关于一种中温嗜冷休克蛋白CspA的结构和功能见解，精确度得到了提升

《Journal of Magnetic Resonance》：Structural and functional insights into a mesophilic cold shock protein CspA with enhanced precision

　　

Marius Wanko Nembot|Georges Feller|Alexander N. Volkov|Ulric B. le Paige|Guillaume Bouvignies|Christian Damblon

结构生物化学实验室，MolSys研究单元，列日大学，比利时列日

摘要

冷休克蛋白（CSPs）是一类高度保守的核酸结合蛋白，在细胞适应低温过程中发挥伴侣蛋白的作用。本文利用高分辨率核磁共振（NMR）光谱技术，对大肠杆菌中的CspA进行了全面的结构和动态特性分析。CspA的溶液结构（PDB ID：30IB)得到了广泛的NMR实验约束、最小的结构偏差以及有利的立体化学支持，从而确认其为一个稳定收敛的NMR结构。关键在于，我们通过结合¹⁵N Carr–Purcell–Meiboom–Gill（CPMG）弛豫扩散和¹⁵N化学交换饱和转移（CEST）实验，并结合可见光峰位约束，研究了CspA在多个时间尺度上的主链动态变化，特别是微秒至毫秒范围内的动态。据我们所知，这是首次将¹⁵N CEST、¹⁵N CPMG和可见光峰位约束相结合的方法用于探究CSPs的构象变化。研究结果表明，除了RNP1和RNP2基序中保守的芳香残基通过与核酸的π堆叠相互作用外，还有一系列广泛的疏水核心残基和暴露在溶剂中的极性残基参与了构象交换。值得注意的是，β3–β4和β4–β5环中的残基表现出复杂的动态行为，这些行为无法仅通过无模型分析方法完全解释，这突显了它们在结合位点灵活性中的作用。进一步使用AF3/YASARA模型对CspA与七聚胸苷（dT7）结合的形式进行了分析，证实了芳香残基和极性残基与单链DNA（ssDNA）碱基之间的π堆叠和离子相互作用，进一步验证了这些动态区域的功能重要性。因此，我们的发现表明CspA依赖于一个从保守基序延伸至疏水核心和灵活环的动态网络，这种网络赋予了其高效识别核酸和发挥伴侣蛋白功能所需的结构适应性。

引言

极端微生物能够在极宽的温度范围内生存，从大约?20?°C的低温环境（如生活在永久冻土和海冰中的嗜冷菌[1]），到接近或高于水沸点的高温环境（如深海热液喷口中的超嗜热菌[2]）。这些微生物进化出了精妙的细胞策略来应对极端的热应力。嗜冷菌通常在?1至10?°C的狭窄温度范围内生长[3]，而嗜热菌和超嗜热菌则需要60?°C以上的温度才能繁殖[2]。蛋白质在热适应中起着核心作用，因为它们的结构稳定性和催化功能直接受到环境温度的影响。极端微生物蛋白质的卓越热稳定性已有充分记录[4]，这主要归因于它们对热变性的适应性增强。

在微生物用来抵御温度突然变化的分子策略中，合成冷休克蛋白（CSPs）是最快速和有效的反应之一。这类蛋白存在于多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中，是进化上最保守的蛋白质家族之一。当温度突然下降时，CSPs会迅速上调，以维持细胞内稳态、稳定核酸，并促进必需蛋白质的持续翻译[3],[5],[6],[7]。

CSPs是一个高度保守的蛋白质家族[8],[9]，广泛存在于所有古菌和真细菌中，每个基因组中的CSP基因数量从Geacillus stearothermophilus的CspB和CspD两个基因到嗜温菌大肠杆菌的九个基因（CspA、CspB、CspC、CspD、CspE、CspF、CspG和CspI）不等[10]。

CSPs包含一个或多个具有核酸结合活性的冷休克结构域（CSDs）。CSDs倾向于以合作方式与单链RNA和DNA（ssRNA/ssDNA）结合，且序列特异性较低[11],[12]，但对双链DNA的亲和力很低[7],[12]。蛋白质与核酸的相互作用由保守的冷休克结构域基序RNP1（K/R-G-F/Y-G/A-F-V/I-X-F/Y）和RNP2（L/I-F/Y-V/I-G/K-N/G-L）介导，这些基序在所有CSPs中都存在细微变异[7],[13],[14],[15],[16]。这些基序使CSPs能够识别并结合核酸，这是它们作为RNA伴侣蛋白的关键特性。通过结合核酸，CSPs调节翻译过程。在低温胁迫下，RNA分子常常形成稳定的但无生产力的二级结构，从而阻碍转录和翻译。CSPs通过结合这些结构化的RNA并使其不稳定，促进有利于基因表达的单链构象的形成[17],[18]。

以往的研究使用传统和自动化的核磁共振（NMR）光谱[19],[20]以及X射线晶体学[21]方法研究了嗜温菌CspA的结构。传统NMR依赖于手动的光谱分配和基于实验获得的约束来确定结构，而自动化NMR结构确定流程[22]（包括CS-Rosetta[20],[22]）则结合了稀疏的NMR化学位移（¹H^N,¹H^α, ¹⁵N, ¹³C_α,¹³C_β 和¹³C’）与从头算蛋白质结构预测[23],[24],[25]。

尽管自动化NMR结构确定方法可以与传统的X射线晶体学方法相媲美[20]，但两种方法得到的结构质量仍有进一步提高的空间，尽管所需的改进类型不同。相比之下，CspA和CspB的分子动力学已通过NMR进行了研究[9],[26],[27]，但这些研究主要依赖于核自旋弛豫（NSR）实验结合无模型分析（MFA），该方法主要描述了皮秒到纳秒（ps–ns）时间尺度上的快速内部运动。由于MFA假设较慢的运动（微秒到毫秒时间尺度，如构象交换）仅通过额外的弛豫项R_ex来贡献，因此可能无法提供最全面的蛋白质功能洞察。迄今为止，尚未有与实验约束一致且具有微秒至毫秒时间尺度详细分子动力学的CspA结构被报道。因此，本研究旨在确定CspA的明确NMR结构，并利用先进的NMR实验来研究其动力学，以更深入地理解其功能机制。

章节片段

蛋白质表达、同位素富集和纯化

CspA的原始基因序列被合成并插入到表达载体pET22b的< />I位点。同位素标记的实验方案按照先前的描述进行了调整[28]。将含有该载体的E. coli BL21 (DE3)细胞接种到50?ml的Terrific肉汤培养基中（成分包括12?g/l Bactotryptone (Difco)、24?g/l酵母提取物 (Difco)、4?ml/l甘油、12.54?g/l K₂HPO₄、2.31?g/l KH₂PO₄，pH?7.2），培养基中还含有100?mg/l氨苄青霉素，然后进行培养

CspA的溶液NMR结构

NMR化学位移及其对应的三维结构分别存储在BMRB和PDB数据库中，编号为34,897和30IB。对于定义明确的区域（K4–L70），几乎完成了所有原子（94%的主链和87%的侧链）的分配，整体分配率为87%（733/844个原子）。与其他冷休克蛋白一致，CspA的结构显示出一种保守的折叠方式

讨论

通过对约束条件、偏差和结构偏差的比较分析，强调了实验约束在结构确定中的作用。30IB结构集合相比3MEF和2?L15结构包含了更多的实验约束，尤其是长程距离约束和二面角约束，这些对于定义整体折叠和侧链排列非常重要。这一点还得到了良好的立体化学质量的支撑，这一点从Ramachandran图谱中可以看出

结论

我们的研究对CspA的结构和动力学进行了全面分析，结合了广泛的NMR约束和多种弛豫方法来探究从皮秒到纳秒（ps–ns）以及微秒到毫秒（μs–ms）时间尺度上的运动。研究表明，构象交换不仅涉及RNP1和RNP2基序中保守的芳香残基（它们通过与核酸的π堆叠相互作用），还涉及大量疏水核心残基和暴露在溶剂中的极性残基。重要的是，还有几个

CRediT作者贡献声明

Marius Wanko Nembot：撰写——初稿、可视化、验证、软件开发、方法论设计、实验设计、数据分析、概念化。Georges Feller：撰写——审稿与编辑、实验设计。Alexander N. Volkov：撰写——审稿与编辑、实验设计。Ulric B. le Paige：撰写——审稿与编辑、方法论设计。Guillaume Bouvignies：撰写——审稿与编辑、验证、方法论设计。Christian Damblon：撰写——审稿与编辑、监督、资源协调。

[97], [98]

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

本研究使用了NMRbox：国家生物分子NMR数据处理与分析中心，这是一个生物医学技术研究资源（BTRR），该中心得到了NIH的资助（项目编号P41GM111135，NIGMS）。