CD34+ 细胞衍生的内皮细胞在移植肝脏中调控血管和免疫系统的重塑

《Journal of Hepatology》：CD34+ cell-Derived Endothelial Cells Orchestrate Vascular and Immune Remodeling in the Transplanted Liver

　　

陈瑞涵|李新强|朱鹏伟|易学文|王婷|陈慧|黄学音|叶国国|蒋静宇|Ong Meiching|江柳军|李亚丽|钟思毅|何阳燕|范蓉|张博欢|李洪军|蔡金珍|郑树森|徐庆波|张洪坤

中国浙江省医科大学附属第一医院血管外科

摘要

背景

内皮细胞（ECs）的损伤是肝脏移植（LT）后急性细胞排斥反应的起始因素。然而，移植后新生儿内皮细胞的起源和特性仍存在争议。我们的目标是揭示移植后内皮细胞之间相互作用的机制，并开发一种针对内皮细胞的策略以减轻移植排斥反应。

方法

利用来自13个人类和4只小鼠肝脏移植物中的单细胞RNA测序，我们绘制了内皮细胞的功能图谱。在CAG;R26-tdTomato和Cd34-CreER^T2;R26-tdTomato小鼠中进行同种异体原位移植，确认了内皮细胞的细胞起源。我们使用CellChat、多重免疫组化和体外共培养模型来研究内皮细胞与T细胞之间的相互作用机制。通过基于血小板的生物递送系统，我们实现了CXCL12单克隆抗体（αCXCL12）的靶向递送，以减轻排斥反应。

结果

移植肝脏中的内皮细胞具有双重起源，既来自供体也来自受体。受体来源的内皮细胞表现出高CD34表达、高干细胞特性和促炎特性。结合遗传谱系追踪小鼠和原位移植模型，我们发现受体CD34⁺细胞来源的内皮细胞在移植后两周达到峰值，四周后下降，这与排斥反应的峰值一致。我们确定CD34⁺内皮细胞通过CXCL12-CXCR4轴和共刺激分子招募并增强Th1和细胞毒性CD8⁺ T细胞。反过来，细胞毒性CD8⁺ T细胞通过Caspase1-GSDMD途径诱导CD34⁺细胞来源的内皮细胞发生凋亡。装载了αCXCL12的血小板能够特异性地靶向移植肝脏中的内皮细胞，减少T细胞浸润并减轻排斥反应。

结论

我们发现了一群受体CD34⁺细胞来源的内皮细胞，它们通过CXCL12-CXCR4轴激活T细胞，从而加剧了急性排斥反应，并提出了一种基于血小板的递送策略，能够精确靶向内皮细胞的CXCL12受体，有效预防急性细胞排斥反应。

影响和意义

我们收集并整合了人类和小鼠肝脏移植物中的单细胞转录组数据，阐明了内皮细胞的双重细胞起源和功能图谱。我们构建了谱系追踪小鼠，以追踪同种异体小鼠原位肝脏移植模型中的CD34⁺细胞命运，证明了受体CD34谱系内皮细胞在肝脏移植物血管生成中的作用。CD34谱系内皮细胞通过CXCL12-CXCR4轴招募T细胞，并通过共刺激分子激活它们。使用基于血小板的生物递送策略中和CD34谱系内皮细胞中的CXCL12，可以减轻T细胞介导的排斥反应。这项研究为肝脏移植后的新型免疫抑制方案提供了基于内皮细胞的视角和方案。

引言

肝脏移植（LT）后免疫稳态的重塑是决定肝脏移植物长期存活的核心临床问题。1 移植后，受体来源的细胞迅速取代了供体细胞。2 缺血-再灌注损伤（IRI）、手术应激和同种异体抗原暴露共同引发了供体和受体免疫细胞的异常激活，3 从而导致排斥反应或移植物功能障碍。尽管目前的免疫抑制方案可以控制排斥反应，但它们难以完全重建免疫耐受性。4 由于剂量调整导致的亚临床排斥率达到了15-20%，导致并发症如移植物纤维化和胆管消失综合征。5, 6, 7 更令人担忧的是，长期免疫抑制带来感染、肿瘤复发和代谢综合征等重大风险。8, 9 这些并发症迫切需要具有更强靶向性、疗效和安全性的新型抗排斥策略。

以往的研究主要集中在移植肝脏中免疫细胞的动态变化和功能调节上，10, 11 忽视了非免疫细胞（尤其是内皮细胞）的核心作用。作为移植物和受体免疫系统之间的主要接口，内皮细胞直接暴露于受体来源的免疫细胞和细胞因子的免疫原性刺激下。内皮细胞在移植物排斥中扮演双重角色，既是同种免疫攻击的目标，又是免疫反应的主动调节者。12 它们通过主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）呈现抗原，通过选择素或ICAM-1/VCAM-1粘附招募白细胞，并通过分泌IL-1/MCP-1放大炎症，从而维持排斥级联反应。3, 13 尽管内皮细胞在LT后的免疫调节作用逐渐得到认可，但它们的空间和功能特性以及深入的细胞间相互作用机制仍然是该领域的重要知识空白。研究表明肝脏内皮细胞具有异质性，其中门静脉内皮细胞通过高表达MHC-II和共刺激因子表现出增强的抗原呈递能力，14 而肝脏窦状内皮细胞（LSECs）通过PD-L1/PD-1信号通路诱导免疫耐受。15 然而，移植肝脏中内皮细胞的空间和功能异质性尚未得到充分表征，其细胞起源仍存在争议。供体来源的内皮细胞可能通过内皮-间充质转化发生表型重塑，16 而受体内皮前体分化为功能性内皮细胞的直接证据尚缺乏。

CD34⁺细胞广泛分布于骨髓、外周血和各种组织中，分化为内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞等，在组织修复和免疫调节中起关键作用。17 CD34⁺细胞通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）分化为功能性内皮细胞，参与新血管形成。18 研究表明，CD34⁺细胞在器官缺血期间迁移到损伤部位，通过VEGF-Notch信号通路分化为内皮细胞并形成新的血管，从而改善微循环和器官功能。19 然而，CD34⁺细胞是否参与肝脏内皮细胞的修复仍不清楚。在这项研究中，我们结合了人类和小鼠移植物中的单细胞RNA测序（scRNA-seq），揭示了移植肝脏中内皮细胞的异质性。使用谱系追踪小鼠原位移植模型，我们发现了一群受体CD34⁺细胞来源的内皮细胞，它们通过CXCL12-CXCR4轴招募和激活T细胞。最后，我们成功使用血小板递送的CXCL12单克隆抗体减轻了急性细胞排斥反应，提供了一种新的针对内皮细胞的免疫抑制疗法。

节片段

材料与方法

本研究获得了舒兰（杭州）医院研究伦理委员会（KY2024088）和浙江大学医学院附属第一医院临床研究伦理委员会（IIT20230262B-R1, IIT20210018B-R2）的批准。我们回顾性地收集了供体肝脏活检和移植后针刺活检标本的石蜡包埋组织，进行全面的组织病理学分析。从健康志愿者的血液样本中分离出PBMCs。

LT后内皮细胞发生深刻的重塑

为了研究LT后内皮细胞的变化，我们分析了供体和LT后的人类肝脏组织（图S1A；表S1）。CD34和CD31的免疫组化显示肝脏移植物中的门脉血管密度显著减少（图1A，B）。然后我们在C57BL/6J作为供体、C3H/HeJ作为受体的小鼠中建立了同种异体原位移植模型，在移植后1周和4周对移植物进行了scRNA-seq，每个时间点取2个样本（图S1B；图1C）。无监督聚类

讨论

以往的研究主要集中在移植物中免疫细胞的起源上。11, 28 肝脏是一个高度血管化的器官；33 肝脏内皮细胞表现出显著的异质性和空间分区，在肝脏免疫中起关键作用。34, 35 尚未研究肝脏移植物中内皮细胞的细胞起源。我们的研究结合了人类和小鼠的scRNA-seq，发现具有最高受体嵌合性的CD34⁺内皮细胞表现出独特的功能特性，包括强大的

CRediT作者贡献声明

H.K.Z.、Q.L.和Q.B.X.构思了项目并设计了研究；R.H.C.在X.W.Y.、T.W.和X.Y.H.的帮助下进行了研究、数据分析和解释；X.Q.L.和P.W.Z.进行了生物信息学分析；G.G.Y.、J.J.Y.、M.C.O.、Y.Y.H.、R.F.和X.H.L.协助了体外和动物实验；R.H.C.、H.C.和Y.L.L.进行了小鼠肝脏移植模型；B.H.Z.和X.Y.H.培育了转基因小鼠；R.H.C.撰写并修订了手稿；X.Q.L.

伦理批准

该研究获得了浙江大学医学院附属第一医院和舒兰（杭州）医院临床研究伦理委员会的批准。所有参与研究的患者均获得了知情同意。

数据可用性声明

所有数据均可在手稿或补充材料中找到，需经作者同意。

财务支持声明

本工作得到了国家自然科学基金（W2541023、82572036、82370496、32330046）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有竞争利益。

致谢

我们感谢Ren Zongna博士和Luo Jiangyun博士在生物信息学分析和研究内容方面的帮助。我们感谢OE Biotech有限公司（中国上海）提供RNA序列和单细胞RNA序列。模型图是用BioRender.com创建的。