重新审视砹-211的分析方法：反相高效液相色谱中的保留效应

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Reconsidering Astatine-211 Analytics: Retention Effects in Reversed-Phase HPLC

　　斯文·亨佩特（Swen Humpert）|卢卡斯·穆斯（Lucas Mues）|娜迪亚·B·佩德森（Nadia B. Pedersen）|费利克斯·诺伊迈尔（Felix Neumaier）|马蒂亚斯·M·赫特（Matthias M. Herth）|伯恩德·诺伊迈尔（Bernd Neumaier）
于利希研究中心有限公司（Forschungszentrum Jülich GmbH），神经科学与医学研究所，核化学部（INM-5），威廉-约翰恩街（Wilhelm-Johnen-Str.），52428，于利希，德国

**摘要**
砹-211是一种半衰期较短的α射线发射放射性核素，通过靶向α疗法（TAT）在癌症治疗中具有巨大潜力。反相高效液相色谱法（RP-HPLC）是开发和使用211At标记的放射性药物的关键技术。然而，由于砹的极低浓度及其复杂的、不可预测的化学行为，精确分析仍然具有挑战性。在这项研究中，我们系统地评估了在不同氧化还原条件下使用各种色谱条件时代表性无机砹配方的回收率，这是实现可靠定量的前提。对四种具有不同固定相化学性质的色谱柱的测试表明，如果仅基于洗脱活性来评估放射性转化，可能会产生显著差异，而这通常是RP-HPLC分析的标准做法。在所测试的色谱条件下，使用含有0.4%三乙胺的碱性流动相与耐碱固定相组合时，获得了最高且最稳定的砹回收率（88-98%），这可能是由于在碱性条件下砹的物种形态发生变化、与固定相的二次相互作用减少，以及潜在的有益离子配对效应。相比之下，广泛使用的基于乙腈/水的标准溶剂系统（无论是否添加0.1%三氟乙酸）在所有测试的色谱柱上均显示出不满意且高度变异的回收率（分别为7-71%或30-79%）。这些发现强调了优化色谱条件的必要性，并表明如果不通过辅助定量策略明确考虑自由态砹的回收情况，可能会导致对放射性药物配方中放射性转化和纯度的严重误估。

**1. 引言**
靶向α疗法（TAT）是一种新兴的癌症治疗方法，通过肿瘤靶向载体将α射线发射放射性核素选择性地递送到恶性细胞中。α粒子的高线性能量传递（LET）赋予其强大的细胞毒性效应，其相对生物效应（RBE）显著高于β射线发射体。结合其较短的组织穿透范围（通常不超过几个细胞直径），这使得可以在对周围健康组织造成最小损害的情况下实现局部肿瘤消融。
在目前研究的各种α射线发射体中，砹-211因其优异的物理和化学性质而受到广泛关注。作为一种卤素元素和自然界中最稀有的元素，砹-211在化学行为上具有独特性。它的衰变过程简单，仅释放一个α粒子，从而便于直接进行剂量测量，这与锕-225、铅-212或铋-213等放射性金属不同，后者属于复杂的衰变链[1]。其7.2小时的半衰期为合成可行性、（临床前）工作流程以及废物管理和患者护理提供了实际平衡。此外，砹能够与碳原子形成共价键，从而实现直接放射标记，同时对药效团结构的干扰最小，这比基于放射性金属的螯合策略具有显著优势[2]。
随着临床兴趣的增加，开发稳定且肿瘤特异性的211At标记放射性药物的工作也在同步进行。由于这些化合物在治疗应用中的用量极低以及大多数临床放射性核素的半衰期较短，分析方法必须具有高灵敏度和快速性。因此，反相高效液相色谱法（RP-HPLC）已成为方法开发和质量控制的行业标准。然而，对于某些放射性核素（如氟-18和镓-68），观察到它们会在RP-HPLC色谱柱上发生非特异性吸附，如果不加以妥善处理，可能会显著影响结果的解释[3],[4],[5]。
相比之下，碘同位素通常被视为砹的化学类似物，其色谱行为较为简单[6],[7]。然而，尽管它们表面上相似，但砹的化学性质和色谱行为存在显著差异[8]。砹可以存在于多种氧化态，并且其水相中的物种形态复杂且难以理解，这种形态取决于pH值和氧化还原电位[9]。特别是，砹可以以中性形式（At0）、还原形式（例如At?）或氧化形式（例如At+, AtO+及更高氧化态）存在。这些形式的相对分布受化学环境的影响，并且在典型的放射化学条件下可能会动态变化。此外，这些物种在RP-HPLC中的色谱行为也有所不同：更疏水或中性的形式通常具有更高的保留率，而离子形式则可能根据其电荷和极性与残留的硅醇基团相互作用或以较低的保留率洗脱。因此，砹复杂的物种形态可能是导致保留效应和回收率变异的关键因素。此外，砹以真正的无载体形式存在，其浓度比添加载体的放射性核素低几个数量级，这进一步增加了问题的复杂性。这种极端稀释效应会增强与固定相的相互作用，从而增加了其化学和色谱行为的不可预测性，这种特性被描述为“变色龙般”的[10],[11]。与砹不同，对于已建立的放射性核素（如碳-11、氟-18或锝-99m），放射性分析物的回收率是一个公认的关键参数，并已在分析文献和监管框架（包括药典专著，例如欧洲药典）中得到广泛讨论[12]。对于这些放射性核素，在方法开发和验证过程中通常会考虑非特异性吸附和回收损失，特别是在放射性药物质量控制方面[3],[13],[14]。然而，尽管砹越来越受欢迎，但目前只有少数方法被提出用于解决保留效应问题，例如使用硫化钠柱清洗来洗脱和定量保留的自由态砹[15]，或使用双流式细胞辐射探测器进行回收率定量[16]。虽然这些方法的应用为HPLC柱上砹的辐射剂量依赖性保留提供了明确证据[17]，但它们很少被系统地应用，而且关于控制砹保留和回收率的色谱参数的全面评估仍然缺乏。在我们新建立的砹实验室建立工作流程时，我们也观察到通过柱后注射进行活性平衡时砹的回收率较低，这是一种我们实验室常用的技术来校正保留效应[5]。这些观察结果促使我们进行了本研究，系统地研究了RP-HPLC条件下控制砹保留的色谱参数，并使用互补的在线和离线定量方法进行了验证。通过确定最小化保留并提高定量可靠性的参数，本研究为211At标记放射性药物的开发和质量控制提供了实际指导。

**2. 材料与方法**
2.1. 通用材料
所有HPLC溶剂均为HPLC梯度级，购自Merck KGaA（德国达姆施塔特）或Sigma-Aldrich（德国陶夫基兴）。超纯水（电阻率> 15 MΩ·cm）使用ELGA Purelab classic系统（ELGA LabWater，德国策勒）新鲜制备。所有有机溶剂、试剂和HPLC溶剂改性剂均为分析试剂级或更高级别，购自Merck KGaA或Sigma-Aldrich。除非另有说明，所有试剂均按收到状态使用，无需进一步纯化。放射性使用Comecer TALETE HC剂量校准器（COMECER S.p.A., 意大利卡斯特尔博洛涅塞）进行测量，该校准器经过与EG&G Ortec GEM-20190高纯度锗探测器（EG&G Ortec, 美国橡树岭）的交叉校准。
2.2. 砹-211的生产和纯化
砹-211是通过209Bi(α,2n)211At核反应产生的，该方法使用IBA cyclone 30XP回旋加速器（IBA International, 比利时鲁汶-拉-纽夫）以50 μAe的电流和约29.2 MeV的α粒子轰击纯度为99.99%的铋靶（Strategic Elements, 德国德根多夫）。靶材是在铝合金基底上熔化铋层（厚度30–50 mg/cm2）制成的。辐照后，靶材从基底上机械分离出来，并根据已建立的砹干馏程序分离出砹-211（具体方法参见[18],[19],[20]，并做了一些调整）。简要来说，将辐照后的铋放入预热至750 °C的石英管烤箱中，并使用干燥的合成空气作为载气进行蒸馏。挥发的砹-211收集在-40 °C的聚合物管中，然后用氯仿（50–200 μL）洗脱。氯仿在氩气流下常压下蒸发至干燥。
2.3. 样品制备
纯化并干燥后的砹-211被重新配制成三种溶液，以代表放射性药物配方中可能存在的不同化学形式：(i) 1 mg/mL的N-氯琥珀酰亚胺在甲醇中的溶液（亲电型211At），(ii) 100 mg/mL的抗坏血酸在乙腈（MeCN）/水中的溶液（亲核型211At），以及(iii) 纯乙腈/水中的溶液（天然型211At）。选择这些配方是为了模拟砹放射化学中常见的氧化、还原和非修饰条件，而不是代表单一、明确的化学物种。活性浓度调整至3 MBq/mL，样品在注入HPLC系统前至少孵育20分钟。所有实验均使用独立纯化的砹批次新鲜制备的样品进行三次重复。
2.4. HPLC
HPLC系统包括一台AZURA P6.1 L梯度泵（Knauer, 德国柏林），两个Rheodyne 7725i高压注射阀（Rheodyne LLC, 美国罗纳特帕克），分别位于色谱柱前后，以及一个Ortec 3′′ NaI(Tl)井型闪烁探测器和一个Ortec 925-SCINT单通道分析仪（Advanced Measurement Technology Inc., 美国橡树岭）。作为流动池使用了一根内径0.8 mm、长度约20 cm的聚丙烯管。样品通过全循环注射方式注入，使用20 μL的样品环。数据采集使用Knauer ClarityChrome软件完成。使用的HPLC柱为制造商提供的型号，使用前对其性能（分离效率和峰对称性）进行了检测：Phenomenex Luna C18(2), 5 μm, 100 ?, 250 × 4.6 mm（Phenomenex Ltd., 德国阿沙芬堡；部件编号00G4252-E0）；Waters XBridge BEH C18, 5 μm, 130 ?, 250 × 4.6 mm（Waters GmbH, 德国埃施博恩；部件编号186003117）；Phenomenex PolymerX, 5 μm, 100 ?, 250 × 4.6 mm（Phenomenex Ltd., 德国；部件编号00G-4326-E0）；Merck Chromolith Performance RP-18封端型，100 × 4.6 mm（Merck KGaA；部件编号1.02129.0001）。溶剂改性剂（TFA、抗坏血酸、三乙胺、三乙胺醋酸盐、亚硫酸钠和硫代硫酸钠）分别添加到溶剂A（水相）和B（有机相）中。由于溶解度有限以及防止改性剂在梯度洗脱过程中沉淀，含有抗坏血酸的实验中溶剂B含有20%的水，而含有Na2SO3或Na2S2O3的实验中溶剂B含有30%的水。所有溶剂系统使用的梯度为：0?1分钟：5% B，1?6分钟：5?100% B，6?15分钟：100% B，流速为1 mL/min。
2.5. 砹回收率的定量
回收率通过在线和离线方法进行定量。在线检测采用柱后注射法（图1A），即通过二次注射阀将相同体积的样品直接注入分离柱下游（绕过固定相），从而直接测量总探测器响应（即注入的总活性），不受潜在保留效应的影响[5]。首先，样品通过主注射阀注入（=柱前注射），流出液收集12分钟用于离线定量（=流出液A，见下文）。随后立即通过二次注射阀进行柱后注射，回收率计算为柱前注射的峰值积分与柱后注射的峰值积分之比（两者均校正到相应的注射时间）。对于离线定量，将色谱柱从流动路径中移除，然后通过主注射阀注入相同体积的样品，并使用相同的梯度条件进行洗脱。流出液再次收集12分钟，放入相同的20 mL闪烁瓶中（=流出液B）。两种流出液（A和B）中的活性使用低水平伽马计数器（HIDEX AMG Automatic Gamma Counter, 型号425-601, 芬兰图尔库）进行测量，回收率计算为流出液A（带柱子收集）的衰变校正计数率与流出液B（不带柱子收集）的计数率之比。所有计算均使用相应的仪器软件和/或Microsoft Excel 365（Microsoft Corp., 美国雷德蒙德）完成。

**图1.**通过在线检测量化砹-211的回收率。(A) 用于通过柱后注射确定砹回收率的HPLC设置的示意图。(B) 使用Waters XBridge柱和MeCN/水作为流动相获得的不同砹配方的代表性色谱图。(C) 在相同实验条件下制备和分析的亲电性砹-211的三次重复色谱图（柱：Waters XBridge，溶剂：MeCN/水/0.1% TFA）。(D) 使用Waters XBridge柱和不同流动相（见表2）获得的亲核性砹-211的代表性色谱图。所有实验均使用5–100%有机相的梯度进行，流速为1 mL/min（详见第2.4节）。3. 结果与讨论3.1. 砹回收率的量化通过两种互补的量化方法确定砹-211从HPLC系统的回收率：(1) 通过在线检测在柱前和柱后注射，使用内联辐射检测器；(2) 通过伽马计数对整个流出物进行离线量化，包括有柱和无柱的情况（详见第2.5节）。在线检测是放射性药物质量控制的标准方法，通常会产生清晰、定义明确的211At标记有机化合物的峰。然而，对于游离态砹物种，这种方法不可靠，因为它们常常产生宽泛、拖尾的信号，缺乏明确的峰边界，并且噪声水平较高（图1B）。值得注意的是，这些现象在绕过固定相的柱后注射中没有观察到，这表明它们反映了非特异性保留效应，导致放射性逐渐从柱中释放，例如由于砹物种之间的相互转化。为了解决这个问题，实施了通过伽马计数对整个流出物（有柱和无柱）进行离线检测，特别注意通过标准化的样品大小和几何形状来最小化与砹-211的低能量X射线发射相关的自吸附伪影。虽然这种方法不适用于常规使用，但由于采集时间较长，它提供了更好的活性量化，消除了信号积分的歧义，并更清楚地了解了砹是否实际上被柱子保留或只是在在线监测期间未被检测到。总体而言，在线和离线检测在回收率和方差方面显示出一致的趋势，但也有一些显著的例外（表1）。例如，在中性条件下使用Merck Chromolith柱分析的亲核性和亲电性砹样品偶尔显示出超过100%的在线回收率，这是由于积分错误导致的信号失真。相比之下，离线值保持在理论最大值100%以内，突显了离线检测作为参考方法的价值。表1. 使用MeCN/水（含或不含0.1%三氟乙酸（TFA）作为流动相）从不同HPLC柱中回收砹-211的情况。柱子 砹回收率 [%]a 亲电性At 空细胞 亲核性At 天然At 空细胞 样品平均值 中性+TFA 中性+TFA 中性+TFA 中性+TFA Phenomenex Luna C18 (2) 33 ± 10 (29 ± 9) 16 ± 5 (22 ± 9) 40 ± 18 (41 ± 4) 44 ± 24 (43 ± 19) 41 ± 21 (50 ± 11) 8 ± 4 (14 ± 5) 38 (40) 23 (26) Waters XBridge C18 63 ± 4 (49 ± 7) 37 ± 13 (37 ± 15) 60 ± 12 (30 ± 12) 71 ± 16 (42 ± 10) 43 ± 10 (60 ± 12) 14 ± 4 (16 ± 5) 55 (46) 40 (32) Phenomenex PolymerX 24 ± 13 (24 ± 8) 9 ± 2 (12 ± 4) 28 ± 12 (36 ± 18) 31 ± 2 (30 ± 13) 39 ± 11 (39 ± 14) 7 ± 14 (12 ± 4) 30 (33) 16 (18) Merck Chromolith 80 ± 20 (73 ± 14) 18 ± 2 (25 ± 5) 89 ± 26 (66 ± 11) 68 ± 8 (47 ± 13) 68 ± 13 (68 ± 4) 21 ± 1 (18 ± 3) 79 (69) 36 (30) 柱平均 53 (47) 19 (24) 54 (43) 54 (41) 47 (54) 13 (15)a 回收率通过柱后注射的在线检测和通过伽马计数对有柱和无柱收集的流出物进行量化（每个值n=3）。3.2. 样品组成的影响砹存在多种氧化状态，其化学形式强烈影响色谱行为。因此，评估了三种不同的配方，包括亲电性砹（用N-氯琥珀酰亚胺氧化）、亲核性砹（用抗坏血酸还原）和天然砹（未经氧化还原处理溶解，以模拟脱砹产物）。由于砹在水中的复杂和动态化学性质，这些配方并不代表单一的、定义明确的化学物种，而是由主导氧化还原条件的物种混合物。尽管这些配方没有涵盖生产211At标记放射性药物时可能使用的所有亲电性和亲核性策略所产生的所有砹物种[21],[22]，但它们仍然可以代表在实际配方中可能遇到的主要类别的未反应或游离态砹。从高标准差可以看出，即使是相同配方的样品，在洗脱轮廓上也表现出很大的变化（表1）。这一点在图1C中得到了体现，其中三个名义上相同的样品产生了明显不同的色谱图，不仅在峰积分上有所不同，而且在解析的峰数量上也有所不同。这种变异性强调了砹的动态物种形成以及在缺乏稳定介质的情况下获得一致的亲电性砹-211色谱行为的难度。3.3. 固定相和流动相的影响为了评估柱化学是否影响砹-211的保留，就像已经对n.c.a [18F]氟化物[3]所展示的那样，我们还比较了四种具有不同表面特性的RP-HPLC柱。选择这些柱子的目的是为了覆盖已知会影响非特异性相互作用的各种表面特性，特别是对于像砹这样的具有可变物种形式的痕量级物种。Luna C18(2)柱基于全多孔高纯度硅胶颗粒，具有n-十八烷基硅基修饰和三甲基硅基末端封端，是RP-HPLC方法开发中广泛使用的标准柱。相比之下，Waters XBridge C18柱具有乙烯桥接的混合有机硅核心颗粒，提供了增强的pH稳定性和低硅醇活性，这两个因素都可能影响与砹物种的相互作用。为了进一步探索非硅基固定相，还包括了Phenomenex PolymerX柱。这种柱由聚苯乙烯-二乙烯基苯（PSDVB）共聚物组成，缺乏硅醇活性，并在广泛的pH范围内结合了疏水性保留和高化学稳定性。最后，选择了Merck Chromolith Performance RP-18柱，因为它具有整体硅胶结构，并且对[18F]氟化物的保留较低，这使其成为减少类似卤化物物种的非特异性保留的有希望的候选者。初步实验确认所有柱子的砹保留程度各不相同。值得注意的是，经常观察到之前注射的残留活性，表明从固定相的脱附强烈或延迟。这种“携带”可能会影响后续运行并使回收数据的解释复杂化。鉴于在测量之间等待多个半衰期（砹-211的十个半衰期为约72小时）的不切实际性，根据Guérard及其同事的工作[15]，尝试使用还原剂进行柱再生。通过相对较小的样品环路（20 μL，10 mg/mL）注入亚硫酸钠溶液部分去除了保留的活性，但在后续运行中仍然检测到残留活性。当用至少五倍柱体积的0.5%硫代硫酸钠溶液冲洗柱子时，实现了完全去除。这种较温和的还原剂（pH 6.6）比亚硫酸钠溶液（pH 9.5）更适用于对碱性条件敏感的柱子（如Luna C18(2)和特别是Chromolith RP-18），以避免硅胶基质的降解和例如活性硅醇基团的暴露。为了适应在不同条件下形成的砹物种的未知极性，所有柱子都使用宽梯度（5–100% MeCN在水）进行洗脱。在这些中性条件下，观察到柱子之间的表观回收率存在显著差异（表1）。平均而言，三种样品类型的回收率从Phenomenex PolymerX柱的30%到Phenomenex Luna C18(2)的38%，Waters XBridge C18的55%，以及Merck Chromolith的79%不等。然而，这些值伴随着较大的标准差，而且高回收率的异常值（例如Chromolith柱上的亲核性配方的89%）无法通过离线检测（66%）复制，表明拖尾和积分伪影可能是导致这些差异的因素。为了探索流动相酸度和离子配对的效果，在水和有机溶剂中都添加了0.1%三氟乙酸（TFA）。这种在RP-HPLC中广泛使用的修改使流动相酸化，并引入了一种离子配对剂，可能影响砹的物种形成和保留机制。含有TFA的流动相使所有柱子的天然和亲电性砹的保留率显著增加（约增加了3倍），这与形成更强烈相互作用的阳离子物种一致。相比之下，亲核性砹的回收率变化很小，范围从Phenomenex PolymerX的30%到Merck Chromolith的68%。鉴于所有测试柱子在标准溶剂系统下的局限性，进一步优化了流动相，选择了Waters Xbridge C18柱，因为它具有更好的pH耐受性（pH 1?12）。最初，MeCN被甲醇替代，但这导致保留率几乎没有变化，因此没有进一步研究（表2）。表2. 使用不同流动相从Waters XBridge C18柱中回收砹的情况。流动相a 砹回收率 [%]b 亲电性At 亲核性At 天然At 平均值 MeCN/H2O 63 ± 4 (49 ± 7) 60 ± 12 (30 ± 12) 43 ± 10 (60 ± 12) 55 (46) MeOH/H2O 53 ± 4 (55 ± 3) 52 ± 5 (49 ± 7) 52 ± 7 (64 ± 7) 52 (56) MeCN/H2O + 0.1% AA 56 ± 23 (62 ± 21) 47 ± 6 (52 ± 4) 35 ± 2 (46 ± 2) 46 (53) MeCN/H2O + 10 mM TEAA (pH = 7) 75 ± 6 (71 ± 6) 91 ± 3 (92 ± 2) 82 ± 5 (86 ± 2) 83 (83) MeCN/H2O + 0.4% TEA (pH = 10.5) 98 ± 9 (79 ± 9) 88 ± 16 (95 ± 8) 98 ± 4 (103 ± 3) 95 (92) MeCN/H2O + 0.4% TEA + 0.1% Na2SO3 84 ± 17 (75 ± 12) 74 ± 5 (74 ± 8) 72 ± 6 (71 ± 7) 77 (73) MeCN/H2O + 0.4% TEA + 0.1% Na2S2O3 78 ± 9 (74 ± 3) 87 ± 7 (84 ± 8) 78 ± 4 (74 ± 10) 81 (77)a 相应的参数用红色突出显示。b 回收率通过柱后注射的在线检测和通过伽马计数对有柱和无柱收集的流出物进行量化（每个值n=3）。缩写：AA：抗坏血酸；TEAA：三乙胺醋酸盐；TEA：三乙胺。相反，基于观察到在酸性条件下亲电性配方的平均回收率较低（这应该会导致氧化的阳离子物种如At+或AtO+的存在），评估了旨在降低氧化还原电位并稳定阴离子物种如At?的替代添加剂。由于抗坏血酸在MeCN中的溶解度低，其添加并未改善回收率（图1D）。相比之下，使用pH中性的、含有三乙胺醋酸盐的离子溶剂作为有机溶剂缓冲液，使得回收率在75%到91%之间更加一致。进一步使用纯三乙胺（pH 10.5）提高pH值后，所有配方的回收率为88%-98%，洗脱表现为一个单一的、定义明确的峰，保留时间短（图1D）。这种效果可能归因于pH值的增加，它将砹的物种形式转变为相互作用较弱的形态，并抑制了与固定相上残留硅醇基团的二次相互作用，从而减少了非特异性吸附。此外，三乙胺阳离子和在较高pH下稳定的阴离子砹物种之间的离子配对效应可能有助于提高回收率和改善峰形。尽管与默认溶剂系统相比有显著改进，但这种高pH值的流动相也伴随着显著的权衡。大多数基于硅胶的柱子在高碱性条件下不稳定，具有酸性官能团的分析物可能会遭受保留减少。为了进一步提高稳健性，评估了结合三乙胺与还原剂亚硫酸钠或硫代硫酸钠的流动相。令人惊讶的是，虽然这些系统保持了游离态砹的单峰洗脱（尽管保留时间和峰形略有不同），但它们未能提高重复性，实际上降低了回收率。这表明砹的保留受多种潜在相互作用因素的影响，而不仅仅是氧化状态和pH。3.4. 对211At标记放射性药物分析的影响虽然本研究集中在定义的模型系统上，以便系统地评估色谱参数，但这些发现对211At标记放射性药物的分析具有直接意义，在这些系统中，准确确定放射化学纯度至关重要。在这些系统中，由于保留效应，游离态砹物种的存在可能会被低估，从而导致放射化学转化率和纯度的过高估计。本研究指出，使用含有三乙胺的基本流动相可以减少非特异性吸附，从而提高定量结果的可靠性，但必须考虑其与特定放射性药物的兼容性以及柱子的稳定性。此外，研究结果强调了在采用常规反相高效液相色谱（RP-HPLC）条件时，采用互补的定量策略或进行仔细的方法验证的重要性。总体而言，这些发现强调了在实际应用中调整分析方案以考虑砹特异性吸附现象的必要性。

尽管本研究提供了有价值的见解，但仍需承认一些局限性。实验使用的是定义明确的模型系统，以便系统地评估色谱参数，因此无法完全反映实际放射性药物配方的复杂性。此外，砹的形态并未直接测定，而是根据所应用的氧化还原条件推断出来的，这反映了其超痕量化学特性所带来的挑战。未来的工作应集中在验证这些色谱条件在复杂的211At标记放射性药物样品以及常规质量控制条件下的适用性。同时，对砹形态及其与色谱行为之间关系的更详细研究将有助于深入理解其作用机制，并为开发更稳健的分析方法提供支持。

**结论**
本研究表明，在常用的RP-HPLC条件下，自由态砹（在亲电和亲核放射性标记过程中产生）会在固定相上表现出显著的吸附现象。从柱子中洗脱出的自由态砹往往会产生宽且拖尾的峰，信噪比较低，导致积分结果不可靠，进而使得表观回收率具有较高的变异性。这些效应在使用含有TFA的流动相时尤为明显，并且出现在所有四种类型的柱子上。自由态砹在固定相上的吸附可能导致其在放射性药物样品中的含量被严重低估，从而高估放射化学转化率和纯度。这对于临床前或临床应用的制剂来说是一个风险。当必须使用常规HPLC系统进行定量时，我们的研究结果支持使用含有三乙胺的基本流动相，并结合具有高pH稳定性的柱子。在这种条件下，可达到88-98%的可重复回收率，这对于放射性标记优化等应用可能是足够的。然而，对于用于体内应用的放射性药物的实际质量控制，应采用补充测量方法来确认定量结果的准确性。鉴于砹的形态复杂且难以预测（从本研究所研究的有限配方中已经可以看出这一点），在分析含砹-211的样品时应常规考虑吸附效应。

**免责声明**
本项目由欧盟、IHI JU的私人成员及其合作伙伴共同资助。然而，所表达的观点和意见仅代表作者本人，并不一定反映上述各方的立场。上述任何一方均不对这些观点和意见负责。

**资助**
该项目得到了创新健康倡议联合体（IHI JU）的资助，授予协议编号为101173001 — Accelerate.EU。该联合体得到了欧盟“地平线欧洲”研究与创新计划（Horizon Europe）、COCIR、EFPIA、Europa Bío、MedTech Europe、Vaccines Europe、IBA、Tetrakit和LabLogic的支持。

**作者贡献声明**
Lucas Mues：撰写、审阅与编辑、验证、研究、数据分析。
Swen Humpert：撰写、审阅与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。
Herth Matthias Manfred：撰写、审阅与编辑、资金筹集。
Bernd Neumaier：撰写、审阅与编辑、项目监督、方法学、资金筹集、概念化。
Bom Pedersen Nadia Renée：撰写、审阅与编辑、研究。
Felix Neumaier：撰写、审阅与编辑、初稿撰写、可视化。