硫代半卡巴宗-钌(II)配合物的合成、表征及其生物学研究

《Journal of Intensive Medicine》：Synthesis, characterization, and biological investigation of thiosemicarbazone-ruthenium(II) complexes

　　阿提夫·艾哈迈德（Atif Ahmad）| 安杰利卡·埃伦·格拉米尼亚（Angelica Ellen Graminha）| 阿南（Anam）| 萨乌洛·H·门德斯·阿贝（Saulo H. Mendes Abe）| 马科斯·V·帕尔梅拉-梅洛（Marcos V. Palmeira-Mello）| 萨比尔·汗（Sabir Khan）| 阿尔齐尔·阿泽维多·巴蒂斯塔（Alzir Azevedo Batista）| 弗拉基米尔·P.D. 巴达罗（Wladimir P.D. Badaró）| 塔莱斯·雷吉亚尼·德·莫拉（Thales Reggiani de Moura）| 安娜·玛丽亚·罗曼·波莱兹（Ana Maria Rom?o Polez）| 阿德利诺·维埃拉·德·戈多伊·内托（Adelino Vieira de Godoy Netto）| 若泽·克莱斯顿·梅洛·佩雷拉（José Clayston Melo Pereira）

巴西圣保罗州立大学分析、物理与无机化学系，阿拉拉夸拉（Araraquara），SP

**摘要**

合成了四种新型钌配合物Ru1–Ru4，其通用公式为 [Ru(L)(bipy)(dppb)]PF6，其中 bipy = 2,2′-联吡啶，dppb = 1,4-二(二苯基膦)丁烷，L 代表 morpholine-vanillin 硫代半卡巴唑配体（VMTSC）：L1 = 2-(3-甲氧基-4-(2- morpholinoethoxy)苯亚甲基)-肼-1-碳硫酰胺；L2 = 2-(3-甲氧基-4-(2- morpholinoethoxy)苯亚甲基)-N-甲基肼-1-碳硫酰胺；L3 = 2-(3-甲氧基-4-(2- morpholinoethoxy)苯亚甲基)-N-乙基肼-1-碳硫酰胺；L4 = 2-(3-甲氧基-4-(2- morpholinoethoxy)苯亚甲基)-N-苯基肼-1-碳硫酰胺。这些配合物通过摩尔电导率、红外光谱（IR）和紫外-可见光谱（UV–Vis）、质谱、核磁共振（NMR，包括 1H、HSQC、COSY、13C-DEPTQ 和 31P-{1H}）以及循环伏安法进行了表征。化合物的纯度通过元素分析（CHN）进行了确认。体外细胞毒性研究表明，所有化合物对肺（A549）和乳腺（MDA-MB-231）肿瘤细胞的毒性均优于顺铂，而对非癌性肺（MRC-5）和乳腺（MCF-10 A）细胞的影响较小。其中，Ru4 对 triple-negative MDA-MB-231 细胞表现出最高的毒性和选择性（IC50 = 1.30 ± 0.03 μM，选择性指数 SI = 8.3）。克隆实验显示 Ru4 具有细胞抑制作用。形态学分析表明 MDA-MB-231 细胞的形状发生了显著变化，表明发生了细胞死亡。活/死细胞荧光检测也证实了这一点，显示死亡细胞数量增加。伤口愈合实验表明 Ru4 能够抑制细胞迁移，显示出其作为转移抑制剂的潜力。DNA 结合研究表明 Ru4 与 ct-DNA 有弱相互作用。人血清白蛋白实验表明 Ru4 与蛋白质有中等程度的自发相互作用，这种相互作用由疏水作用稳定。总体而言，这些发现表明 Ru4 是未来开发抗癌化合物的有希望的候选者。

**引言**

癌症是全球主要的死亡原因之一，导致大量人员死亡，并对全球健康产生重大影响[1]。根据国际癌症研究机构（IARC）和其他国际卫生组织的最新报告，预计到2050年全球将有约3500万例癌症病例，而2022年报告的病例约为2000万例[2]、[3]、[4]。最常见的癌症类型包括乳腺癌、肺癌和结直肠癌[5]。值得注意的是，乳腺癌主要发生在女性身上。一种特别具有侵袭性的亚型—— triple-negative 乳腺癌（TNBC）的治疗选择有限，复发和转移的可能性较高，预后较差[5]。这种侵袭性主要是由于缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体-2（HER2）的免疫组化表达，使得内分泌和靶向疗法无效。因此，传统化疗仍然是 TNBC 的主要治疗方法[6]、[7]。

金属配合物在新型化疗药物的开发中是一个非常活跃的领域[8]。基于铂的化合物在癌症治疗中取得了显著成功，现在超过50%的临床化疗方案都使用了这些化合物，例如卡铂[10]、奥沙利铂[11]、奈达铂[12]、洛巴铂[12]和七铂[12]。尽管 Pt(II) 药物已被证明具有治疗效果，但其临床应用仍受到副作用和耐药性发展的限制。为了解决这些问题和限制，研究人员开始探索含有替代金属的新化合物的设计[13]。在这方面，钌配合物因其独特的作用机制和相对较低的毒性而受到广泛关注[13]。这类化合物通常具有八面体结构，允许配体在配位球内发生多种位移，使其不易被生物解毒剂失活[14]。许多钌化合物正在体外和体内模型中进行研究[15]，例如 NKP1339[16] 和 TLD1433[17]，其中 NAMI-A[16] 曾经进入临床试验但后来终止。含有药用活性分子的钌配合物的开发为发现创新的抗癌疗法提供了战略途径[18]、[19]、[20]。其中，钌(II)–膦配合物因其催化应用而闻名，最近由于其化疗潜力而受到广泛关注[13]、[21]、[22]、[23]、[24]。通常，引入膦配体可以显著提高钌配合物的亲脂性、稳定性、细胞穿透性和整体细胞毒性[25]、[26]、[27]。含有 Ru-膦单元的配合物已被实验证明能有效阻止乳腺和肺癌细胞的侵袭、迁移和黏附[28]、[29]、[30]。

硫代半卡巴唑类金属化合物由于在生物无机化学中的巨大潜力而受到广泛研究[31]。这类化合物通常通过直接与 DNA 相互作用或阻断参与 DNA 复制的必需酶（如核糖核苷酸还原酶和拓扑异构酶）来抑制肿瘤生长[28]。更重要的是，硫代半卡巴唑金属配合物表现出广泛的生物活性，包括抗真菌[32]、抗菌[32]、抗炎[33]、抗病毒[34] 和化疗效果[34]，显示出针对癌细胞的潜力。特别是，硫代半卡巴唑配体可以容易地与铜、锌、铂和钌等金属离子配位，这些金属离子通常对多种肿瘤细胞系表现出显著的细胞毒性[31]、[35]。

最近，我们报道了四种通用公式为 [Ru(L)(bipy)(dppb)]PF6 的钌化合物，其中 L 代表不同的香草醛–哌啶取代的硫代半卡巴唑（L = 2-(3-甲氧基-4-(2-(哌啶-1-yl)ethoxy)苯亚甲基)-N-R-肼-1-碳硫酰胺，R = H、甲基、乙基、苯基）[36]。所有这些化合物都对肺（A549）和乳腺（MDA-MB-231）癌细胞系进行了评估，显示出对 MDA-MB-231 细胞的较高治疗潜力，IC50 值在 0.99 到 3.20 μM 之间[36]。在之前的工作中，我们观察到含有用 N-乙基吗啉和 N-乙基哌啶 O-烷基化的香草醛硫代半卡巴唑的 [AgCl(PPh3)2(L)]（PPh3 = 三苯基膦）配合物对某些人类肿瘤细胞具有有希望的细胞毒性效应[37]。受此发现的启发，我们决定研究用 morpholine 替换这些硫代半卡巴唑中的哌啶是否会产生选择性更好的钌化合物。许多作者将 morpholine 结合到配体骨架中，以通过与酶靶点的有利相互作用来提高生物活性[38]。此外，morpholine 与哌啶的不同之处在于其较低的质子化程度（pKa = 7），这有助于在膜通透性和水溶性之间取得更好的平衡。此外，由于其弱碱性，morpholine 基团的存在可能利用溶酶体功能障碍，从而增强抗癌活性[39]。

因此，在这项工作中，我们报告了四种新型化合物 [Ru(Ln)(bipy)(dppb)]PF6（Ru1–Ru4），这些化合物是通过将相同的 cis-[Ru(bipy)(dppb)Cl2] 前体与各种用 N-乙基吗啉 O-烷基化的香草醛硫代半卡巴唑（L1 = 2-(3-甲氧基-4-(2- morpholinoethoxy)苯亚甲基)-肼-1-碳硫酰胺；L2 = 2-(3-甲氧基-4-(2- morpholinoethoxy)苯亚甲基)-N-甲基肼-1-碳硫酰胺；L3 = 2-(3-甲氧基-4-(2- morpholinoethoxy)苯亚甲基)-N-乙基肼-1-碳硫酰胺；L4 = 2-(3-甲氧基-4-(2- morpholinoethoxy)苯亚甲基)-N-苯基肼-1-碳硫酰胺）结合而成的。螯合剂 L1-L4 和化合物 Ru1–Ru4 的体外细胞毒性效应在癌细胞系（MDA-MB-231、A549）和非癌细胞系（MRC-5 和 MCF-10 A）上进行了测试。为了探索 Ru4 对 MDA-MB-231 细胞的化疗机制，进行了多种基于细胞的实验，包括形态学分析、克隆生成和迁移测定。还使用粘度测量、圆二色性（CD）和 Hoechst 33258 与 TO 的竞争性结合测定来研究 Ru4 与小牛胸腺 DNA（ct-DNA）之间的相互作用。此外，荧光猝灭实验评估了 Ru4 与 HSA 之间的结合相互作用。

**化学试剂**

在整个合成过程中使用了高纯度的分析级化学品。溶剂包括乙醇（C2H5OH）、甲醇（CH3OH）、二氯甲烷（CH2Cl2）、丙酮（C3H6O）和二乙醚（C3H8O）。其他关键材料包括香草醛（C8H8O3）、各种未取代的硫代半卡巴唑（甲基、乙基和苯基）、三水合钌(III)氯化物（RuCl3·3H2O）、1,4-二(二苯基膦)丁烷（dppb）、2,2′-联吡啶（bipy）和 3-甲氧基-4-[2-(morpholin-1-yl)ethoxy]苯甲醛。

**结果与讨论**

在本研究中，通过将硫代半卡巴唑配体 {Ln = 2-(3-甲氧基-4-(2- morpholinoethoxy)苯亚甲基)-N-R-肼-1-碳硫酰胺，R = H（Ru1）、甲基（Ru2）、乙基（Ru3）和苯基（Ru4）} 与 cis-[RuCl2(bipy)(dppb)] 前体结合，制备了四种新的钌化合物 [Ru[(Ln)(bipy)(dppb)]PF6]。生成的化合物为紫色、稳定且结构明确的标记 Ru1–Ru4，如图 1 所示。

**结论**

在这项工作中，合成了四种含有不同 morpholine-vanillin 硫代半卡巴唑配体的新型钌配合物 Ru1–Ru4。其中，含有苯基部分的 Ru4 显示出相对较高的细胞毒性和更好的选择性。体外研究表明，Ru4 对乳腺肿瘤细胞系（MDA-MB-231）的治疗潜力更强，而对肺肿瘤细胞系（A549）的选择性较低。

**作者贡献声明**

阿提夫·艾哈迈德（Atif Ahmad）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、软件、方法学、研究、形式分析、数据管理、概念化。
安杰利卡·埃伦·格拉米尼亚（Angelica Ellen Graminha）：撰写 – 审稿与编辑、研究。
阿南（Anam）：撰写 – 审稿与编辑。
萨乌洛·H·门德斯·阿贝（Saulo H. Mendes Abe）：方法学、研究。
马科斯·V·帕尔梅拉-梅洛（Marcos V. Palmeira-Mello）：撰写 – 审稿与编辑、研究。
萨比尔·汗（Sabir Khan）：撰写 – 审稿与编辑。
阿尔齐尔·阿泽维多·巴蒂斯塔（Alzir Azevedo Batista）：撰写 – 审稿与编辑。

**利益冲突声明**

作者声明没有利益冲突。

**致谢**

作者感谢以下巴西研究机构的财政支持：圣保罗州研究基金会（FAPESP，资助号 2019/17762-7、2022/14041-0、2023/02475-8 和 2025/06317-3）和国家科学技术发展委员会（CNPq，资助号 58307/2022-4、401770/2023-0 和 307504/2022-0）。M. V. P.-M. 感谢圣保罗州研究基金会（FAPESP，资助号 2021/01787-0 和 2025/21845-6）。本研究部分由协调委员会资助。