使用基于银纳米粒子的方法评估丙戊酸对2型糖尿病患者NADH水平的影响：一项体外研究

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Assessing valproate-induced changes in NADH levels in patients with type 2 diabetes using a silver nanoparticle-based method: An in-vitro study

　　

萨娜·埃斯马埃利（Sana Esmaeeli）|玛丽亚姆·库布纳萨巴吉法里（Maryam Khoubnasabjafari）|埃拉赫·拉希姆普尔（Elaheh Rahimpour）|阿博尔加塞姆·朱伊班（Abolghasem Jouyban）

伊朗大不里士医科大学传染病与热带疾病研究中心

摘要

2型糖尿病是一种常见的代谢性疾病，与氧化应激增加和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺/NADH）比例失衡有关。NADH作为一种关键的代谢生物标志物，在评估氧化状态中起着至关重要的作用。本文介绍了一种基于原位合成银纳米颗粒（Ag NPs）的分光光度法，用于定量NADH。在该方法中，NADH作为还原剂将Ag⁺还原为Ag⁰，从而形成银纳米颗粒，这些颗粒在425 nm处具有特定的光吸收。收集2型糖尿病患者的血浆，并使用上述方法检测其NADH水平。随后，每个血浆样本在体外用治疗剂量的丙戊酸钠处理，最后通过所开发的方法测量其NADH浓度。该方法能够检测到低至0.05 μmol/L^-1的NADH浓度，并在0.22–3.8 μmol/L^-1范围内表现出良好的线性（R2 = 0.9965）。该方法具有可接受的精度，日内重复性和日间重复性分别为4.6%和7.4%（RSD）。体外研究表明，加入丙戊酸钠后NADH水平下降，且这种下降与丙戊酸钠浓度的增加成正比，表明这种抗癫痫药物会影响2型糖尿病患者的氧化状态。

引言

2型糖尿病（T2DM）是一种慢性代谢紊乱疾病，其发病率在全球范围内呈持续上升趋势[1]。T2DM与慢性氧化应激和线粒体氧化还原平衡失调有关，通常表现为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺/NADH）比例降低以及氧化磷酸化途径受损。线粒体复合体I（NADH–泛醌氧化还原酶）在氧化NADH和驱动电子传递链中起核心作用；其功能障碍会直接导致T2DM的代谢紊乱[2]。

丙戊酸钠传统上用作抗癫痫药物，现已成为治疗T2DM相关并发症的有希望的候选药物[3]。最近的研究表明，它能有效缓解疼痛性糖尿病神经病变（T2DM患者常见的微血管并发症），提供显著的主观改善和良好的耐受性[4]。除了神经病变疼痛管理外，丙戊酸钠作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACI）的作用还涉及表观遗传调控，影响基因转录和染色质重塑过程，这些过程对糖尿病及其并发症的发病机制至关重要[5]。值得注意的是，丙戊酸钠通过抑制内质网应激诱导的细胞凋亡来减轻糖尿病肾病，显示出其在缓解糖尿病引起的细胞损伤方面的潜力[5]。此外，丙戊酸钠对线粒体功能和氧化应激途径的影响进一步支持了其在糖尿病治疗中的重要性[6],[7]。尽管取得了这些进展，但丙戊酸钠对细胞氧化还原状态（特别是血浆NADH水平）的物理化学效应仍需进一步研究。

NADH是细胞代谢、能量转移和氧化还原信号传导中的关键辅酶[8]，在葡萄糖代谢和氧化应激调节中起着重要作用，而这两者在T2DM中常常失调[9]。NADH主要通过糖酵解和克雷布斯循环等途径生成[10]。在这些过程中，来自葡萄糖代谢的电子储存在NADH中[11]。NADH随后将电子传递给线粒体内的电子传递链，推动三磷酸腺苷（ATP）的产生，ATP是细胞的主要能量来源[9]。在非糖尿病的β细胞中，葡萄糖代谢产生NADH和ATP，这对胰岛素分泌至关重要[12]。然而，在糖尿病常见的高血糖条件下，NADH可能会过度生成，导致还原应激[10]。在T2DM中，葡萄糖诱导的NADH和ATP增加受到抑制，氧化和糖酵解葡萄糖代谢均减弱[12]。氧化应激通常由NAD⁺/NADH氧化还原状态失衡和线粒体功能障碍驱动，被认为是糖尿病肾病等病症的主要病理生理机制[13]。NADH与其氧化形式NAD⁺之间的适当平衡对代谢和氧化还原信号传导至关重要[10]。

尽管已知丙戊酸钠对线粒体和氧化应激有影响[14],[15]，但迄今为止尚无研究探讨其对T2DM患者血浆NADH水平的直接影响，也未研究其在体外血浆模型中调节氧化还原平衡的潜力。本研究旨在通过评估丙戊酸钠对T2DM患者血浆NADH水平的直接影响来填补这一知识空白。为此，采用了一种基于原位合成银纳米颗粒（Ag NPs）的分光光度法来定量NADH。这种方法是一种经济高效且灵敏的光学技术，可用于检测生物流体中的NADH浓度变化。在方法优化和验证过程中，使用上述方法分析了2型糖尿病患者的血浆基线NADH水平。随后，每个样本在体外用治疗剂量的丙戊酸钠处理，并重新测量NADH浓度，以评估丙戊酸钠对血浆样本中NADH水平的影响。这项研究开创了一种新的抗糖尿病策略，直接通过调节NADH水平来纠正糖尿病中的氧化还原失衡。药物再利用、氧化还原生物标志物定量和基于纳米颗粒的分析方法的结合为理解T2DM中的代谢调节提供了新的转化策略。

章节摘录

试剂

所有试剂均为分析级试剂，所有溶液均使用双蒸馏去离子水配制。本研究中使用的试剂包括从Merck（德国达姆施塔特）购买的AgNO₃和NaOH，从Sigma-Aldrich（美国马萨诸塞州）购买的Triton X-114和NADH，以及从Scharlau（西班牙巴塞罗那）购买的NH₃。丙戊酸钠由Rouz Darou制药公司（伊朗德黑兰）提供。

仪器

使用的是Shimadzu UV-1800分光光度计（日本东京Shimadzu公司）及相应的微石英比色池

NADH检测机制

由于NADH会发生电氧化反应[16]，预计它可以作为还原剂使银离子生成Ag NPs。另一方面，据报道Ag?/Ag的电极电位（E° vs NHE）为+0.80 V，NAD?/NADH的电极电位为-0.32 V[17]，表明该反应在热力学上是可行的。然而，初步实验表明，尽管热力学上可行，但反应在动力学上并不有利。后续研究表明……

结论

总之，本研究有两个主要目标：首先，介绍并验证一种基于Ag NPs形成的分光光度法，用于测量人血浆中的NADH；其次，利用该方法在体外环境中研究丙戊酸钠对NADH的影响。所开发的方法在定量NADH方面表现出可接受的分析性能。该方法比其他技术更简单、更经济高效，能够直接……

伦理批准和参与同意

所有实验均遵循赫尔辛基宣言的相关指南和规定（伦理批准和参与同意）。向所有参与者解释了研究的目的和方法，并确保他们的信息保密。从参与者处获得了知情同意（包括解释研究的目标和方法）。访谈者宣读了知情同意书的内容

生成式AI声明

作者声明在撰写本手稿时使用了生成式AI。在准备过程中，作者利用AI工具来改进写作流程并提高手稿的可读性和语言质量。使用该工具/服务后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对发表文章的内容承担全部责任。

资助

本研究得到了大不里士医科大学研究事务部的支持，资助编号为77090。

CRediT作者贡献声明

玛丽亚姆·库布纳萨巴吉法里（Maryam Khoubnasabjafari）： 资源提供。萨娜·埃斯马埃利（Sana Esmaeeli）： 写作——初稿撰写、实验设计。阿博尔加塞姆·朱伊班（Abolghasem Jouyban）： 写作——审稿与编辑、验证、监督。埃拉赫·拉希姆普尔（Elaheh Rahimpour）： 写作——审稿与编辑、监督、形式分析、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的研究。

致谢

作者声明没有利益冲突。