《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Neuspectrum: A novel transcriptional framework for high-resolution annotation of neutrophil heterogeneity
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中性粒细胞长期以来被认为是先天免疫系统的关键参与者，在介导炎症反应和调节过程中发挥核心作用。近期研究揭示中性粒细胞具有异质性，并在免疫系统中执行独特功能。然而，外周中性粒细胞亚群的精确鉴定仍面临重大挑战，现有方法无法完全捕捉中性粒细胞异质性的复杂性。为解决这一
中性粒细胞长期以来被认为是先天免疫系统的关键参与者，在介导炎症反应和调节过程中发挥核心作用。近期研究揭示中性粒细胞具有异质性，并在免疫系统中执行独特功能。然而，外周中性粒细胞亚群的精确鉴定仍面临重大挑战，现有方法无法完全捕捉中性粒细胞异质性的复杂性。为解决这一挑战，研究人员开发了Neuspectrum——一种整合多种转录指标以评估外周中性粒细胞功能和成熟状态的创新注释框架。Neuspectrum助力在单细胞RNA测序(scRNA-seq)和批量RNA测序(bulk RNA-seq)数据中对中性粒细胞异质性进行高分辨率分析，并揭示了G5b亚群内的新型异质性。此外，Neuspectrum的预测为外周中性粒细胞异质性变化提供了细致入微的见解，特别是在不同疾病状态和药物干预期间。总之，Neuspectrum作为一种评估中性粒细胞异质性的新型工具，为鉴定中性粒细胞亚群及制定中性粒细胞相关疾病策略提供了强大平台。
论文解读：Neuspectrum——中性粒细胞异质性解析的新范式
研究背景与立论依据
中性粒细胞作为先天免疫的核心效应细胞，通过吞噬、杀伤和消化等过程抵御病原体，其异质性表现为不同亚群在功能状态和成熟阶段上的差异。尽管单细胞RNA测序(scRNA-seq)已成为解析细胞异质性的主流技术，但中性粒细胞作为终末分化细胞，其转录组变异性大，缺乏特异性单一生物标志物，导致传统注释工具（如SingleR、Celltypist）难以精准识别亚群。此外，现有方法依赖复杂的标志物组合，易产生注释误差，且缺乏对中性粒细胞亚群生物学可解释性的关注。因此，开发针对中性粒细胞的特异性分类算法成为领域迫切需求。本研究由浙江大学药学院团队完成，成果发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》。
关键技术方法
研究基于健康供体外周血样本（经伦理审批，年龄20-50岁，无炎症体征），整合公共数据库（GEO）的小鼠及人类中性粒细胞scRNA-seq数据（如GSE137540、GSM4081555）和批量RNA-seq数据（如GSE230048、GSE71010）。核心技术包括：构建功能状态指数(FSI)和成熟状态指数(MSI)，通过差异基因表达分析和线性相关模型计算细胞坐标；利用Monocle2进行细胞轨迹分析；采用流式细胞术验证表面标志物；通过基因本体(GO)富集和通路评分（如AddModuleScore、ssgsea）评估亚群功能特征。
研究结果
- 1.
外周中性粒细胞亚群参考转录图谱构建
通过重新分析小鼠外周血和脾脏中性粒细胞scRNA-seq数据，研究人员鉴定出三个经典亚群：G5a（高表达迁移相关基因Retnlg、Wfdc21）、G5b（高表达干扰素刺激基因Ifit3、Rsad2）和G5c（高表达代谢相关基因Gngt2、Fgl2），为后续分析奠定基础。
- 2.
FSI区分G5a与G5b功能状态
通过比较G5a与G5b的差异表达基因(DEGs)，筛选出17个关键基因构建FSI。结果显示，G5b亚群的FSI评分显著高于G5a，且在ra-rb坐标系中呈线性分离（R2=0.88），表明FSI可有效量化功能状态差异。
- 3.
MSI表征中性粒细胞成熟状态
基于G5c与G5a/G5b的DEGs筛选141个基因构建成熟状态指数(MSI)。分析发现G5b亚群存在异质性，可进一步分为G5b-I（MSI<0，低成熟）和G5b-II（MSI>0，高成熟）。G5c亚群的MSI评分最高，符合其终末成熟特征。
- 4.
中性粒细胞轨迹分析揭示伪时间动态
利用FSI和MSI相关基因构建细胞轨迹，显示G5a为起点，G5c为终点，G5b-I和G5b-II位于中间阶段。基因表达沿伪时间轴呈动态变化：Fgl2、Gm2a随成熟上调，Lcn2、Mmp8下调，而Ifit1等干扰素响应基因呈先升后降趋势。
- 5.
流式细胞术验证G5b亚群异质性
以FGL2为标志物，研究人员在人类外周血中成功分离出G5b-I（IFIT1?FGL2lo）和G5b-II（IFIT1?FGL2hi），验证了单细胞测序结果的可靠性。
- 6.
Neuspectrum框架开发与验证
整合FSI和MSI，研究人员构建了Neuspectrum注释工具，将中性粒细胞分为四类：G5a（MSI<0; FSI<0）、G5b-I（MSI<0; FSI>0）、G5b-II（MSI>0; FSI>0）、G5c（MSI>0; FSI<0）。该工具在小鼠感染模型和人类疾病数据（囊性纤维化、哮喘、幼年特发性关节炎）中均表现出稳定的亚群预测能力。
- 7.
疾病与药物干预下的中性粒细胞亚群特征
在囊性纤维化患者中，G5a亚群比例显著升高（60%）；哮喘患者对吸入性糖皮质激素(ICS)无应答(NR)组中，G5b-I/G5b-II比例高于应答(R)组；幼年特发性关节炎患者接受托珠单抗治疗后，G5b-II比例从50%降至0%。这些结果表明Neuspectrum可有效解析病理状态下的中性粒细胞重塑。
讨论与结论
讨论部分指出，Neuspectrum通过FSI和MSI实现了中性粒细胞亚群的标准化定量，为药物研发提供了表型评估工具（如监测药物对亚群比例的影响）。局限性在于未涵盖组织特异性、代谢重编程等维度，未来需整合多组学数据。结论强调，Neuspectrum作为新型转录框架，填补了中性粒细胞亚群注释工具的空白，为理解中性粒细胞生物学及相关疾病机制提供了关键支撑。
