基于杂交技术的三唑-咪唑-4(5H)-酮衍生物设计：作为多靶点胆碱酯酶和炎症酶抑制剂的研究——包括合成、生物活性评估及全面的计算模拟

《Journal of Molecular Structure》：Hybridization-Driven Design of Triazole-Imidazol-4(5H)-one Conjugates as Multi-Target Cholinesterase and Inflammatory Enzyme Inhibitors: Synthesis, Biological Evaluation, and Comprehensive Computational Studies

　　哈加尔·S·埃尔-赫玛（Hagar S. El-Hema）、阿德尔·艾哈迈德（Adel Ahmed）、阿亚·瓦希德（Aya Waheed）、穆罕默德·A·哈瓦塔（Mohamed A. Hawata）、莫达瑟·F·侯赛因（Modather F. Hussein）、莫娜·M·哈利法（Mona M. Khalifa）、艾哈迈德·T·埃尔亨达维（Ahmed T. Elhendawy）、赫巴·A·埃尔-赛义德（Heba A. El-Sayed）和阿德尔·A.-H·阿卜杜勒-拉赫曼（Adel A.-H. Abdel-Rahman）来自埃及底比斯高等工程学院（Thebes Higher Institute for Engineering）的基础科学系（化学专业），地址为Maadi 11434。

**摘要**
设计、合成并利用红外光谱（IR）、1H核磁共振（1H NMR）、13C核磁共振（13C NMR）、元素分析和质谱技术对一系列新型三唑-咪唑-4(5H)-酮衍生物（1–9b）进行了结构表征。生物学评估显示这些化合物对阿尔茨海默病和炎症相关通路具有潜在的多靶点活性。在合成的化合物中，8b表现出最强的活性，能够抑制乙酰胆碱酯酶（AChE，IC?? = 12.99 μM）和丁酰胆碱酯酶（BChE，IC?? = 13.72 μM）。此外，8b还对COX-1、COX-2和5-LOX具有显著的抗炎活性，其IC??值分别为14.05、14.87和16.99 μM，表明其在微摩尔范围内具有平衡的多靶点抑制特性。相比之下，9a在抗关节炎活性方面表现最佳，尤其是在蛋白质变性和蛋白酶抑制实验中表现出较强的效果，这表明其具有更选择性的生物学特性。针对整个化合物系列（1–9b）进行了与AChE和COX-2的分子对接研究，结果显示了良好的结合相互作用；而对于最活跃的化合物8b，则进行了与BChE和5-LOX的对接研究，证实其在两个活性位点上的结合能力。尽管得分最高的构象不一定代表最相关的结合形式，但对接结果仍具有参考价值。100纳秒的分子动力学模拟证实了AChE-8b、COX-2-8b和丝氨酸蛋白酶-9a复合物的结构稳定性。密度泛函理论（DFT）计算表明，8b具有较高的电子反应性，表现为较低的HOMO-LUMO能隙和较高的亲电性。ADMET和毒性预测结果显示，8b具有优异的药代动力学特性，包括良好的胃肠道吸收性、适当的脂溶性，并符合药物相似性规则，且没有严重的毒性问题。相比之下，9a和9b的极性较高，渗透性较低，但安全性仍可接受。总体而言，8b展现了有前景的多靶点抑制潜力；然而，这些发现仍处于早期候选分子阶段，需要进一步优化和实验验证才能应用于实际治疗。

**引言**
神经退行性疾病和慢性炎症性疾病等复杂疾病是由相互关联的病理机制引起的，而非单一原因[1,2]。氧化应激、胆碱能功能障碍和持续的炎症反应协同作用，推动了疾病的进展，建立了神经退行性与系统性炎症之间的机制联系[2,3]。这种重叠促使药物发现转向能够在单一分子框架内调节多种生物途径的多靶点抑制剂[4,5]。其中，阿尔茨海默病（AD）是全球痴呆症的主要原因[6,7]，而慢性炎症性疾病（如关节炎）则是长期残疾的主要因素[8,9]。在分子层面，氧化应激通过促进活性氧（ROS）的过度生成起核心作用，导致脂质过氧化、蛋白质损伤和炎症级联反应的激活[10,11]。这些过程高度关联，加强了神经元退化与慢性炎症之间的联系[2,11]，从而为针对多个疾病相关通路而非单一靶点提供了理论依据[5,12,13]。在这种情况下，乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）[14,15]因在调节乙酰胆碱水平和胆碱能神经传递中的作用而成为阿尔茨海默病的关键治疗靶点[15,16]。同时，花生四烯酸通路中的酶（包括环氧化酶COX-1和COX-2[19],[20],[21]以及5-脂氧合酶[22,23]）[22,23]负责产生与神经炎症和周围炎症性疾病（如关节炎[24]）相关的促炎介质，其中COX-2的调节已显示出治疗意义[25]。除了酶介导的通路外，蛋白质变性和蛋白酶活性也是评估抗关节炎潜力的重要生化指标。蛋白质变性与炎症反应和自身抗原形成相关，而蛋白酶则参与组织降解；因此，抑制这些过程是评估抗关节炎活性的关键指标[26],[27],[28],[29],[30]。尽管取得了显著进展，但能够同时应对这些双重且相互关联的生物学问题的单一分子实体的开发仍然有限[31],[32],[33]。这一差距凸显了合理设计多功能支架的必要性，这些支架能够与参与神经退行性和炎症过程的多种酶系统相互作用[34],[35],[36],[37]。

杂环支架因其结构多样性和与多种生物靶点的相互作用能力而在药物化学中备受重视[38],[39],[40],[41]。特别是三唑衍生物已被广泛报道为参与神经退行性和炎症性疾病的酶抑制剂[42],[43],[44],[45]。含三唑的化合物对胆碱酯酶和炎症酶表现出多靶点活性。在胆碱酯酶抑制方面，化合物I[46]表现出对AChE和BChE的双重抑制作用（IC??分别为5.10 ± 0.40 μM和5.60 ± 0.30 μM）。值得注意的是，多奈哌齐（donepezil）是一种已建立的AChE抑制剂，其效力达到纳米摩尔级别（IC?? ≈ 5–7 nM），但对BChE的抑制作用较弱（IC?? ≈ 3–5 μM）。相比之下，化合物II[47]表现出中等活性（AChE：59.9 μM；BChE：39.6 μM），活性低于加兰他敏（galantamine，分别为0.15 μM和7.9 μM）。化合物III[48]也表现出双重抑制作用（AChE：2.13 ± 0.13 μM；BChE：0.098 ± 0.018 μM），显示出该类化合物效力的变异性。对于炎症靶点，化合物IV[49]对COX-1、COX-2和5-LOX表现出平衡的抑制作用（IC??分别为325.50 nM、7.25 nM和5.43 μM），在COX-2抑制方面优于槲皮素（42.60 nM），同时保持相当的COX-1和5-LOX活性。化合物V[50]则表现出选择性的COX-2抑制作用（IC?? = 0.12 μM）、中等程度的5-LOX活性（7.73 μM）以及较弱的COX-1抑制作用；其COX-2活性与塞来昔布（celecoxib）相当，而5-LOX抑制作用与NDGA相似，表明三唑衍生物之间存在选择性差异。此外，基于三唑的化合物通过抑制蛋白质变性和蛋白酶活性显示出抗关节炎潜力，化合物VI在500 μg/mL浓度下分别实现了62.44%和46.63%的抑制效果（图1）。

咪唑和咪唑-4(5H)-酮衍生物被认为是具有显著酶抑制潜力的优质支架。在胆碱酯酶抑制方面，化合物VII[52]表现出强效的双重抑制作用（AChE：17.3 nM；BChE：27.02 nM），而多奈哌齐的AChE抑制效力为纳米摩尔级别（IC?? ≈ 5–7 nM），对BChE的抑制作用较弱（IC?? ≈ 3–5 μM），表明VII对AChE的抑制作用较强，对BChE的抑制作用更显著。相比之下，化合物VIII[53]的抑制作用较弱（AChE IC?? = 25.83 μM；BChE IC?? = 7.64 μM），活性低于依沙可林（eserine，分别为0.19 ± 0.06 μM和0.62 ± 0.08 μM）。对于炎症靶点，咪唑-4(5H)-酮衍生物IX[54]表现出选择性和强效的COX-2抑制作用（IC?? = 0.07 ± 0.034 μM），同时具有中等程度的COX-1活性（13.04 ± 1.82 μM）和显著的5-LOX抑制作用（2.17 ± 1.04 μM），显示出平衡的多靶点特性。相反，化合物X[55]的COX-2抑制作用较弱（39.43 ± 1.13 μM），但保持了显著的5-LOX活性（1.78 ± 0.09 μM），表明该类化合物在选择性上存在差异。总体而言，这些发现强调了咪唑和咪唑酮支架在调节胆碱酯酶和炎症通路方面的多功能性，支持它们作为多功能治疗剂的潜力（图2）。

基于三唑衍生物已确立的多靶点潜力，结构相关的杂环化合物（如咪唑和咪唑-4(5H)-酮支架）也因其在与多种生物靶点上的广泛相互作用能力而受到关注。为了进一步支持实验结果，进行了包括分子对接、分子动力学模拟和DFT计算在内的综合计算研究，以阐明合成化合物的结合模式和电子特性。

**合理研究**
所设计的化合物系列结合了三唑和咪唑结构，旨在抑制胆碱酯酶（AChE/BChE）、炎症酶（COX/LOX）以及蛋白质变性和蛋白酶。化合物8b作为最有效的抑制剂，在ACHE、BCHE、COX和LOX方面均优于参考化合物II、V、VII和X。8b含有Schiff碱连接（–CH=N–），增强了平面性，有助于更深入地插入AChE的活性位点。与主要通过疏水相互作用实现COX-2选择性的化合物V相比，8b引入了多个杂原子（N、O、S），从而实现了氢键和疏水相互作用的结合，扩大了抑制范围。此外，虽然化合物VII由于其刚性支架而表现出强效的胆碱酯酶抑制作用，但8b通过药效团杂化实现了与催化活性位点（CAS）和外围阴离子位点（PAS）的双重相互作用。与COX/LOX活性不稳定的化合物X不同，8b中的硫氧基（C=S）增强了极化性，支持了与LOX抑制相关的硫基相互作用。此外，酚基–OH基团有助于氢键形成和在酶活性位点内的稳定。这些特性共同解释了8b的优越多靶点抑制活性。

另一方面，化合物9a在蛋白质变性和蛋白酶抑制实验中表现出最高活性，超过了参考化合物VI。在化合物VI中，对硝基苯基部分主要通过电子吸引效应起作用，但氢键能力有限。而在9a中，将其替换为β-D-(+)-木糖单元后，引入了多个羟基，显著增强了氢键能力，改善了蛋白质结合和稳定性。此外，将VI中的疏水支架替换为咪唑酮-三唑杂化结构后，提供了额外的相互作用位点，包括氢键（咪唑酮环）、增加的灵活性（–NH–连接基）以及通过C=S基团的硫基相互作用，从而保持了必要的疏水锚定。这些结构优化解释了8b在这些实验中的优越抑制活性。

值得注意的是，尽管已有报道指出三唑衍生物（如VI）具有蛋白质变性和蛋白酶抑制作用，但基于咪唑的类似物在这些实验中仍较少被研究，这突显了本研究的创新性。因此，本研究扩展了含咪唑支架在这些生物靶点上的应用范围（图3）。

**化学部分**
合成路线（方案1）生成了三唑-咪唑-4(5H)-酮衍生物2，作为后续衍生物的关键三唑-咪唑酮支架。通过SN2机制将咪唑酮前体与乙基氯乙酸酯进行N-烷基化，得到含有活性酯基的化合物1。与硫代半缩氨基脲反应后生成中间体I，经碱性环化后得到三唑-咪唑酮杂化物2，该化合物具有硫醇-硫醚互变异构（C=S/–SH）。

**结论**
成功设计、合成并利用标准光谱和分析技术对一系列新型三唑-咪唑-4(5H)-酮衍生物（1–9b）进行了结构验证。生物学评估表明，几种化合物对阿尔茨海默病和炎症相关通路具有潜在的多靶点活性。其中，化合物8b表现出最强的活性，对AChE和BChE具有强效的双重抑制作用。

**作者贡献**
哈加尔·S·埃尔-赫玛（Hagar S. El-Hema）：概念化；方法论；研究；监督；初稿撰写；审阅和编辑；形式分析。
阿德尔·艾哈迈德（Adel Ahmed）；阿亚·瓦希德（Aya Waheed）：研究；数据管理。
穆罕默德·A·哈瓦塔（Mohamed A. Hawata）；阿德尔·A.-H·阿卜杜勒-拉赫曼（Adel A.-H. Abdel-Rahman）：概念化；方法论；监督；审阅和编辑。
莫达瑟·F·侯赛因（Modather F. Hussein）：形式分析；软件；数据管理。
莫娜·M·哈利法（Mona M. Khalifa）：研究；可视化；方法论；验证；数据管理。
艾哈迈德·T·埃尔亨达维（Ahmed T. Elhendawy）：...

**利益冲突声明**
作者声明与本文的发表不存在利益冲突。

**数据可用性**
支持本研究结果的所有数据均包含在文章及其补充信息（SI）中。SI包括红外光谱、1H核磁共振、13C核磁共振和质谱数据（图S1–S41）、详细的材料和方法（表S1–S7）以及对接图像（图S42和S43）。

**作者贡献声明**
哈加尔·S·埃尔-赫玛（Hagar S. El-Hema）：撰写 – 审阅与编辑、初稿撰写、可视化、验证、监督、资源管理、方法论、研究、形式分析、概念化。
阿德尔·艾哈迈德（Adel Ahmed）：方法论、形式分析、数据管理、概念化。
阿亚·瓦希德（Aya Waheed）：方法论、形式分析、概念化。
穆罕默德·A·哈瓦塔（Mohamed A. Hawata）：初稿撰写、可视化、验证、监督、方法论。
莫达瑟·F·侯赛因（Modather F. Hussein）：可视化、验证、软件、资源管理、形式分析。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

**致谢**
作者衷心感谢梅努菲亚大学（Menoufia University）理学院化学系在整个研究过程中提供的实验室设施和技术支持。