司匹林相比，NHP在恢复正常血清生物标志物水平方面表现更好或相当。

3.5. NHP抑制Wnt/β-catenin信号通路和β-catenin核转运
经典的Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤发展中起关键作用，被认为是致癌的关键信号级联（Janeeh等人，2025年）。在这个通路中，β-catenin在Wnt关闭状态下被GSK-3β和其他蛋白质组成的破坏复合体磷酸化。随后，磷酸化β-catenin被蛋白酶体降解，抑制Wnt信号通路。在Wnt开启状态下，稳定积累在细胞质中的β-catenin进入细胞核，启动下游目标基因（如c-Myc和cyclin D1）的转录，这些基因共同调节细胞行为并促进结直肠癌的发生（Wang、Sun等人，2024年）。因此，我们检测了小鼠结肠组织中这些Wnt/β-catenin信号相关因子的表达。如图4A（左两个面板）所示，ELISA和mRNA表达分析显示AOM/DSS组的总β-catenin蛋白和转录本水平显著增加。为了直接评估β-catenin的亚细胞分布，我们对每个实验组的结肠组织切片进行了免疫组化染色（图4B）。在正常对照组中，β-catenin主要位于细胞膜上，细胞质和细胞核中的染色很少。相比之下，AOM/DSS处理的小鼠结肠组织中β-catenin在细胞质和细胞核中的积累显著增加，表明Wnt/β-catenin通路异常激活。NHP处理（100 mg/kg）显著降低了细胞核和细胞质中的β-catenin信号，恢复了类似于阿司匹林处理小鼠的膜主导模式。此外，对核/细胞质β-catenin信号比（图4A中的第三个条形图）的定量分析显示，NHP显著降低了这一比率，为免疫组化证据中β-catenin核转运受到抑制提供了定量支持。总之，这些发现表明NHP通过阻断β-catenin进入细胞核来抑制Wnt/β-catenin信号通路。

3.6. NHP对小鼠血清中炎症和氧化生物标志物的影响
如表1所示，模型组的SOD血清水平显著降低，而其他蛋白质水平在所有组中最高（p < 0.05）。这些结果证实了模型小鼠的全身炎症和氧化应激状态。经过阿司匹林和NHP处理后，SOD血清水平升高，而其他生物标志物的水平不同程度降低。与阿司匹林相比，NHP在恢复正常血清生物标志物水平方面表现更好或相当。阿司匹林和NHP均显著上调了GSK-3β的表达，并抑制了β-连环蛋白的积累，从而抑制了这一通路的活性。图4C还显示，在模型组中，包括c-Myc、cyclin D1、survivin和CD44在内的下游致癌基因的转录显著增加。阿司匹林和NHP处理有效地缓解了这些变化，其中NHP在恢复survivin、Lgr5和CD44的表达方面更为有效。NHP还部分恢复了结肠组织中的E-连环蛋白表达，这可能有助于隔离细胞质中的β-连环蛋白并抑制其转移潜力。

3.6. 通过对接模拟预测Wnt/β-连环蛋白通路靶点
进行了分子对接实验，以研究NHP及其肠道微生物群衍生物hesperetin（HPT）与小鼠β-连环蛋白（PDB ID: 1I7X；Huber & Weis, 2001）之间的结合相互作用。预测NHP与小鼠β-连环蛋白结合的最低能量为-3.2 kcal/mol。作为NHP的较小苷元衍生物，HPT与β-连环蛋白表现出多价结合特性。每个结合能量（kcal/mol）的四种最高排名构象分别显示在图4D中：① -5.5, ② -5.3, ③ -5.2, 和 ④ -5.0。NHP（-3.2 kcal/mol）和HPT（-5.0至-5.5 kcal/mol）的预测结合能量表明它们具有低到中等的亲和力相互作用，NHP较弱的结合表明其直接靶向潜力有限。HPT通过常规的氢键、碳-氢相互作用以及多种类型的疏水相互作用（如π-π、π-烷基和π-σ相互作用）与小鼠β-连环蛋白结合，原子间距离为2.9–6.6 ?。低能量结合位点的分布表明，多个HPT分子同时占据β-连环蛋白表面区域在热力学上是可行的。这可能会改变蛋白质的表面拓扑结构，并在空间上阻碍其与内源性信号分子的正常相互作用。

为了更好地预测临床相关性，还使用了人类β-连环蛋白结构（PDB ID: 1JDH；Graham et al., 2001）进行了对接研究。预测NHP与人类β-连环蛋白结合的最低能量同样为-3.2 kcal/mol。相比之下，HPT与人类β-连环蛋白的结合亲和力略弱。四种最高排名构象的结合能量分别为-4.7, -4.4, -4.3, 和 -4.2 kcal/mol（补充图S2），其结合位点与小鼠β-连环蛋白中的不同。值得注意的是，人类β-连环蛋白上排名最高的结合位点靠近小鼠结构中识别的位点②，共享一个包含Leu263、His264、Gln266、Glu267、Gly268和Lys270氨基酸残基的共同结合口袋。这些物种间结合亲和力和位点分布的差异表明可能存在微妙的结构变异，这可能影响配体的相互作用特异性。

进一步评估了NHP和HPT对小鼠其他Wnt通路蛋白的结合亲和力。预测的相互作用在补充表S2和补充图S3及S4中有所体现，这些相互作用暗示了对通路调节的潜在多效性，将在后续章节中详细讨论。

3.7. NHP对小鼠肠道菌群组成的影响
我们通过16S rRNA测序分析了四个实验组的小鼠粪便样本中的肠道微生物群组成。维恩图（图5A）显示所有组共有247个共享的ASVs，而正常组具有最多的独特ASVs（464个），其次是NHP组（209个）、阿司匹林组（182个）和模型组（134个）。主坐标分析（PCoA）和非度量多维缩放（NMDS）（图5B–C）显示各组之间的微生物群结构有明显差异。与正常组相比，AOM/DSS组形成了一个清晰的簇，证实了肠道微生物稳态的破坏。阿司匹林和NHP干预在正常组中部分恢复了这种平衡。

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图5. AOM/DSS诱导的结肠癌小鼠及干预组中肠道微生物群的结构变化。(A) 所有组肠道微生物群中扩增子序列变异（ASVs）的维恩图。(B) 基于Bray–Curtis距离的主坐标分析（PCoA），椭圆代表95%置信区间。(C) 基于Bray–Curtis距离的非度量多维缩放（NMDS）分析（应力=0.063）。(D) α-多样性指数：Chao1、Shannon和Simpson指数。(E) 六个主要门类相对丰度的组间差异。(F) Firmicutes/Bacteroidota比率。(G-H) (G) 门类和(H) 属水平的相对丰度堆叠条形图。(I) LEfSe分析组间差异（LDA得分>3.0）。数据以平均值±标准差（每组n=10）表示。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001; ns，无显著性。对于图(E)部分，Desulfobacterota和Verrucomicrobiota的数据使用Brown–Forsythe ANOVA后进行Games–Howell事后检验。其余数据使用单因素ANOVA后进行Tukey多重比较检验。（关于此图例中颜色的解释，请参阅文章的网络版本。）

α-多样性指标（Chao1、Shannon和Simpson指数）在模型组中显著降低（p < 0.01，图5D）。NHP处理将微生物丰富度（Chao1）和多样性（Shannon/Simpson）恢复到与阿司匹林组相当的水平（p < 0.05）。在门类水平上（图5E-G），AOM/DSS组的Firmicutes增加了34.2%，Desulfobacterota增加了7倍，Proteobacteria增加了11倍，而Verrucomicrobiota几乎被完全清除。NHP干预有效地抵消了这些失调，Firmicutes/Bacteroidota比率降低到接近正常小鼠的水平。

属水平分析（图5H）显示了显著的变化。Akkermansia是Verrucomicrobia的唯一肠道成员，在模型组中下降到0.11%，但经过NHP处理后恢复到5.16%。Desulfovibrio（Desulfobacterota的成员）在模型组中的过度生长（7.48%对比正常组的0.97%）被阿司匹林抑制到4.60%，进一步被NHP降低到3.76%（p < 0.05）。LEfSe分析（图5I）显示Dubosiella是NHP组中富集的标志性属（LDA得分>4.46），这与Treg/Th17免疫反应的重新平衡和黏膜屏障功能的增强有关（Zhang, Tu等，2024）。这些结果共同表明，NHP干预产生了微生物群调节作用，通过恢复关键分类群和微生物群落结构来缓解CRC相关的失调。

4. 讨论
本研究探讨了NHP在AOM/DSS诱导的结肠癌小鼠模型中的抗肿瘤机制。我们重点关注了其对Wnt/β-连环蛋白信号传导和肠道菌群失调的多靶点抑制作用，以及其抗炎和抗氧化应激效应。为了评估NHP的有效性并阐明其分子机制，我们首先使用改进的eaATPE方法从原始FA材料中收集了足够量的高纯度NHP。这种提取方法结合了高效性和有效的初步杂质去除，仅需一步纯化过程，从而消除了传统方法通常所需的耗时多步骤纯化程序。

动物实验的结果表明，100 mg/kg体重的NHP处理显著抑制了肿瘤负担和结肠缩短。NHP还减少了促炎细胞因子的表达和氧化应激生物标志物。值得注意的是，在NHP处理的小鼠中观察到的MCP-1水平的显著降低（图3A）为潜在机制提供了间接见解。MCP-1是一种关键的趋化因子，负责单核细胞/巨噬细胞向炎症部位的募集（Singh等，2021）。NHP处理对MCP-1的显著抑制表明巨噬细胞向结肠黏膜的浸润趋化信号减弱。这一解释得到了我们的H&E染色结果的支持（图3C），该结果显示NHP处理的小鼠结肠固有层中的炎症细胞浸润减少。总体而言，这些观察结果表明，巨噬细胞来源的细胞因子（如IL-1β和TNF-α）水平的降低至少部分归因于巨噬细胞募集的减少，而不仅仅是驻留细胞对细胞因子产生的直接抑制。

NHP的保护效果与相同剂量的阿司匹林相当或更优。口服阿司匹林可以预防高风险患者的CRC。最近的一项研究证实，患有遗传性结肠癌（Lynch综合征）的患者如果每天服用600 mg阿司匹林四年，可以将风险降低59%，并且保护效果可持续超过20年（Burn等，2020）。根据FDA推荐的体表面积换算，600 mg/60-kg的人体等效剂量相当于123 mg/kg的小鼠剂量，我们选择的100 mg/kg剂量处于这一计算等效剂量的可接受范围内。多项独立的体内研究也支持了NHP的相同剂量选择，这些研究显示NHP在类似剂量下具有疗效：Lu等（2020）报告称100 mg/kg NHP显著减轻了高脂饮食喂养小鼠的肥胖、胰岛素抵抗和肠道菌群失调；Gong等（2019）证明50和100 mg/kg NHP通过改变肠道微生物群、诱导细胞凋亡和抑制血管生成来抑制结肠肿瘤发生；Cao等（2025）的最新研究证实100 mg/kg NHP通过抑制NF-κB/p65和MAPK通路来预防结肠炎相关的结肠癌。此外，这一剂量在药理学上基于生物利用度和安全性考虑。作为黄酮苷类化合物，NHP以大量形式到达结肠，在那里它被微生物降解为其苷元hesperetin，产生的结肠组织浓度足以发挥生物活性，同时远低于欧洲化学品管理局建议的LD50值（大鼠≥5000 mg/kg）。因此，本研究中通过灌胃给予100 mg/kg NHP。然而，我们认识到单剂量设计无法评估剂量-反应关系。未来需要包含多个剂量水平（例如25、50和100 mg/kg）的研究来表征NHP的剂量-反应曲线，并确定CRC化学预防的最小有效剂量。

NHP对Wnt通路抑制和微生物调节之间的观察到的协同作用特别引人注目，这是对以往研究的一个关键进展。以往的研究要么专注于Wnt/β-连环蛋白通路（Cao等，2025；Liu, Xiao等，2022），要么单独研究其他通路（例如TLR4/NF-κB、MAPK）。其他人则单独研究肠道微生物群（Garrett, 2019；Wong & Yu, 2023）。相比之下，本研究将病理轴（即炎症、氧化应激、Wnt/β-连环蛋白信号传导和肠道微生物群）相互联系起来，提供了其在CAC预防中的多机制作用的综合视图。此外，我们的发现揭示了微生物菌群失调与Wnt过度激活之间的显著关联，表现为Firmicutes/Bacteroidota比率升高与肿瘤组织中β-连环蛋白水平升高之间存在强正相关（R = 0.859，p < 0.05）。这一观察结果与新兴的肿瘤微生物组假说一致（Li等，2025），并通过识别一种破坏这一致病轴的饮食黄酮类化合物进一步扩展了这一框架。最近的进展开始认识到细胞身份和先天免疫通路在分子层面是相互交织的，WNT/β-连环蛋白信号传导和免疫通路（如NF-κB）之间存在相互作用（de Vries等，2025）。我们的发现表明NHP同时减少了炎症细胞因子的产生并抑制了Wnt/β-连环蛋白的活性，这与这一演变中的范式一致。然而，这些效应是来自直接的通路相互作用还是独立的平行机制仍有待阐明。此外，我们区分了NHP的微生物群调节效应和其苷元代谢物hesperetin的潜在直接靶点结合，并确定Dubosiella为NHP富集的标志性属，该属具有已记录的免疫调节特性（Zhang, Tu等，2024）。这些特定贡献之前尚未与NHP联系起来。与这些发现一致，最近关于berberine在AOM/DSS诱导的CAC中的抗肿瘤作用的研究表明，肠道微生物群-氨基酸代谢-Wnt信号通路轴在介导治疗机制中起着关键作用（Wang, Ma等，2024），进一步支持了这一综合机制框架的相关性。

Wnt信号通路的失调，特别是经典的Wnt/β-连环蛋白通路，与CRC的肿瘤发生、生长和转移密切相关。该通路的关键成分，包括APC、axin、casein kinase 1α（CK1α）和GSK-3β，在生理条件下形成一个降解复合体，介导β-连环蛋白的泛素化和降解（Caspi等，2008）。然而，AOM/DSS的处理可以引起这些成分的变化，例如GSK-3β的下调，从而破坏这一复合体，导致β-连环蛋白的异常稳定和细胞质积累，随后转移到细胞核。在细胞核内，β-连环蛋白与T细胞因子/淋巴样增强因子（TCF/LEF）家族蛋白结合，激活下游目标基因（如c-Myc、cyclin D1和survivin）的转录，最终促进细胞增殖、存活和干性维持（J. Liu等，2022）。Wnt/β-连环蛋白信号的持续激活不仅推动了结直肠癌（CRC）的起始，还通过调节上皮-间充质转化（EMT）相关转录因子的表达，直接增强了肿瘤的侵袭性和转移潜力（Sun等人，2024年）。EMT是一个动态的细胞过程，在此过程中，上皮细胞失去了其特征性特征并获得了间充质表型，导致CRC细胞的运动性、侵袭性和抗凋亡能力增强。与免疫组化和核/细胞质比例数据一致（图4A-B），NHP处理直接抑制了结肠上皮细胞中β-连环蛋白的核转位，提供了首个视觉证据，表明NHP在体内阻断了Wnt通路激活的关键步骤。我们推测NHP可能以不同的形式和在Wnt/β-连环蛋白信号通路的不同阶段产生干扰作用。首先，NHP直接调节β-连环蛋白和GSK-3β的表达。它增加了GSK-3β的表达，但抑制了β-连环蛋白的合成，导致β-连环蛋白的净积累减少，从而损害了该分子在信号通路中的功能。其次，HPT是NHP的肠道微生物群衍生的代谢物，可以在计算机模拟中与β-连环蛋白结合，改变其表面特性并破坏其与其它蛋白质的相互作用。人类和啮齿动物的肠道微生物群都能降解NHP，其中HPT是其主要代谢物之一（Zhang等人，2014年；Zhao等人，2022年），我们在NHP组的小鼠粪便样本中发现了HPT。值得注意的是，作为去除亲水糖苷部分的苷元，HPT的膜通透性优于其前体NHP。分子对接结果还显示，HPT与β-连环蛋白的结合能显著低于NHP，进一步支持了其结构适应性，能够与细胞内蛋白质结合。β-连环蛋白的核转位由核孔复合体（NPC）蛋白介导。其中一个关键成分是核孔蛋白50（Nup50），其FG重复区域引导蛋白质的核外结合和细胞质-核运输（Holzer等人，2021年）。为了评估HPT结合对小鼠β-连环蛋白-Nup50相互作用的影响，我们使用了Yan等人2020年引入的策略，在HDOCK服务器（http://hdock.phys.hust.edu.cn/）上进行了蛋白质-蛋白质对接模拟。能量上最有利的对接构象显示在补充图S3中。与未结合的β-连环蛋白相比，β-连环蛋白-HPT复合物与Nup50的FG核心区域的结合得分降低了13.7%（补充表S2）。此外，结合界面上相互作用的氨基酸对数量从58对减少到45对。这些发现表明，HPT的结合破坏了β-连环蛋白对Nup50的亲和力，从而阻碍了其通过NPC的核导入。第三，NHP和HPT可能干扰Wnt及其膜受体的组装。当分泌型Wnt蛋白与Frizzled家族的七次跨膜受体的细胞外域结合时，经典的Wnt信号通路被启动（Liu等人，2024年）。鉴于Frizzled-1在结肠癌中的高表达（Chong等人，2002年），我们研究了NHP和HPT结合对小鼠Frizzled-1与其经典配体Wnt7b之间分子相互作用的影响。这两种小分子都与Frizzled-1的细胞外FZ域形成稳定的复合物，FZ域参与与Wnt配体的结合。如补充图S4所示，NHP和HPT与FZ域结合的两个最有利的构象分别表现出-6.34/?5.19 kcal/mol和-6.39/?5.81 kcal/mol的结合能。蛋白质-蛋白质对接模拟进一步显示，FZ-NHP（25.1%）和FZ-HPT（21.0%）的对接得分低于未结合的FZ域。界面氨基酸对数量分别从>100对减少到61对和75对（补充表S2）。这些结果表明，NHP/HPT的结合降低了Frizzled-1对Wnt7b的亲和力，这一机制类似于已知的分泌蛋白抑制剂如Wnt抑制因子（WIF）和Cerberus（Alsaedi，2016年；Li等人，2023年）。这些抑制剂通过阻断配体-受体相互作用来拮抗经典的Wnt信号通路激活。在Wnt/β-连环蛋白信号激活后，积累的β-连环蛋白转位到细胞核中，与TCF/LEF家族蛋白形成转录复合物，从而上调对CRC发病机制至关重要的致癌靶点。在这些多个靶点中，c-Myc通过调节参与细胞周期进展和代谢重编程的基因来驱动增殖（Fatma等人，2022年）。Cyclin D1通过与CDK4/6激酶的结合直接介导G1/S期的转换，其过表达加速了细胞周期进展并导致基因组不稳定（Hengstschl?ger等人，1999年）。Survivin通过抑制凋亡和促进有丝分裂进展来增强肿瘤存活（Fang等人，2024年）。Lgr5是一种干细胞标记物，维持癌干细胞的自我更新能力并驱动肿瘤起始和化疗耐药性（Leung等人，2018年）。CD44通过与透明质酸相互作用并调节基质重塑来促进EMT和转移（Primeaux等人，2022年）。我们的发现表明，NHP干预导致这些靶点的转录下调（图4C）。这种抑制破坏了c-Myc和cyclin D1带来的增殖优势，通过消耗Survivin减少了生存优势，并减弱了癌干性（Lgr5）和转移潜力（CD44），共同抑制了AOM/DSS诱导的CRC模型中的肿瘤发生。越来越多的证据强调了肠道微生物群在致癌过程中的关键作用。微生物多样性和丰度的失调与CRC进展密切相关（Helsingen & Kalager，2022年）。在这项研究中，NHP干预引发了CRC小鼠模型中肠道微生物组的显著变化。例如，在门水平上，与正常小鼠相比，模型小鼠中的Firmicutes/Bacteroidota比例显著升高。这种不平衡可能是由慢性炎症和系统性炎症引起的，这是结肠炎相关CRC的标志性特征。NHP处理显著降低了F/B比例，使其接近健康小鼠的水平，同时部分恢复了肠道微生物组的多样性。NHP干预还选择性地调节了关键微生物类群。最显著的是，它增加了益生菌属如乳杆菌和Akkermansia的丰度，其效果超过了传统阿司匹林治疗（图5H）。这些有益细菌在CRC小鼠中表达不足。乳杆菌是一种特征明确的益生菌，它产生乳酸以抑制病原菌（Huligere等人，2022年），增强肠道屏障，并调节免疫反应（Huang等人，2022年）。Akkermansia产生降解黏蛋白的酶和代谢物，从而增强屏障完整性和缓解炎症（Liu等人，2021年）。最近的一项研究揭示了A. muciniphila是通过Wnt信号通路在肠毒素大肠杆菌诱导的肠道炎症模型中缓解肠道屏障损伤的关键菌株（Ma等人，2025年）。有趣的是，某些乳杆菌物种具有糖苷水解能力。例如，Lactobacillus rhamnosus具有β-葡萄糖苷酶和α-鼠李糖苷酶活性，可将hesperetin-7-O-rutinoside和naringenin-7-O-rutinoside转化为各自的苷元（Pereira-Caro等人，2018年）。这些底物通常具有通过α-1,2或α-1,6键连接的α-L-鼠李糖和β-D-葡萄糖。重组α-鼠李糖苷酶能有效切割naringin、rutin和neohesperidin二氢查尔酮中的此类结构（de Lise等人，2016年）。因此，NHP可能作为益生元，支持能够进行类似糖苷降解的有益肠道微生物的增殖和代谢活动。释放的HPT则可以通过上述Wnt/β-连环蛋白调节机制对宿主产生生物活性效应。相反，NHP有效抑制了CRC相关病原菌的丰度。在CRC模型小鼠中，Desulfovibrionaceae、Proteobacteria和Turicibacter等类群在微生物组中占主导地位（图5I）。Desulfovibrionaceae产生有毒的硫化氢，与肠道上皮损伤、慢性炎症以及与腺瘤和CRC相关的DNA突变有关（Karnachuk等人，2021年）。Proteobacteria在CRC患者中通常升高，被认为是一种促炎类群，通过微生物失调和炎症促进肿瘤发展（Huligere等人，2022年）。Turicibacter在CRC模型中富集，可能会加剧肠道炎症和代谢紊乱（Hamada等人，2023年）。值得注意的是，NHP处理的小鼠显示出这些有害类群的减少，同时有益类群如Dubosiella、Allobaculum和Coriobacteriales的增加。这些类群维持了微生物群平衡并产生短链脂肪酸。它们具有抗炎作用，增强肠道屏障功能，并调节免疫和代谢途径（Ma等人，2022年）。总的来说，我们的发现强调了肠道微生物群稳态在CRC调节中的关键作用。NHP干预可能通过将肠道微生物组重新平衡为更健康的状况来缓解CRC进展，从而抑制促炎和致癌的微生物活动，同时促进保护性类群的增殖。这些结果与强调将微生物群靶向疗法作为传统CRC治疗辅助手段的新范式一致。虽然这项研究提供了NHP作为CRC预防的天然多靶点和多机制剂的初步证据，但仍需考虑几个限制。首先，我们的细胞因子数据不能明确区分特定细胞类型对细胞因子产生的直接抑制和炎症细胞浸润的减少。其次，尽管我们通过免疫组化和定量核/细胞质比例分析直接观察到了β-连环蛋白的核转位，但仍需要直接的功能读数（例如TCF/LEF报告基因测定）来完全确定因果关系。第三，观察到的微生物变化是驱动表型益处还是仅仅反映了这些益处仍有待澄清，计算结合相互作用需要生物物理验证。进一步的研究可以探索这些方向，包括细胞类型特异性分析、在人类CRC细胞系中的功能测定、粪便微生物群移植和耗尽，以及表面等离子共振或分子动力学模拟来验证蛋白质-配体相互作用。这些努力将加强机制洞察力，并澄清NHP化学预防效应背后的因果关系。

**作者贡献声明**
Leng Han：撰写-原始草稿，项目管理，资金获取，正式分析，数据管理。
Xuting Wang：撰写-原始草稿，可视化，验证，方法学，调查，正式分析。
Qundi Wang：撰写-审阅与编辑，验证。
Chenlu Zhao：撰写-审阅与编辑，数据管理。
Jiying Zhang：验证，软件。
Xingyao Long：撰写-原始草稿，项目管理，方法学，概念化。
Jianming He：可视化，正式分析。
Tenghui Zhang：调查。
Shanshan Chen：调查，数据管理。
Zhigao Sun：监督，资源，项目管理。
Yujiao Cheng：撰写-审阅与编辑，资金获取。
Yanling Fan：方法学，资金获取。
Guijie Li：撰写-审阅与编辑，撰写-原始草稿，可视化，验证，监督，方法学，调查，资金获取，正式分析，概念化。

**伦理声明**
动物实验按照ARRIVE指南和国家研究委员会的实验室动物护理标准进行，并得到了重庆教育学院儿童营养与健康发展合作创新中心的动物实验伦理委员会的批准（批准号2024022603B，2024年2月26日）。

**资金来源**
本研究由重庆市自然科学基金（项目编号CSTB2023NSCQ-MSX0282）、中央高校基本科研业务费（项目编号SWU-KR22050、SWU-KQ22057和SWU-KF25039）、西南大学校企合作项目（F2025816、4412500525和2021001318）以及宜宾市高层次人才启动计划项目（2023QH04）资助。