一项结合核磁共振（NMR）和密度泛函理论（DFT）的研究，探讨了N-烷基苯甲酰胺的构象偏好

《Journal of Molecular Structure》：An integrated NMR and DFT study on the conformational preferences of N-alkyl benzamides

　　

Franco Vairoletti|Paulina Rodríguez|Jorge Cantero|Margot Paulino|Natalia Alvarez|Javier Ellena|Gustavo Salinas|Gonzalo Hernández Dossi|Graciela Mahler|Cecilia Saiz

乌拉圭蒙得维的亚共和国大学化学系有机化学部门，药物化学实验室

摘要

最近上市的苯酰胺类化合物是一类用于对抗植物寄生线虫的新化学物质。本研究描述了新型N-烷基苯酰胺的设计、合成及其结构特性，并评估了它们的杀线虫效果。

所制备的化合物在溶液中存在顺/反异构现象，这一现象通过CDCl₃和DMSO-d₆中的¹H核磁共振（NMR）谱得到证实。异构体的鉴定结合了实验数据与密度泛函理论（DFT）计算结果，其中包括¹H-NMR化学位移预测。对于含氟化合物，¹⁹F-NMR预测、构象分析以及¹H-¹⁹F COSY实验进一步提供了支持。在所研究的化合物中，末端N-甲基的顺式异构体表现出比反式异构体更高的¹H-NMR化学位移；而¹³C-NMR信号显示反式异构体的化学位移高于顺式异构体。

其中一种化合物的晶体结构在固态下得到了进一步表征。吡啶N-甲酰胺7号化合物的的反式异构体形成了适合X射线衍射的晶体。观察到的分子间相互作用包括非经典的C–H···O和C–H···F氢键，以及4%的Cl···F相互作用。通过计算工具对7号化合物的红外光谱进行了分析并完成了谱线解析。所有化合物均针对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）进行了活性测试。在N-烷基苯酰胺类中，N-甲基硫酰胺10号展示了最高的抑制活性（在10 μM浓度下抑制率为56 ± 4%）。

引言

自20世纪70年代以来，苯酰胺类化合物传统上被用作农业杀菌剂[1]。首个上市的苯酰胺是Carboxin?（图1A）。自发现以来，该类化合物不断涌现，图中展示了部分例子：Flutolanil?（1986年）和较为新的Boscalid?（2003年），这两种化合物被用于保护作物免受真菌病害侵害。这些杀菌剂通过与醌位点结合并抑制复合酶II（琥珀酸脱氢酶，SDH）发挥其杀菌作用，该酶将柠檬酸循环与电子传递链连接起来（因此它们被归类为琥珀酸脱氢酶抑制剂，SDHIs）。最新研究表明，SDHIs已成为最大的农业杀菌剂类别之一：自2010年以来共有17种SDHIs杀菌剂被开发出来[2]。

尽管苯酰胺最初是作为杀菌剂发现的，但近年来人们对其用于对抗植物寄生线虫的潜力越来越感兴趣。例如，吡啶基苯酰胺类杀菌剂如Fluopyram?（拜耳）和Cyclobutrifluram?（先正达）最近被批准作为农业用杀线虫剂[3]，它们在这些生物体内同样发挥SDHI的作用，见图1B。

在此背景下，我们的团队致力于苯酰胺生物异构体的设计、合成及活性评估，以期提升其杀线虫效果[4]。由于已知苯酰胺能抑制线虫的复合酶II，我们进行了C. elegans与苯酰胺4号的结合位点对接实验（方案1A）。分析表明，酰胺骨架的N位点取代是一种有前景的结构改进方向（方案1A中的红色子口袋）。因此，我们将合成工作重点放在了三级N-烷基苯酰胺的制备上。

通常情况下，溶液中的三级胺以顺/反异构体混合物的形式存在，其分布主要取决于取代基的性质和大小[5]。本研究中采用的顺/反命名法根据最大体积取代基（本例中为苯基和苯乙基）的相对位置来定义顺式或反式异构体（方案1B）。先前报道的NH-苯酰胺在实验NMR条件下未显示出明显的顺/反异构现象。

在本研究中，基于对接研究和分子动力学设计了新的N-烷基苯酰胺。这些化合物经过合成和表征，并根据计算出的¹H-NMR谱确定了它们的顺/反¹H-NMR化学位移。¹H-¹⁹F COSY实验与计算机模拟的构象分析为异构体鉴定提供了额外证据。将实验NMR数据与DFT预测的化学位移相结合已被广泛证明是一种有效的异构体和构象鉴定方法，可以通过直接比较实验数据和计算结果来实现可靠的区分[6]。此外，¹⁹F NMR对分子环境的微妙变化特别敏感，量子化学方法在预测氟化体系的¹⁹F化学位移方面表现出高度有效性[7]。

此外，化合物7号还在固态下使用FTIR进行了表征，并通过单晶X射线衍射方法确定了其晶体结构。最后，所有新化合物均针对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行了活性测试，这种自由生活的线虫常用于杀线虫剂的初步筛选。

章节摘录

方法

所有反应均在干燥、新鲜蒸馏的溶剂中进行。所有反应和色谱分离均采用0.25毫米硅胶薄层色谱（Macherey-Nagel，Polygram? SIL G/UV 254）进行分析。TLC板在254纳米紫外光下或使用碘蒸气条件下进行检测。粗反应混合物的纯化使用了硅胶60（J. T. Baker，平均粒径40毫米）快速色谱法。

新化合物库的设计基于计算研究。先前的对接实验显示，苯酰胺4号与线虫复合酶II的结合位点存在一个空位[4]。该模型还预测这个子口袋可以容纳苯酰胺4号的N-甲基取代基。为了深入了解这个子口袋，我们对与苯酰胺共结晶的Ascaris suum复合酶II的晶体结构进行了分子动力学分析。

获得的N-烷基苯酰胺为顺/反异构体混合物。通过比较NMR屏蔽的理论DFT计算结果与实验数据，确定了每种异构体在¹H-NMR和¹⁹F-NMR谱中的信号。这是对该类化合物顺/反平衡的首次系统研究。

N-烷基取代基中的末端甲基用于确定¹H-NMR中每种异构体的化学位移，结果表明顺式异构体的δ_cis大于反式异构体。

Franco Vairoletti：撰写 – 审阅与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法论、研究、形式分析、概念化。Paulina Rodríguez：方法论、研究。Jorge Cantero：验证、监督、方法论、研究、形式分析。Margot Paulino：撰写 – 审阅与编辑、可视化、软件应用、方法论。Natalia Alvarez：撰写 – 审阅与编辑、初稿撰写、验证、方法论、研究，

作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益/个人关系：

鉴于Natalia Alvarez担任处理编辑的角色，她并未参与本文的同行评审过程，也无权访问与之相关的评审信息。本文的编辑工作完全由另一位期刊编辑负责。如果还有其他作者，他们声明自己没有已知的利益冲突。

CS感谢L’Oréal-UNESCO“2023年科学女性——乌拉圭”项目对本项目的部分资助。FV感谢ANII、CAP和PEDECIBA-Química的支持。本研究部分得到了FOCEM（南锥体结构融合基金，COF 03/11）的资助。同时感谢Horacio Pezaroglo负责NMR实验的组织实施。