通过水凝胶纳米制剂实现RNA干扰，以控制亚洲一型烟粉虱（Bemisia tabaci Asia-I，Gennedius）（半翅目：粉虱科）

《Journal of Natural Pesticide Research》：RNAi via Hydrogel Nanoformulation for the management of Bemisia tabaci Asia-I (Gennedius) (Hemiptera: Aleyrodidae)

　　**Keppanan Ravindran | Karuppannasamy Ashok | Asokan Ramasamy | Prasad Babu Karakatti | Venkatesan Thiruvengadam | Subaharan Kesavan**

**ICAR-印度园艺研究所，班加罗尔 - 560089，印度**

**摘要**

**Bemisia tabaci**（俗称甘薯白粉虱）是一种全球著名的害虫，同时也是多种破坏性植物病毒的高效传播媒介。由于其对传统杀虫剂产生了广泛的抗性，其管理变得越来越具有挑战性。RNA干扰（RNAi）作为一种有前景的基因控制工具被提出用于控制包括**B. tabaci**在内的害虫；然而，其实际应用受到环境稳定性的限制。为了克服这一局限性，本研究介绍了一种基于明胶/甘油的水凝胶纳米制剂，用于递送针对**B. tabaci Asia I**的蜕皮激素受体（EcR）基因的双链RNA（dsRNA）。通过凝胶延迟测定、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对水凝胶系统在加载dsRNA前后的性能进行了表征，证实了其稳定性和明确的形态。该纳米制剂还表现出对阳光和紫外线的更好抵抗力。在生物测定实验中，通过半合成饲料递送的**B. tabaci EcR dsRNA**在处理后72小时导致了70%的死亡率。RT-qPCR分析证实，在200 μg/mL的dsRNA浓度下，72小时后的高效沉默效应与死亡率显著增加有关。这项研究突显了基于明胶的水凝胶纳米载体在提高针对**B. tabaci**的RNAi基害虫控制策略的环境稳定性和效果方面的潜力。在大规模应用之前，还需要进一步研究非目标安全性和环境风险评估。

**引言**

**甘薯白粉虱**（Bemisia tabaci）是一种全球公认的多食性害虫，可侵染超过350种植物。作为一种韧皮部取食昆虫，它还是许多植物病毒的高度有效的传播媒介，造成严重的经济损失。**B. tabaci**由形态上难以区分但遗传上不同的隐存物种组成，例如MEAM1（以前的B生物型）、Asia-I和Asia-II-1，这些物种主要根据线粒体细胞色素氧化酶I（mtCOI）序列的差异进行分类。其中，Asia-I和Asia-II-1在印度次大陆广泛分布，并且在寄主范围、杀虫剂抗性和病毒传播效率方面存在差异。由于**B. tabaci**对多种化学类别的杀虫剂迅速产生抗性，传统的基于杀虫剂的管理策略大多失效。因此，像RNA干扰（RNAi）这样的替代分子方法在可持续害虫控制中受到了关注。RNAi是一种序列特异性的基因沉默机制，通过引入与目标基因对应的双链RNA（dsRNA）来触发。一旦进入昆虫细胞，dsRNA会被Dicer酶处理成短干扰RNA（siRNA），这些siRNA被纳入RNA诱导的沉默复合体（RISC）中，从而有效阻断蛋白质合成并影响昆虫的发育或生存（Malik等人，2016年）。尽管RNAi具有巨大潜力，但由于多种生物学和环境因素，其在不同昆虫类群中的效果存在差异。这些因素包括dsRNA在昆虫肠道中的不稳定性、被dsRNA特异性核酸酶降解、细胞吸收效率低以及递送方法的问题（Kolge等人，2021年）。为了解决这些问题，提出了创新的递送平台，特别是纳米制剂。

RNAi已成为管理半翅目害虫的有希望的策略；然而，其实际应用常常受到口服递送效率低下和dsRNA在昆虫肠道中快速降解的限制。最近的进展强调了递送系统在提高RNAi效果中的关键作用。例如，纳米粒子介导的递送显著提高了*Sogatella furcifera*的目标基因敲低效果，并能够同时评估对非目标生物的风险，从而支持更环保的害虫控制策略（Ma等人，2024年）。类似地，脂质体和EDTA制剂等封装方法已被证明可以保护dsRNA免受降解并提高细胞吸收，从而增加*Euschistus heros*的死亡率（Castellanos等人，2019年）。在**Nezara viridula**和*Murgantia histrionica*等半翅目害虫中的研究进一步证实，优化的dsRNA口服递送可以通过有效的基因沉默诱导显著的死亡率（Sharma等人，2021年；Howell等人，2020年）。总体而言，这些发现强调了先进dsRNA递送平台在实现一致且强大的RNAi效果中的重要性（Jain等人，2021年）。最有前景的策略是使用基于生物聚合物的水凝胶作为dsRNA分子的保护载体。这些水凝胶形成三维、亲水的交联聚合物网络，能够吸收大量水分。它们通常由天然、可生物降解和生物相容的材料制成，如明胶、壳聚糖、瓜尔胶和淀粉（Shah等人，2022年）。它们的无毒性质，加上保护dsRNA免受酶降解和恶劣环境条件的影响，使其非常适合田间应用。

**最近的研究表明，基于水凝胶的dsRNA递送在控制关键农业和媒介昆虫害虫方面具有实用性（Dhandapani等人，2021年）。值得注意的是，这些水凝胶中的阳离子聚合物通过促进与带负电荷的dsRNA的静电相互作用，进一步提高了RNAi的效果，改善了其稳定性、吸收和生物利用度（Mao等人，2010年；Kolge等人，2023年）。尽管RNAi具有高度的序列特异性，但选择目标基因对于确保生物安全性仍然至关重要。本研究中针对的蜕皮激素受体（EcR）是多种昆虫类群中保守的核受体，包括有益昆虫如传粉者和天敌。因此，精心设计具有最小非目标同源性的dsRNA序列至关重要。在这种情况下，最小化脱靶效应和随后的生物安全性评估是RNAi基害虫控制策略田间应用的重要前提。鉴于传统害虫控制的挑战以及未受保护的dsRNA在开放环境中的局限性，本研究旨在开发并表征一种基于明胶/甘油的水凝胶纳米制剂，以实现针对**B. tabaci Asia-I**的EcR基因的高效局部递送。这种环保且成本效益高的纳米载体系统为提高RNAi效果提供了一个新的平台，有望作为适用于田间的可持续生物控制策略。

**材料与方法**

**昆虫培养的维持**

**Bemisia tabaci（Asia-I）**的种群在45天大的茄子植物（Solanum melongena cv. Arka Keshav）上维持，在一个防虫条件的受控环境室（60.96 × 76.2 × 91.44厘米）中，温度为25–26°C，相对湿度为65±5%，光照周期为15:9小时。该种群由ICAR-印度园艺研究所（IIHR）基础科学部门在卡纳塔克邦班加罗尔维护。对于生物测定，使用来自同步种群的新生成年白粉虱（0–24小时 old）以确保生理状态的一致性。

**非目标最小化dsRNA的设计和体外合成**

**B. tabaci Asia-I**的完整EcR基因序列通过PCR扩增，克隆到pz57R/T载体中，并进行测序。使用基于网络的蛋白质结构预测工具Simple Modular Architecture Research Tool（SMART）（https://smart.embl.de/smart/change_mode.cgi）分析了该序列的保守结构域，识别出核受体DNA结合域（DBD）和配体结合域（LBD）。为了确保目标特异性并最小化脱靶效应，dsRNA目标区域选自核心功能域之外的一个不太保守的区域。选定的区域进一步使用SiDirect 2.0（http://sidirect2.rnai.jp/）进行优化siRNA设计。此外，选定的dsRNA序列针对非目标昆虫（包括传粉者、捕食者和寄生蜂）的基因组和转录组数据集进行了BLAST同源性分析。应用了严格的过滤标准，以确保与非目标生物没有≥19–21个连续核苷酸的匹配，从而最小化脱靶RNAi效应的可能性。dsRNA是从EcR基因的1593 bp目标区域合成的，产生约489 bp的扩增子。用于扩增的引物序列包括T7启动子过桥序列：正向引物（T7）：5′-TAATACGACTCACTATAGGG + 基因特异性引物 [ATGGACTTGAAACATGATAC]-3′ 和反向引物（T7）：5′-TAATACGACTCACTATAGGG + 基因特异性引物 [GAGGAACGGGTCGACAGCAG]-3′。本研究中使用的EcR基因序列对应于登录号（PZ231504）。dsRNA使用2 μg的纯化PCR产物和T7 RNA聚合酶（Thermo Scientific）按照制造商的协议合成。所得dsRNA用DNase I（Thermo Scientific）处理，用苯酚：氯仿提取法纯化，并用乙醇沉淀。dsRNA的浓度和纯度使用NanoDrop? 2000分光光度计（Thermo Scientific）测定，完整性通过1.2%琼脂糖凝胶电泳确认。

**明胶基水凝胶的制备**

**明胶-甘油水凝胶**的制备方法遵循Keppanan等人（2024年）描述的无毒方法。通过将0.5克明胶溶解在50毫升甘油中制备1%（w/v）的明胶溶液。混合物经过三次冻融循环（-20°C 12小时，然后在室温下解冻6小时）以促进均匀交联，随后在60°C下连续搅拌和加热30分钟以确保均匀分散。最终粘稠溶液冷却至室温并储存在-4°C以备后续使用。该水凝胶系统用作dsRNA的保护和递送基质，有助于提高环境稳定性、保持水分并控制封装分子的释放。

**EcR dsRNA加载水凝胶的制备**

**EcR dsRNA**的储备溶液以2 mg/mL的浓度制备，用于水凝胶加载。dsRNA以定义的加载比例（100:1、150:1、200:1和250:1）掺入明胶水凝胶中，以优化封装效率。封装比例（100:1、150:1、200:1和250:1）表示dsRNA与水凝胶的重量/体积（w/v）比例。这些比例代表配方条件，并不对应于生物测定中使用的最终暴露浓度。封装过程包括将混合物涡旋5分钟，然后在37°C下超声处理30分钟。dsRNA的加载程度通过1.0%琼脂糖凝胶电泳确认。未封装的dsRNA和空白水凝胶分别作为阳性和阴性对照。水凝胶-dsRNA纳米制剂储存在4°C直至进一步使用。在储存期间未观察到可见的聚集、沉淀或相分离，制剂保持均匀。

**纳米制剂的表征**

**SEM分析**使用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM，型号：Zeiss Sigma 300，Carl Zeiss，德国）进行。使用高能电子束扫描，检查了空白和水凝胶加载dsRNA的表面形态和尺寸分布。**TEM成像**使用高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM，型号：JEOL JEM-2100，日本）进行。**FTIR光谱**使用FTIR光谱仪（Bruker Tensor 27，德国）记录。对于TEM分析，样品滴涂在碳涂层铜网格上并空气干燥。未使用负染色剂。水凝胶封装的dsRNA纳米颗粒分散在蒸馏水中，涡旋5分钟，然后在室温下在干燥的铜网格上孵育10分钟。样品使用TEM成像，并使用ImageJ软件进行分析。FTIR分析用于识别与dsRNA结合到水凝胶基质中的功能基团。样品（dsRNA、明胶水凝胶和dsRNA加载水凝胶）在4000–4000 cm?1范围内进行KBr方法扫描。交联的水凝胶膜进一步使用衰减全反射（ATR）-FTIR光谱进行检测。

**水凝胶-dsRNA复合物稳定性的评估**

**在阳光和紫外线暴露下**，分别在0、2、4、6和8小时评估了dsRNA-水凝胶复合物的环境稳定性。暴露后，使用1%琼脂糖凝胶电泳检查dsRNA的完整性。阳光暴露的平均强度约为800–1000 W/m2，而紫外线暴露使用波长为254 nm的紫外线灯（约1.5 mW/cm2）进行。除了凝胶电泳外，还通过NanoDrop分光光度计（A260/A280比率）评估dsRNA的完整性，确认水凝胶封装样品的降解最小。

**基因沉默效果的评估**

**对于生物测定，将纳米制剂的dsRNA稀释在30%蔗糖溶液中，以获得最终dsRNA浓度为50、100、150和200 μg/mL，分别相当于储备纳米制剂的2.5%、5.0%、7.5%和10%（v/v）。所有浓度均表示为昆虫可获得的最终dsRNA浓度。这种饲料提供给新生的**B. tabaci**成年虫（0–24小时 old）。每个处理包括三个独立的生物学重复实验，每个重复实验有30只成年白粉虱（总共n = 90只），并在处理后24、48和72小时记录死亡率。未封装的dsRNA溶液与蔗糖混合作为对照。喂食实验使用双层Parafilm膜喂食室进行，其中包含蔗糖-dsRNA溶液，方法如Kolge等人（2021年）和Keppanan等人（2024年）所述，但稍作修改，使用透明玻璃瓶以便于观察（图S1）。

**定量实时PCR（RT-qPCR）**

**总RNA使用ISOLATE II RNA Mini Kit（Bioline）按照制造商的说明提取。对于cDNA合成，使用500 ng的RNA和RevertAid First Strand cDNA合成Kit（Thermo Fisher Scientific），并将cDNA储存在-20°C。qPCR针对EcR基因进行，以 elongation factor 1（EF1）作为参考基因。PCR循环条件包括在95°C下进行1分钟的初始变性，随后是40个循环，每个循环包括30秒的59°C和5秒的95°C。相对基因表达水平使用2^-ΔΔCt方法计算（Livak和Schmittgen 2001）。所有反应都使用独立处理的样本进行了三次重复。

**统计分析**
死亡率数据使用GraphPad Prism（版本9）进行单因素方差分析（ANOVA）。Tukey的多重比较测试用于识别不同dsRNA浓度（2.5%、5.0%、10.0%和15%（饲料溶液中的50、100、150和200 μg/mL dsRNA）和暴露时间（24-72小时）之间的显著差异（P < 0.05）。为了确保清晰，本研究中报告的所有dsRNA浓度均指饲料溶液中的最终浓度（μg/mL）。百分比（%）值表示纳米配方原液的稀释度，并已相应转换。从纳米配方的百分比（v/v）转换为最终dsRNA浓度（μg/mL）是基于配方过程中使用的初始dsRNA原液浓度（2 mg/mL）。qRT-PCR数据使用单因素ANOVA分组，然后使用Dunnett的多重比较测试与对照组进行比较，以识别显著差异（p < 0.05）。

**结果**
**B. tabaci EcR的结构特征和dsRNA靶点选择**
B. tabaci EcR的全长序列经过结构注释，以识别对其调控作用至关重要的保守功能域。域分析显示，在N端区域存在一个高度保守的DNA结合域（DBD），属于ZnF_C4类型，其特征是富含半胱氨酸的基序，负责序列特异性的DNA相互作用。此外，在C端区域识别出一个属于核受体家族（HOLI域）的配体结合域（LBD），这对于蜕皮激素的结合和受体激活至关重要（图S2）。这些典型域的存在证实了所识别序列对应于参与昆虫发育和蜕皮过程的功能性核激素受体。B. tabaci EcR的推导氨基酸序列进一步证实了域结构，DBD和LBD区域有明确的划分。DBD显示出保守的半胱氨酸残基，表明存在锌指基序，而LBD则显示与配体识别和转录调控相关的特征结构。在编码序列中选择了一个特定区域作为dsRNA靶点，该区域战略性地位于高度保守的DBD之外，以最小化潜在的脱靶效应并避免破坏保守的结构基序（图S3）。这个区域的选取基于其适合高效RNAi介导的基因沉默。为了评估所选靶点的适用性，使用SiDirect 2.0算法进行了siRNA生成位点的计算预测。分析显示EcR序列中存在多个潜在的siRNA位点，而在选定的dsRNA区域内有效siRNA候选物的密度更高（图S4）。这些预测的siRNA符合功能性的既定标准，包括最佳的热力学性质和降低的脱靶潜力。目标区域内存在多个高置信度的siRNA位点，表明高效的基因敲低的可能性很大。总体而言，结构注释和计算机模拟的siRNA预测分析验证了dsRNA靶点的选择，并支持其在B. tabaci中基于RNAi的功能研究的适用性。

**明胶基纳米水凝胶的制备和表征**
dsRNA以不同的重量比（100:1、150:1、200:1和250:1）封装在明胶纳米水凝胶中。封装效率通过凝胶延迟测定进行了定性评估，在250:1的比例下（250 μL水凝胶中含有2 mg dsRNA）完全延迟，表明封装接近完成（>90%）（图S5）。使用扫描电子显微镜（SEM）检查了纯水凝胶和负载dsRNA的水凝胶纳米粒子的表面形态。SEM图像（图1a和1b）显示交联的水凝胶形成了均匀、光滑且紧凑的结构。负载dsRNA的水凝胶显示出略大的平均粒径（201–248 μm），与未负载dsRNA的水凝胶（146–188 μm）相比，表明dsRNA成功整合到了基质中。dsRNA加载后观察到的粒径增加进一步支持了成功的封装，并可能影响纳米制剂的释放动力学和稳定性。使用高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）和环形暗场成像进一步确认了纳米粒子的形态（图2a和2b）。水凝胶和水凝胶-dsRNA复合物呈现为密集、不规则的球体。纯明胶水凝胶的粒径范围为104–643 nm，而负载dsRNA的水凝胶粒子更加紧凑且呈球形，范围为359–643 nm。

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**图1. 扫描电子显微镜（SEM）图像，显示（a）明胶纳米水凝胶和（b）负载dsRNA的明胶纳米水凝胶制剂的表面形态。纳米粒子表现出相对均匀和多孔的表面结构。负载dsRNA的制剂显示出表面形态和质地的明显变化，表明dsRNA在水凝胶基质中的成功封装和相互作用。**
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**图2. 透射电子显微镜（TEM）图像，显示（a）明胶纳米水凝胶和（b）负载dsRNA的明胶纳米水凝胶制剂的形态和粒径分布。纳米粒子主要呈球形，具有纳米级的粒径分布。负载dsRNA的制剂显示出粒径和表面质地的轻微变化，表明dsRNA在水凝胶基质中的成功整合。**
在SEM中观察到的粒径（201–248 μm）代表了由于样品制备过程中的干燥和交联而形成的较大水凝胶聚集体，而TEM分析揭示了水凝胶基质内的主要纳米粒子结构（104–643 nm）。因此，SEM捕捉到了宏观聚集的网络形态，而TEM提供了水凝胶-dsRNA复合物内在纳米级粒径的见解。SEM分析揭示了微米级（201–248 μm）的结构，这些结构是在真空条件下样品制备过程中形成的干燥和交联的水凝胶聚集体。相比之下，TEM分析是在分散良好的样品上进行的，揭示了104–643 nm范围内的主要纳米粒子结构。这种差异是因为SEM捕捉到了脱水的水凝胶薄膜或聚集体的整体形态，而TEM提供了水凝胶-dsRNA复合物内在纳米级粒子的见解。因此，这两种技术提供了关于水凝胶-dsRNA制剂结构组织的互补信息。SEM和TEM之间观察到的尺寸变化是由于SEM样品制备过程中的脱水引起的聚集造成的。**

**FTIR光谱分析**
傅里叶变换红外（FTIR）光谱用于确认dsRNA整合到水凝胶基质中（图3a和3b）。水凝胶在2927和2884 cm?1处显示出特征吸收带，对应于饱和的C-H伸缩振动。1412、1329和1213 cm?1处的峰归因于氨基的N-H弯曲和甘醇的对称COO?伸缩。1107和1024 cm?1处的额外带分别归因于C-O-C和OC-O?伸缩振动。水凝胶-dsRNA复合物中1649 cm?1处的明显峰证实了dsRNA与水凝胶的成功结合。

**水凝胶封装dsRNA的稳定性**
为了评估水凝胶制剂的保护效果，将游离（裸露）dsRNA和水凝胶封装的dsRNA分别暴露在直射阳光和紫外线下0、2、4、6和8小时。裸露的dsRNA在1小时内完全降解，而水凝胶封装的dsRNA在阳光和紫外线条件下均保持稳定和完整，长达8小时（图S6）。结果通过琼脂糖凝胶电泳上没有任何可见带得到证实。使用ImageJ进行密度计分析的带强度表明，与初始时间点（0小时）相比，裸露dsRNA的信号减少了>95%，证实了几乎完全降解。然而，在配方dsRNA中，即使在阳光和紫外线条件下暴露8小时后，带仍然可见。这些结果突显了明胶水凝胶基质提供的增强环境稳定性。

**水凝胶递送的dsRNA对EcR表达的剂量依赖性死亡率和沉默**
生物测定表明，摄入水凝胶递送的dsRNA导致死亡率随时间逐渐增加，在所有时间点（24、48和72小时）都观察到了显著效果。死亡率稳步增加，在处理后72小时达到约70%，显著高于对照组（图4）。定量RT-PCR分析显示，在最低测试浓度（50 μg/mL）下，EcR转录水平与对照组相当，没有观察到显著差异（p = 0.9413；ns）。相比之下，在较高dsRNA浓度下检测到EcR表达的显著下调。100 μg/mL的处理导致表达显著减少（相对于对照组减少了约35%，p < 0.0001）。同样，150 μg/mL的处理也引起了中等但统计上显著的抑制（减少了约11%，p = 0.0169）。在200 μg/mL下观察到的基因沉默最为明显，EcR表达水平相对于对照组减少了约72%，代表了所有处理中最高的抑制水平（p < 0.0001）。总体而言，这些结果表明，水凝胶介导的dsRNA递送有效诱导了稳健且浓度依赖的RNAi反应，在较高dsRNA浓度下实现了最大程度的沉默。使用Dunnett的多重比较测试进行的统计分析进一步证实，100、150和200 μg/mL的处理与对照组有显著差异（图5）。

**结论**
本研究评估了基于明胶的纳米水凝胶制剂递送dsRNA靶向B. tabaci中的EcR基因的潜力及其对昆虫死亡率的影响。先前的研究已经证明了各种纳米配方dsRNA平台对多种昆虫害虫的增强效果（Christiaens等人，2018年；Dhandapani等人，2021年）。最近的研究进一步强调了此类纳米载体在保持dsRNA完整性方面的生物相容性和保护潜力（Ma等人，2024年）。本研究中选择的EcR基因是昆虫发育的关键调节因子；然而，它在不同昆虫物种中也高度保守。这引发了关于对非目标生物（特别是有益昆虫，如授粉者和天敌）产生意外影响的潜在担忧。尽管RNAi本质上是序列特异性的，但如果存在足够的序列相似性，仍可能发生脱靶效应。为了降低这种风险，本研究中的双链RNA（dsRNA）是使用SiDirect 2.0设计的，并通过BLAST分析针对非目标昆虫数据集进行了进一步筛选，确保没有≥19-21个核苷酸的连续匹配。选择dsRNA靶区时避开了保守的功能域，如DNA结合区和配体结合区，从而进一步提高了靶标特异性，并减少了了对非目标生物的意外影响的可能性。然而，在实际应用之前，必须进行全面的生物安全评估，涉及非目标生物。从监管角度来看，一些国家对可能对授粉者（尤其是蜜蜂）产生不利影响的害虫控制剂实施了严格限制。因此，在将基于RNAi的技术应用于农业系统之前，必须严格验证其环境安全性和物种特异性。在这种情况下，由于明胶具有无毒性和与dsRNA的强生物相容性，被选为水凝胶-dsRNA构建的生物聚合物基质。与传统的单相配方不同，这里开发的水凝胶包含多个相互作用成分。值得注意的是，本研究中的明胶/甘油体系作为一种水凝胶基质，具有类似乳液的稳定特性。虽然不是由固体颗粒稳定的经典Pickering乳液，但该配方在减少水分蒸发和增强保湿方面表现出Pickering类型的行为，从而提高了dsRNA的环境稳定性。这一特性支持了dsRNA的增强环境稳定性。在这个系统中，水凝胶作为一种保护性基质，保护dsRNA免受紫外线辐射和核酸酶介导的降解等环境压力的影响，从而提高了其持久性和功能稳定性。凝胶延迟实验确认，在1:250的水凝胶比例下，dsRNA完全结合，表明dsRNA的负电荷磷酸基团与明胶的正电荷氨基团之间存在强烈的静电相互作用。这一结果与我们之前使用壳聚糖纳米颗粒对B. tabaci的研究结果一致（Keppanan等人，2024年）。鉴于明胶的成本效益、可生物降解性和天然来源，它比合成纳米载体具有优势。尽管该配方在冷藏条件下表现出短期稳定性，但对长期保质期的全面评估，包括温度波动和储存时间对纳米颗粒完整性和dsRNA释放的影响，对于实际应用和商业化至关重要。通过SEM和TEM的形态分析证实了dsRNA已整合到水凝胶基质中。与未负载的对照组相比，封装的颗粒直径增加（359-643纳米），表明dsRNA成功结合。这些观察结果支持了先前的研究（Sharma等人，2021年；Kolge等人，2023年），其中dsRNA的加载改变了纳米颗粒的大小和结构。水凝胶的高吸水能力有助于形成水合微环境，防止dsRNA干燥，并在环境条件下维持其结构完整性。需要注意的是，虽然吸水作用不直接参与RNAi机制，但在提高dsRNA稳定性和递送效率方面起着关键作用。FTIR分析进一步证实了dsRNA与水凝胶的结合。与功能基团相关的特征峰（例如N-H弯曲和COO?拉伸）明显可见，其中1648 cm?1处的峰表明了dsRNA的存在。这些结果与先前的报告一致，其中在dsRNA与壳聚糖或其他生物聚合物结合时也观察到了类似的峰位移（Kolge等人，2023年）。阳离子载体和阴离子dsRNA之间的静电组装在形成稳定的颗粒复合物方面起着关键作用，从而提高了递送效率和分子稳定性（Dhandapani等人，2021年）。水凝胶通常在吸水后会发生膨胀，这可能显著影响封装生物分子的释放动力学。在本研究中，明胶基纳米颗粒的膨胀行为可能有助于dsRNA从聚合物网络中逐渐扩散，从而提高其生物利用度和目标昆虫的吸收。然而，膨胀动力学和释放动力学的定量评估超出了本研究的范围，需要进一步研究。明胶纳米水凝胶的保护效果在紫外线和阳光照射下得到了证实。未受保护的dsRNA在一小时内降解，而封装的dsRNA则保持完整长达8小时，突显了水凝胶对环境降解的屏障作用。这种稳定性可能是由于dsRNA与生物聚合物基质之间的相互作用形成的核壳结构（Kolge等人，2021年）。重要的是，这种配方不包含已知可能在田间应用中损害植物生长的无机交联剂（Wang等人，2020年）。相比之下，基于明胶的基质是可生物降解和生物相容的，先前的研究表明它们可能与植物系统兼容（Shah等人，2022年）。然而，本研究未评估该配方对植物健康的影响，需要进一步研究。在dsRNA处理后观察到的Bemisia tabaci死亡率增加与EcR转录本的显著抑制密切相关，这突显了蜕皮激素信号在成虫生理中的关键作用。EcR是一种依赖配体的核转录因子，介导20-羟基蜕皮激素的作用，并调节对发育、细胞稳态和生理适应至关重要的下游基因的表达。通过RNAi破坏EcR表达可能会干扰这种激素信号级联，导致基因表达的系统失调。尽管蜕皮激素信号通常与蜕皮和变态相关，但其在成虫中的功能相关性越来越受到重视。在成虫B. tabaci中，EcR参与生殖调节，包括卵黄生成和卵母细胞成熟，以及维持代谢平衡和组织完整性。因此，本研究中观察到的EcR显著下调可能会损害这些关键过程，导致生理功能障碍。各处理组观察到的高死亡率进一步表明，EcR介导的途径的破坏不仅影响生殖，还影响营养利用、应激反应和细胞维持等生存相关过程。这种累积的生理负担可能导致适应性降低和最终死亡。总体而言，EcR下调与死亡率之间的强相关性提供了机制证据，表明通过RNAi靶向激素信号通路是控制B. tabaci种群的有效策略，这一点也得到了最近研究的支持，这些研究表明EcR在Henosepilachna vigintioctopunctata的发育、繁殖和生存中起着关键作用（Wu等人，2021年）。值得注意的是，通过水凝胶介导的递送所实现的增强效果强调了持续dsRNA可用性在实现有效基因沉默和表型结果方面的重要性。总体而言，EcR下调与死亡率之间的强相关性提供了机制证据，表明通过RNAi靶向激素信号通路是控制B. tabaci种群的有效策略。这些结果与先前的报告一致，其中低剂量（10-20 ng）的dsRNA有效沉默了Diaphorina citri和Bemisia tabaci的基因（Killiny等人，2014年；Luo等人，2017年）。这里观察到的增强RNAi效果表明，基于明胶的水凝胶提供了高效的dsRNA递送和持续释放，从而改善了RNAi介导的害虫控制。使用壳聚糖、碳量子点和其他纳米材料的类似递送平台也在抑制昆虫物种的基因表达方面显示出了有希望的结果（Dhandapani等人，2021年）。此外，我们的研究支持了先前的发现，即B. tabaci中的dsRNA降解主要是由于特定核酸酶的存在（Vyas等人，2017年）。通过保护dsRNA免受这些酶的侵害，我们的明胶水凝胶方法在基因下调方面表现出优越的效果，特别是在B. tabaci的Asia-I隐存物种中。尽管在受控实验室条件下获得了有希望的结果，但仍需考虑几个限制。首先，水凝胶-dsRNA配方在田间条件下的有效性和稳定性仍有待验证，环境因素如温度波动、降雨和紫外线照射可能会影响其性能。其次，尽管通过仔细设计dsRNA来尽量减少脱靶效应，但全面评估非目标生物（特别是授粉者和天敌）的影响是必要的。第三，大规模生产和储存及运输过程中的配方稳定性可能会带来实际挑战，需要解决这些问题以实现商业化应用。因此，未来的研究应重点关注田间试验、生物安全评估、释放动力学的优化以及可扩展的生产策略，以促进这项技术向可持续害虫管理方案的转化。

结论

本研究强调了基于明胶/甘油的纳米水凝胶作为一种安全、可生物降解且稳定的dsRNA递送平台的有效性。它显著提高了B. tabaci（Asia-I）中dsRNA的持久性和基因沉默效率，为化学杀虫剂提供了一种可持续、环保的替代方案。然而，还需要进一步研究来评估对非目标生物的潜在影响，优化释放动力学，并验证该系统在田间条件下的有效性和安全性。这项技术也符合“同一健康”（One Health）原则，促进了对人类、植物和生态系统安全的昆虫害虫管理解决方案。

声明和声明

伦理批准和参与同意：不适用于本研究。

未引用的参考文献：
(Bai-Zhong等人，2020年；Kunte等人，2020年；López-Velázquez等人，2019年；Park等人，2006年；Rank和Koch，2021年；Suhag等人，2021年；Yan等人，2020年；Zotti等人，2018年)

CRediT作者贡献声明：
Karuppannasamy Ashok：撰写——原始草稿、验证、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。
Keppanan Ravindran：正式分析、数据管理。
Prasad Babu Karakatti：正式分析、数据管理。
Asokan Ramasamy：撰写——审阅与编辑、可视化、监督、软件、资源、项目管理、资金获取、概念化。
Subaharan Kesavan：监督、资源。
Venkatesan Thiruvengadam：验证、监督。