Laccaria laccata蘑菇提取物对Fusarium solani的体外抑菌效果及土壤成分的毒理学分析

《Journal of Natural Pesticide Research》：Efficacy in vitro of Laccaria laccata mushroom extract against Fusarium solani and toxicological analysis of soil components

　　莉西亚娜·马丁斯·沃尔坎（Lisiane Martins Volc?o）| 罗南·阿德勒·塔维拉（Ronan Adler Tavella）| 卡罗琳·洛佩斯·费霍·费尔南德斯（Caroline Lopes Feijó Fernandes）| 罗德里戈·德·利马·布鲁姆（Rodrigo de Lima Brum）| 普里西拉·巴托洛梅乌·哈利基（Priscila Bartolomeu Halicki）| 丹妮拉·费尔南德斯·拉莫斯（Daniela Fernandes Ramos）| 爱德华多·贝尔纳迪（Eduardo Bernardi）| 弗拉维奥·马诺埃尔·罗德里格斯·达席尔瓦·儒尼奥尔（Flávio Manoel Rodrigues da Silva Júnior）
巴西里奥格兰德联邦大学（Universidade Federal do Rio Grande）生物科学研究所

**摘要**
传统农作物由于需要大面积的土地，因此需要大量的化肥和农药。随着人们对农药在环境中命运的日益关注，多种微生物和植物提取物被探索用于生物控制。镰刀菌（Fusarium sp.）对大豆生产影响严重，已成为研究重点，研究者使用了不同的提取物进行试验。本研究测试了红菇（Laccaria laccata）的水醇提取物（25克蘑菇浸泡在100毫升MiliQ水和50%乙醇中）在不同浓度（2.5、1.250和0.625毫克/毫升）下对镰刀菌（Fusarium solani）的抑制效果，并对其毒性进行了评估。结果表明，0.625毫克/毫升浓度的提取物能有效抑制镰刀菌。体外毒性测试显示该提取物对Vero细胞系无毒性作用；体内毒性测试显示，与对照组（无菌蒸馏水和1%乙醇）相比，处理过该提取物的人工土壤中的蚯蚓存活率更高。对受污染自然土壤中微生物群功能的评估显示，使用该提取物的处理组微生物多样性和均衡性参数显著提高。这项研究强调了红菇提取物在控制镰刀菌方面的有效性，并证实其在体外和体内测试中均无毒性。

**1. 引言**
传统农业实践通常需要大量土地，因此需要大量的农药和化肥。化学物质主要在种植园中用于预防和治疗导致产量损失的植物疾病，如猝死综合症、炭疽病和镰刀菌病（Mueller等人，2020年）。真菌污染，尤其是镰刀菌感染，对多种作物构成严重威胁，主要包括玉米、大豆和小麦。镰刀菌的孢子可以寄生在植物上，而厚垣孢子则可以在适宜条件下越冬并重新启动感染循环（Dweba等人，2017年）。除了大豆外，镰刀菌复合体还对许多其他农作物具有致病潜力，包括土豆、鹰嘴豆、豌豆等（Moparthi等人，2021年）。关于镰刀菌生物控制的研究探索了使用不同微生物和植物提取物的方法（Báez-Vallejo等人，2020年；Kawicha等人，2023年）。蘑菇在传统中药中广泛应用，能产生多种代谢物，如萜类化合物、甾体、黄酮类、酚类和多糖（Wu等人，2019年）。由于蘑菇的抗菌、抗真菌和抗氧化特性，从不同蘑菇物种中提取的提取物在农业中受到关注（Chu等人，2021年；Ragucci等人，2023年）。尽管全球范围内对蘑菇的研究广泛，但近年来美洲地区对其效果的兴趣显著增加（Martínez-Carrera，2002年）。尽管巴西蘑菇种类丰富，但利用蘑菇提取物控制病原体的研究仍较少（Li等人，2020年；Volc?o等人，2021年）。红菇是一种全球分布广泛的蘑菇，在富含营养物质的土壤中生长旺盛，这得益于落叶层和腐殖质的存在（Karalt等人，2022年）。土壤性质、温度、pH值、湿度等因素会影响植物和蘑菇提取物的生长及其化学成分。不仅不同种类的红菇具有不同的化学组成，同一物种在不同地区的提取物也有所不同。已有研究表明，次级代谢物在植物对抗病原体中起重要作用，例如受镰刀菌感染的植物会产生酚酸（Chrpová等人，2021年）。受镰刀菌感染的谷物能够产生多种酚酸，如绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸和阿魏酸，这些物质对致病真菌具有抗真菌作用。

**2. 方法**
2.1. 提取物的收集与制备
蘑菇样本来自一片以松树（Pinus sp.）和灌木植被为主的区域（南纬31°48’54’，东经52°25’48’）（图1），并根据既定标准鉴定出红菇。该地区属于南里奥格兰德州（Rio Grande do Sul）的草原地带，周围有湿润环境和牧场，属于半落叶气候（Wolf等人，2016年）。共收集了1286.4克成熟的蘑菇子实体，干燥后（50°C下干燥48小时）得率为8.6%。随后将干燥后的蘑菇浸泡在100毫升MiliQ水和50%乙醇中（比例1:4，重量/体积），并在40°C下用超声波处理120分钟以制备水醇提取物（EtOH50）。提取物混合物通过Whatman? 1号滤纸过滤去除颗粒物。最终溶液储存在-80°C的超低温冰箱中直至化学分析（24小时）。

2.2. 总酚含量和抗氧化活性的测定
红菇EtOH50提取物的总酚含量（TPC）采用Roesler等人（2007年）的方法测定。进行比色反应时，制备了甲醇提取液（比例1:20，体积/体积），总酚含量以每克提取物中的没食子酸当量毫克数（mg GAE/g）表示。为评估EtOH50提取物的抗氧化活性，使用2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH）自由基清除实验。Folin-Ciocalteu方法通过酚类化合物还原试剂来测定其清除“稳定”自由基DPPH的能力，形成蓝色复合物（Roesler等人，2007年所述）。实验当天制备DPPH溶液（0.0004%摩尔/体积），并在0.8至1.2吸光度单位（λ = 517 nm）范围内测量吸光度。蘑菇提取物先稀释至甲醇中（1:10），然后在10°C下用超声波处理30分钟，再稀释至不同浓度。标准曲线（Trolox当量）和样品在室温下避光孵育30分钟。在λ = 517 nm处测量混合物的吸光度，抗氧化能力以每毫升提取物中的Trolox当量微摩尔数（μmol Trolox/mL）表示。自由基清除能力按公式（1）计算：
**（1）清除效果% = (A样本 - A对照) / A对照 * 100**

2.3. 红菇提取物对镰刀菌的抑制效果
采用肉汤稀释试验评估红菇EtOH50提取物的抗真菌活性，确定其抑制真菌生长的最小抑制浓度（MIC）。分析前将提取物真空蒸发至干，然后溶解在5%二甲基亚砜（DMSO）水溶液中至10毫克/毫升浓度。目标真菌镰刀菌IOC 2163在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA – Sigma?）平板上培养5至7天。从PDA培养物中加入5毫升盐水溶液（0.85%体积/体积）制备孢子悬浮液。用无菌Drigalski刮刀从琼脂表面收集孢子。通过Neubauer计数器测定孢子浓度。实验在96孔板中进行，每种提取物分别稀释至2.5、1.250和0.625毫克/毫升，并在Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基中孵育。每个孔接种4 × 10^7个孢子。比色反应时，每孔加入10微升0.002%体积/体积的亮蓝染料（resazurin）作为真菌细胞活力指示剂。每个微孔包括阳性对照（RPMI-1640培养基+ DMSO 5%）和两个阴性对照（培养基和提取物各一个）。平板在37°C下孵育24小时，实验重复三次（Monteiro等人，2012年）。

2.4. 细胞毒性测定
评估EtOH50提取物对VERO细胞系ATCC CCL-81的细胞毒性。在96孔板中，将200微升成纤维细胞悬浮液培养在DMEM培养基（Vitrocell Embriolife）中，加入10%胎牛血清，置于37°C、5%二氧化碳的潮湿环境中孵育24小时，细胞浓度为3.4 × 10^5个/毫升。孵育后，细胞暴露于不同浓度的EtOH50提取物（2.5至0.312毫克/毫升），再在37°C、5%二氧化碳条件下孵育24小时。为确定能维持50%细胞存活的提取物浓度（IC50），加入30微升0.01%亮蓝染料溶液，孵育6小时后测量荧光强度（Pavan等人，2010年）。

2.5. 体内毒性分析
2.5.1. 土壤特性与样品制备
使用根据Garcia等人（2004年）改进的OECD人工土壤（SAT）进行致死性测试。该土壤由75%细沙、20%高岭土和5%椰纤维组成。SAT样品分别暴露于不同浓度的红菇EtOH50提取物（5.0、2.5和1.25毫克/毫升），以及对照组（无菌蒸馏水和提取物制备溶剂1%乙醇）。每个重复实验包含250克土壤，用100毫升提取物处理。用于微生物功能分析的天然土壤取自佩洛塔斯联邦大学（UFPel）校园。收集后，土壤通过32目筛网去除石块、根系等大颗粒。土壤的物理和化学特性见表1。向土壤中分别加入不同浓度的红菇EtOH50提取物（5.0、2.5和1.25毫克/毫升），以及对照组（无菌蒸馏水和溶剂1%乙醇）。每个重复实验包含200克土壤，用50毫升提取物处理。样品在室温（22 ± 2°C）下保存14天。

2.5.2. Eisenia andrei的致死性测试
实验使用Eisenia andrei蚯蚓。成年蚯蚓来自里奥格兰德联邦大学生物科学研究所（FURG）的无脊椎动物生物实验室。培养条件为25°C的光暗周期和40-50%的湿度。实验期间不喂食蚯蚓，温度维持在20 ± 1°C，光照-黑暗周期为12:12小时，持续14天。暴露7天和14天后记录存活的E. andrei数量（OECD 2001）。

2.5.3. 红菇提取物对微生物功能的影响
使用Biolog EcoPlateTM系统分析红菇提取物对微生物功能的影响。将自然土壤暴露于红菇提取物2.5.2节所述条件14天后，每种处理组和对照组各加入45毫升无菌0.85% NaCl溶液处理30分钟。然后将每种溶液稀释150倍，向每个Eco微孔中加入150微升沉淀物悬浮液。平板在28°C下孵育，孵育24、120和144小时后用微孔读数仪在590 nm处测量颜色变化。每种处理下的微生物活性通过平均孔色发展（AWCD）来表示，依据公式2进行计算。底物丰富度值（R）是根据所利用的底物数量来计算的，而多样性（H’）（公式3）和均匀度（E）（公式4）则是根据Zak等人（1994年）的方法确定的。(2)AWCD=∑ODi31(3)ShannonIndexH′=∑pilnpi(4)ShannonEvennessE=HlnS其中pi表示该孔的颜色发展与整个平板所有孔的总颜色发展的比例，H’是多样性Shannon指数，S是具有颜色发展的孔的数量（底物利用丰富度）。2.6. 数据分析使用单因素方差分析（ANOVA）来分析蚯蚓的存活率（%）、丰富度（R）、均匀度（E）和Shannon指数（H'）。同化底物组的结果也通过ANOVA进行分析，随后使用GraphPad Prism 4软件（美国加利福尼亚州拉霍亚）进行Tukey检验。数据以平均值±标准差的形式呈现，显著性水平为95%（p < 0.05）。3. 结果3.1. L. laccata EtOH50提取物的总酚含量（TPC）和抗氧化潜力TPC的分析显示，每克样品的没食子酸当量为3,414.10 μg（±316.31）。DPPH自由基化合物常用于评估各种提取物的自由基清除能力。在我们的分析中，发现当提取物浓度为250 mg/ml时，清除效果为80.26%，相当于每μl样品6.72 μmol的Trolox当量。3.2. 对F. solani的抗真菌活性研究了L. laccata EtOH50提取物对真菌病原体F. solani的抗真菌活性。肉汤稀释试验显示其最小抑制浓度（MIC）为0.625 mg/mL，表明L. laccata EtOH50提取物对F. solani具有显著的抗真菌潜力。3.3. 细胞毒性试验L. laccata EtOH50提取物的细胞毒性分析结果显示，在2.5 mg/mL的浓度下对VERO细胞的抑制率为3.82%（图2A）。根据分析，IC50大于2.5 mg/mL，表明这些化合物对成纤维细胞没有细胞毒性。下载：下载高分辨率图像（85KB）下载：下载全尺寸图像图2. VERO细胞系暴露于L. laccata EtOH50提取物后的细胞抑制率（%）（A）以及（B）Eisenia andrei暴露于L. laccata EtOH50提取物14天后的存活情况。图例：对于E. andrei的存活情况，?表示与对照组相比有统计学差异。数值以平均值±标准差（SD）表示，n = 5。3.4. 对暴露于Laccaria laccta EtOH50提取物的E. andrei蚯蚓的致死性分析基于E. andrei的14天毒性数据，在2.5 mg/ml和5.0 mg/ml的溶剂浓度下均未观察到致死效应（图2B）。然而，在对照组和1.25 mg/mL的L. lacata EtOH50提取物处理组中观察到存活率显著降低（10%的致死率）。3.5. Biolog EcoplateTM分析该系统研究了总共31种碳源（图3），这些碳源被分为五组。单独分析这些组时，观察到对照组在氨基酸同化方面优于处理组。处理组和对照组在氨基酸（图4B）、碳水化合物（图4C）和羧酸（图4D）的碳源氧化方面存在显著差异，详见补充表1。基于光密度（OD）测量结果计算的指数如H'（Shannon指数）、S（均匀度）和R（丰富度）有助于描述微生物群体的活性和多样性。在表2中可以观察到对照组和处理组之间这些变量的正面差异。下载：下载高分辨率图像（515KB）下载：下载全尺寸图像图3. 基于Biolog EcoPlate?中不同浓度的Laccaria laccata EtOH50提取物处理的土壤样本中存在的微生物的聚类分析。图例：OD590 – 590 nm处的光密度；C – 溶剂EtOH 1%；T1 – 1.25 mg/mL；T2 – 2.5 mg/mL；T3 – 5 mg/mL。下载：下载高分辨率图像（462KB）下载：下载全尺寸图像图4. 土壤微生物群在暴露于不同浓度的Laccaria laccata EtOH50提取物后对底物的平均利用情况：胺/酰胺（A）、氨基酸（B）、碳水化合物（C）、羧酸（D）和聚合物（E），基于144小时的培养时间。数值以平均值±标准差（SD）表示，n = 3。相同列中的相似字母表示在5%显著性水平下通过Tukey检验得到的统计上相似的结果。表2. 基于Biolog EcoPlateTM 144小时培养的土壤微生物群的Shannon均匀度（E）、Shannon多样性（H）和丰富度（R）的平均值。处理组平均值±SD?Shannon均匀度（E）Shannon多样性（H’）丰富度（R）对照组0.95 ±0.007a3.37 ±0.0219a31溶剂0.97 ±0.001a3.39 ±0.004ab311.25 mg/ml0.96 ±0.001ab3.37 ±0.014a312.5 mg/ml0.99 ±0.0008bc3.39 ±0.002ab315.0 mg/ml0.991.08 ±0.004c3.41 ±0.013b31p值0.00220.01-图例：平均值（n = 3）；SD – 标准差；?相同列中的相似字母表示在5%显著性水平下统计上相似的结果。4. 讨论L. laccata EtOH50提取物的TPC和DPPH清除活性分析显示，其值高于我们之前使用相同物种的蘑菇水提取物的研究（Volc?o等人，2019年）。提取所用溶剂的极性选择对确定TPC值和抗氧化潜力起着重要作用。酚类化合物，如多酚，在自然界中广泛分布，可以被认为是植物和蘑菇对抗压力和食草动物攻击的主要防御机制之一（Saini等人，2024年）。这些化合物在抗氧化活性方面极为重要。例如咖啡酸、羟基苯甲酸、对香豆酸、异维他辛和槲皮素二水合物等酚类化合物，根据其含量具有强大的抗氧化作用。异氯原酸和对香豆酸也是在分析消除超氧阴离子能力时表现出强大抗氧化活性的酚类化合物（Ge等人，2021年）。提取过程中溶剂的选择会影响提取物的抗菌活性。在我们的研究中，我们证明了在使用的最低蘑菇提取物浓度（0.625 mg/mL）下具有抗真菌活性。作者们已经观察到某些植物提取物在生物控制F. solani方面的有效性（Xi等人，2022年）。镰刀菌枯萎病是一种难以控制的农业作物疾病。在这方面，观察到将果树与产生富含酚类物质的豆科植物间作可以有效控制这种疾病及其后果（Were等人，2022年）。研究了富含酚类化合物的不同提取物的联合效应，主要是没食子酸和绿原酸，证明了这些化合物在控制F. oxysporum方面的协同作用（Nguyen等人，2024年）。关于毒理学分析，L. laccata EtOH50提取物在所用浓度下未显示出对VERO细胞的细胞毒性（图2A），这为未来使用更高浓度的提取物来抑制这种病原真菌的研究提供了可能。此外，Wang等人（2018年）证明了蘑菇中的化合物对VERO细胞中活性氧（ROS）的保护作用，可能通过清除细胞内的ROS来减少细胞凋亡或死亡。我们的测试还评估了L. laccata EtOH50提取物的体内毒理学效应（图2B）。Eisenia sp.蚯蚓常用于分析各种化合物的毒理学效应，包括抗炎药物、β-阻滞剂、抗生素，甚至某些农药的毒性（Pino等人，2015年）。蚯蚓在土壤中的存活取决于外在和内在因素。在这种情况下，土壤pH值是这些生物生存和生长的关键因素，中性pH值是最理想的，pH值为5.2时蚯蚓的生长会减少（Wu等人，2020年）。在这项研究中，我们使用了天然土壤（pH值为5.0）以模拟更真实的环境，这可能导致对照组和处理组中的蚯蚓死亡。此外，考虑到提取物的抗氧化活性和体外无细胞毒性，我们可以推断L. laccata EtOH50提取物可能具有“保护”作用。Eisenia sp.常被用作生物指示剂，因为它对土壤成分的变化非常敏感（Reis等人，2023年）。生物体需要适应环境压力条件，为此它们需要有效的修复系统（Wu等人，2020年）。这些系统通过环境中的抗氧化物质来消除由外源压力引起的自由基。根据同化数据，我们的发现表明，暴露于L. laccata EtOH50提取物的土壤微生物群的功能发生了显著变化。可以观察到氨基酸的消耗减少（图4B），可能是由于溶剂的影响，而在较高提取物浓度下碳水化合物的消耗增加（图4C）。特别是，含有碳和氮的来源（如L-苏氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸）的吸收减少，而含有磷+碳的来源（D-L-α-甘油磷酸和葡萄糖-1-磷酸）的吸收增加（图5）。这种变化可以解释为微生物群为了应对添加蘑菇提取物后改变的条件而采取的补偿策略。一些含有酚酸的提取物可能具有植物毒性，抑制植物发芽或生长（Volc?o等人，2021年）。此外，有研究表明这种毒性可能会影响土壤微生物群落，改变根际结构（Zhou和Wu，2013年）。碳源同化的缺乏显著变化可能表明土壤质量良好。微生物群对根际过程的贡献可以通过真菌和细菌之间的竞争、真菌间的竞争以及昆虫和线虫的寄生作用来调节食物网相互作用，从而形成复杂的地下多营养级相互作用网络（Hannula等人，2020年）。健康的土壤微生物群对植物抵御如F. solani等病原体具有天然防御作用，微生物群的通信能力（群体感应）对于防止植物疾病的发生至关重要（Ghosh和Jha，2023年）。据我们所知，文献中尚未有研究评估土壤微生物群暴露于蘑菇提取物的目的在于生物控制。然而，我们观察到所有处理组中所有碳源的吸收。此外，用L. laccata EtOH50提取物处理的土壤微生物群在这些底物的吸收多样性和均匀度上有显著增加（p < 0.001）。已经证明，刺激有益微生物的生长可以通过提高作物对疾病和昆虫的抵抗力来增强农业生产，提高产量，并减少对合成肥料的需求（Islam等人，2020年）。在这方面，我们的发现表明这些提取物对于控制F. solani和其他影响大豆和其他作物的病原体具有潜力。由于这些提取物除了具有抗氧化活性和抗真菌潜力外，还具有体外和体内的无毒性，因此它们也可能作为土壤或栽培谷物和谷物培养基中有前途的生物刺激剂。生理变化可以作为微生物群在特定条件下适应性的指标（Gryta等人，2014年）。除了本研究中评估的蘑菇提取物没有毒理学效应外，还有一些研究也观察到植物物种的无毒性。使用Suillus granulatus和Russula xerampelina的乙醇提取物进行的研究证明了其在测试Lactuca sativa（生菜）和Solanum lycopersicum（番茄）时的安全性（Volc?o等人，2021年）。5. 结论总之，这项研究证明了L. laccata EtOH50提取物在体外控制Fusarium solani方面的有效性。在评估的参数中，该提取物没有表现出体外和体内的毒性，并且暴露的土壤微生物群的多样性和均匀度显著增加，突显了这种提取物作为农业土壤和培养基中生物刺激研究中有前途产品的潜力。未引用参考文献Garcia（2004）资助这项研究部分由巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES）资助——财务代码001。化学分析得到了IF/RS – Sert?o校区下属的实验和分析研究中心的支持，负责人为Msc.丹妮丝·比利比奥（Denise Billibio）：作者贡献声明
罗南·阿德勒·塔维拉（Ronan Adler Tavella）：撰写、审稿与编辑；火山莉西亚娜（Volc?o Lisiane）相关研究：撰写、审稿与编辑；初稿撰写；方法论研究；数据分析；概念化设计。
罗德里戈·德·利马·布鲁姆（Rodrigo de Lima Brum）：方法论研究。
卡罗琳·洛佩斯·费茹·费尔南德斯（Caroline Lopes Feijó Fernandes）：方法论研究；数据收集与分析。
丹妮拉·费尔南德斯·拉莫斯（Daniela Fernandes Ramos）：资金筹措。
普里西拉·巴托洛梅乌·哈利基（Priscila Bartolomeu Halicki）：方法论研究；数据收集与分析。
弗拉维奥·马诺埃尔·罗德里格斯·达·席尔瓦·儒尼奥尔（Flávio Manoel Rodrigues da Silva Júnior）：项目监督；项目管理；资金筹措。
爱德华多·贝尔纳迪（Eduardo Bernardi）：项目监督；资金筹措。

关于写作过程中生成式人工智能及人工智能辅助技术的声明
作者声明在文章撰写过程中未使用任何人工智能及人工智能辅助技术。