对经过和未经CD14+磁选处理的单核细胞衍生的巨噬细胞进行比较

《Journal of Immunological Methods》：A comparison of monocyte-derived macrophages with and without prior CD14+ magnetic sorting

　　朱莉娅·托梅（Julia Thomé）、约翰内斯·泽勒（Johannes Zeller）、蒂埃里·克里斯特曼（Thierry Christmann）、巴拉兹斯·博格纳（Balazs Bogner）、迈克·林德（Maike Lind）、玛丽·德雷克（Marie Dreck）、特蕾莎·Z·布罗斯（Teresa Z. Brose）、劳拉·施奈德（Laura Schneider）、弗兰齐斯卡·潘克拉茨（Franziska Pankratz）、希娜·克鲁扎勒（Sheena Kreuzaler）、斯蒂芬·U·艾森哈特（Steffen U. Eisenhardt）
来自德国弗赖堡大学医学中心和医学院的整形与手外科系

**摘要**
**引言**
在涉及巨噬细胞的体外研究中，有效的单核细胞衍生巨噬细胞（MDM）分离和细胞培养方案至关重要。然而，目前尚不清楚分离步骤在提高纯度或引发细胞变化方面到底能起到多大作用。本文通过比较采用CD14+磁分离（sMac）或通过塑料吸附分离后洗涤步骤（uMac）从白细胞减少（LRS）室中分离出的巨噬细胞的特性和功能，来评估磁分离的必要性。

**方法**
使用密度梯度离心法从LRS室中分离PBMC（外周血单核细胞）。通过磁分离去除淋巴细胞来富集sMac，而uMac则是通过塑料吸附和洗涤步骤从PBMC中分离出淋巴细胞。两组细胞在相同的条件下培养，以促进粘附后的单核细胞向巨噬细胞的分化。通过流式细胞术、qPCR、明场显微镜和共聚焦显微镜评估形态、纯度、细胞活力、表面标记物表达以及刺激下的细胞因子生成情况。

**结果**
超过75%的巨噬细胞从uMac和sMac中成功培养出来。uMac（54%）和sMac（48%）的细胞活力相似。sMac的CD14表达显著较高（89.48%对比uMac的65.91%），但CD14的平均荧光强度没有显著差异。CD80和CD163的表达以及刺激后的促炎细胞因子生成也均无显著差异。

**结论**
LRS室是一种可靠且高产的MDM培养来源。由于两种方法产生的巨噬细胞在表型和功能上具有可比性，我们的研究结果表明，对于大多数体外应用来说，磁分离CD14+并不一定是必需的。

**引言**
巨噬细胞是单核吞噬细胞系统（MPS）的重要组成部分，在先天性和适应性免疫中发挥着关键作用（Biswas等人，2012年；Johnston，1988年）。这些组织 resident 细胞表现出显著的异质性，执行多种功能（Davies等人，2013年；Wynn和Vannella，2016年），包括呈递抗原、进行吞噬作用以及通过产生细胞因子参与免疫调节（Epelman等人，2014年；Fujiwara和Kobayashi，2005年；Ross等人，2021年；Kiefer等人，2024年）。传统上认为巨噬细胞分为促炎型（M1）和抗炎型（M2）两种亚型，但现在认识到它们在体内具有广泛的表型谱（Vogel等人，2014年；Xue等人，2014年；Mills等人，2000年；Sp?rlein等人，2024年）。巨噬细胞的起源可以是胚胎来源的，也可以是由单核细胞分化而来，并可能因炎症而被激活（Epelman等人，2014年）。单核细胞同样属于MPS，起源于骨髓，在外周血液中存活1-2天后补充巨噬细胞（Ziegler-Heitbrock，2014年；Zeller等人，2018年；Zeller等人，2021年；Kiefer等人，2021年；Ginhoux和Jung，2014年）。巨噬细胞能够产生多种细胞因子，这使它们成为测量其激活状态的有效工具（Cavaillon，1994年）。由于表型和细胞因子输出会随组织环境和炎症状态而变化（Jenkins和Allen，2021年；Gordon和Martinez-Pomares，2017年），因此需要可靠的体外模型来保持相关表型（Gordon和Martinez，2010年）。

在体外实验中，巨噬细胞通常来源于骨髓或人单核细胞（MDM）（Toda等人，2021年）。这些单核细胞可以从全血、白细胞减少系统（LRS）室中分离出来，并在粘附到塑料表面后分化成巨噬细胞。由于多种因素，培养巨噬细胞可能是一个劳动密集型过程。为了获得足够的细胞数量，通常需要多次从自愿献血者那里采集血液。自愿献血者中约有2%可能会出现不良反应（Smajic等人，2023年）。同时，白细胞减少系统的可用性越来越低，且含有的细胞数量较少，而LRS室则越来越容易获得，成为一种有价值的替代方案（Dietz等人，2006年）。因此，我们将重点放在LRS室作为高产的人单核细胞来源上。

为了获得单核细胞，使用密度梯度离心技术分离外周血单核细胞（PBMC）。除了单核细胞外，PBMC主要还包含淋巴细胞。单核细胞通过塑料吸附转化为巨噬细胞，这一过程尤其在淋巴细胞存在的情况下可能具有激活作用。随后，许多作者建议在生成巨噬细胞之前先通过磁分离去除淋巴细胞（sMac）（Kelly等人，2018年；Rios等人，2017年）。磁分离分为基于特定表面抗原表达的正选择和基于缺乏某些表面标记物的负选择。关于磁分离过程本身，其对细胞的影响尚不完全清楚。不同方法和供应商可能会产生不同的细胞表现（Marques等人，2018年；Hornschuh等人，2022年；Bhattacharjee等人，2017年）。也有作者描述仅通过塑料吸附和洗涤步骤去除淋巴细胞（uMac）（Nielsen等人，2020年）。这种方法上的不一致性提出了一个重要的实际问题：磁分离是否真的能改善巨噬细胞的表型和质量，还是仅仅是增加了成本和处理时间而并无实际益处？

在这里，我们提供了一种实用的、高产的从LRS室生成人类MDM的方案，无需进行磁分离。我们直接比较了sMac和uMac在时间上的形态变化、存活率、表面表型以及刺激后的细胞因子生成情况，从而对这两种方法进行了并行评估（图1A）。通过直接比较在相同条件下从分选细胞和未分选细胞中获得的巨噬细胞，我们旨在明确磁分离CD14+是否是一个必要的步骤，还是一个不必要的程序复杂步骤。

**材料与方法**
所有缓冲液和抗体列在表1和表2中。

**从白细胞减少系统中分离单核细胞**
LRS室从弗赖堡大学医学中心的输血医学和基因治疗研究所收集。检查LRS室中的红细胞污染情况，并丢弃红细胞含量高的腔室（见附加文件1）。由于LRS室内的细胞活力受到极大限制，所有腔室均在收到后30分钟内进行处理。

**磁分离CD14+（不含CD16+）**
对于sMac，使用EasySep? Magnetic Beads Monocyte Isolation Kit CD14+ without CD16+ depletion（STEMCELL Technologies，科隆，德国，编号19058）从PBMC中分离单核细胞。计数细胞后，将细胞沉淀物稀释或重新悬浮至5×10^7细胞/毫升。将细胞悬浮液转移到5毫升聚苯乙烯圆底管中，并加入富集混合液（40微克/毫升）。在冰上孵育10分钟后，加入40微克/毫升的磁性颗粒。

**巨噬细胞培养**
对于uMac，通过流式细胞术（图1B）根据FSC/SSC确定相同LRS室中PBMC中的单核细胞频率。根据单核细胞频率，若单核细胞比例<25%，则每平方厘米接种1.5×10^6个PBMC；若单核细胞比例>25%，则每平方厘米接种1×10^6个PBMC。图1B显示了正确的操作顺序。必须一致执行此步骤，否则可能会以错误的密度接种细胞，导致失败。

**流式细胞术分析**
收获后，根据制造商说明用Zombie NIR（1:100）漂洗细胞，并用CellFix?（BD Biosciences，美国弗兰克林湖）固定细胞。使用抗-CD14-Pacific Blue（1:50，M5E2，RRID: AB_397041）、抗-CD80-APC（1:50，REA661，RRID: AB_2751432）和抗-CD163-PE（1:50，GHI/61.1，RRID: AB_2819470）对固定细胞进行表面抗体染色。为了测量细胞内细胞因子，将细胞用25微克/毫升的LPS刺激6小时。

**RT-qPCR检测细胞因子表达**
细胞在6孔板中与25微克/毫升的LPS或PBS共同孵育6小时，然后用PBS洗涤1次再进行RNA提取。所有试剂、耗材和工作台在提取前都用RNase Away（7705–11，Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）处理。使用标准酚/氯仿（6340.4，Roth，德国卡尔斯鲁厄）方案和Qiazol Lysis Reagent（79,306，Qiagen，荷兰芬洛）从细胞中提取总RNA。

**免疫细胞化学和共聚焦显微镜**
为了详细分析巨噬细胞及其组成，进行了共聚焦成像。单核细胞按照上述方法接种在ibiTreat μ-Slides VI 0.4（Ibidi? GmbH，德国格拉费尔芬）上。七天后，用PBS彻底洗涤细胞，并用3.7%的PFA固定20分钟。然后用0.1%的Triton X-100通透细胞，再用1%的BSA封闭20分钟。添加抗-β-actin（1:40，A2228，RRID: AB_476697）并进行二次染色。

**讨论**
在我们的实验中，单个LRS室可产生超过1.5×10^9个PBMC，这与先前的报告一致（Dietz等人，2006年；Néron等人，2007年）。所有实验中的单核细胞比例在15.4%到35.2%之间，平均为22.7%。使用上述方案，可以根据PBMC中单核细胞的频率在25平方厘米的培养瓶中接种40到60个细胞。

**结论**
在本研究中，我们建立了一种可靠的从LRS室培养MDM的方案，并直接解决了巨噬细胞研究中的一个常见方法学问题：磁分离CD14+是否真的有必要获得功能性的巨噬细胞？我们比较了两种巨噬细胞生成方法：从未分选的单核细胞（uMac）和经过磁分离CD14+的单核细胞（sMac）生成的方法。我们评估了成功率、细胞活力、表面抗原和形态。我们的并行分析显示，磁分离CD14+并非必需的步骤。

**作者贡献声明**
朱莉娅·托梅（Julia Thomé）：撰写——初稿、项目管理、方法学、研究、数据分析、概念化。
约翰内斯·泽勒（Johannes Zeller）：撰写——初稿、项目管理、方法学、研究、概念化。
蒂埃里·克里斯特曼（Thierry Christmann）：撰写——审核与编辑、方法学、研究、数据分析。
巴拉兹斯·博格纳（Balazs Bogner）：撰写——审核与编辑、方法学、研究。
迈克·林德（Maike Lind）：撰写——审核与编辑、方法学、研究。

**伦理批准和参与同意**
不适用。

**资助**
本工作得到了德国研究基金会[DFG EI 866/10–1]对SUE的资助。

**利益冲突声明**
作者声明没有利益冲突。

**致谢**
我们感谢弗赖堡大学医学中心的Lighthouse核心设施提供的优秀支持和资源帮助。Lighthouse核心设施部分由弗赖堡大学医学院（项目编号2023/A2-Fol；2021/B3-Fol）、DKTK和DFG（项目编号450392965）资助。此外，我们还要感谢弗赖堡大学医学中心的献血中心提供的白细胞减少系统腔室。