《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Complete genome sequence and description of Escherichia coli isolated from fresh vegetables in Baghdad, Iraq
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生鲜蔬菜和新鲜蔬菜、罐装番茄沙拉及烹饪酱料是帮助构成健康餐盘的常见且良好的方式。然而，与水果和蔬菜相关的食源性疾病暴发数量有所增加，其中大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）是最常检出的病原体。某些形式的大肠杆菌是病原体，可导致人类严重
生鲜蔬菜和新鲜蔬菜、罐装番茄沙拉及烹饪酱料是帮助构成健康餐盘的常见且良好的方式。然而，与水果和蔬菜相关的食源性疾病暴发数量有所增加，其中大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）是最常检出的病原体。某些形式的大肠杆菌是病原体，可导致人类严重的健康问题，如溶血性尿毒综合征、出血性结肠炎和腹泻。本文描述了从伊拉克巴格达蔬菜中分离的大肠杆菌的完整基因组序列。本研究对50份蔬菜样品（采集自不同市场）进行了大肠杆菌污染检测。细菌分离株通过形态学、培养学和分子鉴定进行了表征，其中包括全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）（二代测序）。研究结果表明，50份样品中有3份（2份黄瓜和1份芹菜）存在大肠杆菌，占总数的6%。基于多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing, MLST），这三个分离株属于两个序列型（Sequence Types, STs），分别为ST223和ST1737。基因组组装显示大肠杆菌分离株的基因组大小约为4.8 Mb，GC含量约为50.7%。WGS还显示，这些细菌分离株表现出多种抗菌素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）机制，包括外排泵、酶修饰和调控决定因子。系统发育树分析显示，这些测序分离株与大肠杆菌O104:H4密切相关。本研究结果强调了需要持续开展基因组研究，以追踪细菌分离株的出现及其对公共卫生的潜在影响。
研究背景与意义
大肠杆菌是一种存在于人类和动物肠道等多种环境中的细菌。虽然部分菌株有益，但肠产毒性、肠致病性和产志贺毒素大肠杆菌等致病菌会导致严重的食源性疾病。生鲜农产品（如黄瓜、卷心菜、生菜和芹菜）被致病性大肠杆菌污染是一个重要的食品安全问题，这主要源于受污染的水源灌溉、运输储存过程中的卫生条件差以及清洗不充分等因素。尽管分子诊断工具不断发展，但在许多国家，尤其是伊拉克，针对生鲜产品中大肠杆菌的检测与监测仍面临挑战，缺乏足够的基因组数据来评估其多样性和耐药谱，限制了有效的风险监控。因此，研究人员旨在通过对伊拉克蔬菜中分离的大肠杆菌进行全基因组测序，为食品安全和抗菌素耐药性监测提供基线数据。该研究成果已发表于《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》。
关键技术方法
研究人员收集了2022年1月至2月期间采自伊拉克巴格达多个市场的50份新鲜蔬菜样本（包括番茄、黄瓜、卷心菜、生菜和芹菜各10份）。研究采用了多种分子生物学技术：首先利用选择性培养基进行细菌分离，随后通过VITEK 2系统进行抗菌药物敏感性测试（Antimicrobial Susceptibility Testing, AST），并采用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术检测uidA基因及毒力基因（stx1, stx2, eae）。核心的全基因组测序使用Illumina MiSeq平台完成，测序数据经SPAdes组装后上传至细菌与病毒生物信息学资源中心（Bacterial and Viral Bioinformatics Resource Center, BV-BRC）进行注释，利用RAST工具包（RASTtk）进行基因预测，并通过星型抗菌素耐药性（Staramr）流程进行MLST分型及耐药基因分析，最后利用RAxML构建系统发育树。
研究结果
3.1 细菌分离株与药敏试验
对50份蔬菜样本的分析显示，基于形态特征、VITEK 2系统和分子工具确认了3株大肠杆菌分离株（占比6%），分别命名为Eco5、Eco6和Eco8。药敏试验结果显示，这三株菌对所有被测抗菌药物均表现为完全敏感，未检测到表型耐药。
3.2 细菌分离株的分子检测
使用uidA基因特异性引物对三株大肠杆菌进行检测，扩增出了预期大小（259 bp）的片段，且无非特异性反应，证实了分离株的分子身份。
3.3 利用PCR检测毒力基因
PCR筛查结果显示，在三株大肠杆菌分离株中均未检测到主要的致病性大肠杆菌毒力基因，包括stx1、stx2和eae。
3.4 多位点序列分型（MLST）
对三株大肠杆菌进行MLST分析揭示了显著的遗传多样性。Eco5归属于序列型ST223，而Eco6和Eco8则同属ST1737谱系。
3.5 基因组组装与注释
基因组组装结果显示，三株菌的基因组长度约为4.8 Mb，GC含量约为50.7%，符合大肠杆菌的典型特征。在编码序列（Coding DNA Sequences, CDS）、转运RNA（transfer RNA, tRNA）和核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）基因计数上存在差异，其中Eco5的CDS数量最多（4893个），而Eco6的tRNA数量最高（80个）。
3.6 功能基因组学
对蛋白特征的分析表明，三株菌在通路相关蛋白和酶的功能上具有高度保守性，绝大多数蛋白具有功能分配，且跨属蛋白家族（PATRIC cross-genus family, PGfam）和属特异性蛋白家族（PATRIC genus-specific family, PLfam）的注释结果相似。
4. 基因组注释分布
4.1 子系统分析
通过环状图谱展示了基因组注释的分布情况，从外向内依次为重叠群（Contigs）、正链CDS、负链CDS、RNA基因、抗菌素耐药性基因同源CDS、毒力因子同源CDS、GC含量及GC偏移。子系统分析涵盖了细胞代谢、蛋白质加工、抗菌素与毒力机制、氧化磷酸化、膜转运、DNA复制修复与重组、细胞过程、转录、RNA加工、细胞壁以及调控与细胞信号传导等生物学过程。
4.2 特色基因
特色基因分析显示，三株菌在抗生素耐药性、药物靶点、转运蛋白和毒力因子方面的基因数量存在差异。其中，抗生素耐药性基因在CARD和PATRIC数据库中的注释结果相对稳定（76-77个 vs 61-62个）。
4.3 抗菌素耐药性基因
研究鉴定了多种抗菌素耐药性机制及其相关基因，包括抗生素激活酶（如KatG）、抗生素失活酶（如BlaEC家族β-内酰胺酶）、抗生素耐药基因簇（如MarRAB操纵子）、抗生素靶标保护蛋白（如BcrC）、外排泵系统（如AcrAB-TolC、MacAB-TolC等）以及调节抗生素耐药基因表达的调控因子（如H-NS, OxyR）。
4.4 细菌分离株的系统发育分析
系统发育分析表明，Eco5与大肠杆菌O104:H4 str. 2011C-3493聚为一支，支持率较高（97）；Eco6与该参考菌株关系最为密切，支持率达100%；Eco8也位于该菌株附近，但形成独立分支，支持率为63%。所有样本均更接近于大肠杆菌群而非志贺氏菌分支。
结论与讨论
该研究首次报道了伊拉克蔬菜中大肠杆菌分离株的全基因组测序与分析。尽管分离率较低（6%），但WGS数据为该地区食源性病原体的分子监测建立了基线。MLST结果显示ST223和ST1737的存在，反映了大肠杆菌的遗传灵活性及其适应不同生态位的能力。尽管基因组中检测到了多种耐药机制相关基因（如外排泵和调控元件），但表型药敏试验却显示为全敏感，这种基因型与表型的差异可能归因于特定突变、过表达或环境触发因素，表明蔬菜相关大肠杆菌分离株目前的抗菌素耐药性表达水平较低，但仍具有潜在的耐药储备。此外，毒力基因的缺失表明这些分离株可能属于共生或非致病性菌株。综上所述，该研究强调了持续进行基因组监测以追踪新兴谱系及其对公共卫生潜在影响的必要性。
