综述：类阿片类合成药物：检测、确认与解读的实用综述

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis Open》：Opioid-like designer drugs: A practical review of detection, confirmation and interpretation

　　米凯莱·普罗蒂（Michele Protti）| 奇亚拉·皮亚·雅托尼（Chiara Pia Iattoni）| 乌戈·M·桑托斯（Hugo M. Santos）| 卡洛斯·洛德伊罗（Carlos Lodeiro）| 约瑟·L·卡佩洛（José L. Capelo）| 罗伯塔·迪莱切（Roberta Di Lecce）| 罗伯托·曼德里奥利（Roberto Mandrioli）| 劳拉·梅尔科利尼（Laura Mercolini）

意大利博洛尼亚大学药学与生物技术系（FaBiT）药理毒理学分析研究小组（PTA Lab），地址：Via Belmeloro 6, 40126 Bologna

摘要
类阿片类设计药物是一类快速发展的新型精神活性物质（NPS），它们是强效的合成阿片类物质，不断挑战现有的毒理学和法医分析方法。除了芬太尼类似物外，实验室现在还面临着多种化学类型的挑战，包括硝杂萘类和U系列阿片类物质，这些物质通常以结构相似的变体、异构体和混合物的形式存在。由于它们的高效力和低剂量，这些物质在生物样本中的浓度往往非常低，这使得检测和确认变得复杂。常规免疫测定和静态靶向分析方法在交叉反应有限或新化合物未被预定义库收录时可能不够有效。确认分析还受到共同碎片化模式、参考标准可用性有限以及代谢信息不完整的影响。本文总结了旨在保持分析适应性的实用方法，同时不牺牲常规操作的可行性，包括分层筛查策略、稳健的HPLC-MS/MS确认标准以及使用高分辨率质谱（HRMS）进行可疑物质筛查和回顾性数据分析。重点在于实现所需的结构特异性和分析可靠性，以支持临床、法医和公共卫生环境中的可靠解释。

1. 引言
类阿片类设计药物已成为临床和法医毒理学的重大分析挑战。它们包括多种强效的合成μ-阿片受体（MOR）激动剂，这些物质以一系列结构相似的变体形式进入非法市场。与“经典”阿片类物质不同，后者的筛查和确认长期以来依赖于成熟的免疫测定方法、稳定的参考材料和完善的解释框架，而设计阿片类药物的分析目标却在不断变化：新的类似物可能迅速出现、消失然后再次出现[1]、[2]，往往在常规检测程序和参考库更新之前。这意味着，尽管无法确定特定样本中存在哪种类似物或变体[3]、[4]，但分析方法仍需具备法医上的可辩护性。

实验室面临的问题是多方面的。首先，由于活性剂量通常在微克级别，且毒性暴露可能通过掺假或故意摄入发生，因此浓度极低[5]。其次，化学空间非常拥挤：芬太尼类似物（图1a-f）、苯并咪唑衍生物（硝杂萘类，图2a-d）、U系列阿片类（图3a-c）和其他非典型结构可以共存，并且只需微小修改即可相互替代，从而破坏常规分析识别[1]、[6]。第三，母体化合物可能不稳定和/或代谢迅速，导致分析负担转移到代谢物和结合物上，而相关参考标准的可用性有限[7]。第四，多物质混合使用较为常见，因此合成阿片类的检测常常在复杂的分析背景下进行，这增加了基质效应和干扰风险。

2. 化学空间与非法市场动态
设计阿片类药物可以被视为一个结构多样的群体。尽管它们都作用于MOR，但结构上的差异直接决定了它们的分析行为。芬太尼类似物通过苯胺和哌啶部分的取代而变化；硝杂萘类是基于苯并咪唑的结构，具有多种N取代基和侧链修饰；U系列阿片类及相关非典型苯酰胺含有不同的芳香系统和酰胺化学结构。这些结构差异导致不同的碎片化模式、异构体和原聚体形成的倾向、水解或氧化的敏感性以及生物样本中的不同代谢“指纹”[5]、[7]、[8]、[9]。市场动态加剧了这些限制。一旦某种化合物被列入管制名单、广泛认可或成为执法目标，其结构相似的类似物只需轻微修改即可替代它。这种做法对非法制造商具有吸引力，因为小的化学变化可以逃避某些法律控制，同时增加免疫测定的复杂性并延迟参考标准的制定。对于实验室而言，应将类似物替代视为常规操作条件，并快速扩展目标列表、引入新的代谢物并更新解释说明，同时保持可辩护的识别标准[10]、[11]、[12]。

效力改变了分析问题的相对重要性。当化合物在微克剂量下具有活性时，检测往往接近常规方法的检测下限，吸附或降解造成的微量损失可能导致结果从可检测变为不可检测。高效力则增加了操作风险：假阴性可能延误临床治疗或掩盖新疫情的公共卫生信号，而假阳性可能带来重大法律后果。因此，针对设计阿片类药物的方法优化需强调极高灵敏度、携带效应控制和对不确定性的明确管理[11]、[13]、[14]。

物理化学性质也带来实际限制。许多设计阿片类药物呈碱性和亲脂性，这影响提取行为、在表面的吸附和色谱保留。在样品制备中，这可能有利于某些提取方法，但也可能增加管材和注射系统中的非特异性结合和记忆效应。在色谱分析中，pH值和缓冲液的选择会显著影响接近类似物之间的峰形和分离效果。因此，色谱选择性是确认工作流程中的核心设计变量，因为共洗脱、等压干扰和结构相似的类似物在此类化合物中很常见[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。

尽管从临床、法医或公共卫生的角度出发，优先事项可能会有所不同，但本文重点关注操作决策点，以帮助实验室构建普遍可接受的设计阿片类药物筛查、确认和解释工作流程，即使在类似物持续替代的情况下也能保持有效性。虽然本文概述的许多方法、陷阱和缓解措施也适用于其他滥用药物类别，但这里仅详细介绍了针对类阿片类药物的应用。更广泛的适用性和具体细节不能想当然，当然，文献引用也是针对特定分析物的。

3. 筛查：快速分类与化学现实
筛查通常在时间和通量的严格限制下进行。免疫测定因其快速、廉价和操作简便而仍被广泛使用。然而，免疫测定的性能受抗体设计和目标表位与化合物相似性的影响[25]。设计阿片类药物打破了这一假设：微小的结构变化会显著降低交叉反应性，而完全不同的结构（如硝杂萘类）可能被设计用于经典阿片类的测定方法忽略。因此，阴性筛查结果较为常见[26]、[27]、[28]、[29]。建议将免疫测定视为分类工具而非全面筛查手段。实际上，这意味着需要建立规则：当临床表现、现场信息或当地流行病学提示可能存在设计阿片类药物时，阴性免疫测定结果不能作为最终结论。此时，质谱确认成为质量保障，特别是在急诊医学、疫情调查和法律后果严重的情况下[30]、[31]。这种方法还有助于与临床医生和调查人员保持沟通：测试快速，但不是全面的[32]。

即时检测条和侧向流动格式可以在某些情况下提高初步检测效果[25]。它们的优势在于快速性和简便性，有助于立即减少危害或做出分类决策。然而，它们仍受其他免疫测定方法的相同限制：不同产品的性能不同，临界值不统一，基质条件会影响结果，对非芬太尼结构的识别也不一致[25]。对于实验室而言，这些工具最好作为多层次方法的一部分使用，而不是替代基于实验室的筛查。

筛查还具有报告维度。实验室应记录其筛查能检测和不能检测的物质。从操作角度来看，这可以通过“覆盖声明”来体现，明确当前筛查能可靠检测哪些化合物家族、哪些检测不一致，以及存在的已知空白。报告应明确指出，当交叉反应有限或新类似物占主导时，基于免疫测定的阴性结果不能排除强效合成阿片类药物的存在[33]、[34]。筛查决策需要基于风险。在设计阿片类药物普遍存在或患者出现阿片类中毒症状但常规筛查结果为阴性的情况下，通常会默认进行质谱确认[35]。相反，在低流行率的情况下，可以针对高度可疑的病例进行针对性检测以节省资源。关键是将这些决策纳入共同标准中，避免依赖个人判断。此外，先进质谱方法需要高度专业化的仪器、训练有素的人员和显著增加的成本，因此在资源和时间受限的情况下应用效果不佳。因此，应用时应根据实际需求进行调整，并考虑经济可行性。

4. HPLC-MS/MS确认
确认测试必须提供可可靠解释的结果。LC-MS/MS仍是主要方法，因为三重四极杆仪器在复杂基质中具有高灵敏度、选择性和定量性能。现代多分析物方法可以在一次运行中检测数十种合成阿片类及其代谢物，并在优化工作流程后达到低ng/mL甚至亚ng/mL的检测限[38]、[39]。实际挑战在于在结构相似且浓度较低的化合物类别中保持选择性和可靠性[9]、[19]、[23]、[40]。

选择性是一个反复出现的问题。许多设计阿片类药物会产生重叠的碎片，位置异构体可能共享主要产物离子。因此，确认标准不能过于简单。至少，实验室应使用多种跃迁和离子比率标准，并在可能的情况下使用校准物验证保留时间。如果色谱方法无法区分特定异构体，则需要适当说明结果，例如报告中应注明结果为暂时性鉴定或指定异构体未分离。无论哪种情况，都应明确说明该方法的主要局限性，特别是当法律分类或临床解释依赖于特定类似物时[41]、[42]。

携带效应控制是必要的。案例中的化合物浓度差异很大，单个高浓度样本可能导致后续样品污染。因此，血液检测方法更适合急性评估，但对灵敏度和净化要求更高。实验室应根据使用场景选择合适的检测基质，并确保确认流程能覆盖筛查效果有限的情况。

5. 结论
筛查应在时间和通量的严格限制下进行。免疫测定因其快速、廉价和操作简便而仍被广泛使用。然而，其性能受抗体设计和目标表位与化合物相似性的影响[25]。设计阿片类药物挑战了这一假设：微小结构变化会显著降低交叉反应性，而完全不同的结构（如硝杂萘类）可能被经典阿片类测定方法忽略。因此，阴性筛查结果较为常见[26]、[27]、[28]、[29]。建议将免疫测定视为分类工具而非全面筛查手段。实际操作中，应建立规则：当临床表现、现场信息或当地流行病学提示可能存在设计阿片类药物时，阴性免疫测定结果不能作为最终结论。此时，质谱确认成为质量保障，特别是在急诊医学、疫情调查和法律后果严重的情况下[30]、[31]。这种方法还有助于与临床医生和调查人员保持一致沟通：测试快速，但不是全面的[32]。

即时检测条和侧向流动格式可以在某些情况下提高初步检测效果[25]。它们的优势在于快速性和简便性，有助于立即减少危害或做出分类决策。然而，它们仍受相同限制：不同产品的性能不同，临界值不统一，基质条件会影响结果，对非芬太尼结构的识别也不一致[25]。对于实验室而言，这些工具最好作为多层次方法的一部分使用，而不是替代基于实验室的筛查。

筛查还具有报告功能。实验室应记录其筛查能检测和不能检测的物质。从操作角度来看，这可以通过“覆盖声明”来体现，明确当前筛查能可靠检测哪些化合物家族、哪些检测不一致，以及存在的已知空白。报告应明确指出，当交叉反应有限或新类似物占主导时，基于免疫测定的阴性结果不能排除强效合成阿片类药物的存在[33]、[34]。筛查决策需基于风险。在设计阿片类药物普遍存在或患者出现阿片类中毒症状但常规筛查结果为阴性的情况下，通常会默认进行质谱确认[35]。相反，在低流行率情况下，可以针对高度可疑的病例进行针对性检测以节省资源。关键是将这些决策纳入共同标准中，避免依赖个人判断。此外，先进质谱方法需要高度专业化的仪器、训练有素的人员和较高的成本，因此在资源和时间受限的情况下应用效果不佳。因此，应用时应根据实际需求进行校准，并考虑经济可行性。

当筛查工具用于危害减少或快速分类时[36]、[37]，实验室应确保利益相关者理解其解释范围。阳性检测条表明可能存在暴露，但不一定表示损伤；阴性条不能排除非目标类似物的暴露。可能的情况下，应将筛查结果与确认途径和当地监测联系起来，以便及早识别新出现的类似物模式并更新方法[7]、[8]、[23]。

筛查的另一个操作考虑因素是基质选择。尿液是常用的检测基质，因为其浓度较高且采集侵入性较低。然而，对于作用迅速的设计阿片类药物，如果采样延迟或未包含代谢物标志物，仅使用尿液的方法可能在急性临床问题中效果不佳。基于血液的方法更适合急性评估，但对灵敏度和净化要求更高。因此，实验室应根据使用场景选择合适的检测基质，并确保确认流程能覆盖筛查效果有限的情况。后续评估应包括最坏情况（从高浓度到低浓度的序列），并需要定义验收标准。操作上的缓解措施可以包括使用强效洗脱剂、专用针头和端口清洗、在高浓度样本后进行空白注射，以及在可行的情况下通过批次设计将高风险样本分开。这些实际控制措施应在确认性工作流程中明确，因为它们对于避免假阳性结果以及在存在干扰时保持可靠鉴定至关重要[43]、[44]、[45]、[46]。包含代谢物的检测组（图4）可以提高检测和解释的准确性。仅包含母体化合物的检测组可能会系统性地遗漏暴露情况，如果母体化合物不稳定或代谢迅速[47]、[48]、[49]、[50]。在适当的情况下，加入诊断性代谢物可以扩展检测窗口并支持解释[51]、[52]、[53]、[54]、[55]、[56]。然而，这会增加分析复杂性：代谢物可能缺乏商业上可用的标准，因此必须仔细定义鉴定标准[14]、[57]、[58]、[59]。此外，同一化学类别的不同母体药物可能共享一个或多个代谢物。如果发生这种情况，且母体药物未被检测到（可能是由于代谢迅速或不稳定），仅凭共同代谢物的存在无法确定确切的暴露物质。

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图4. 通过人肝微粒体孵育和HPLC-HRMS分析评估的U-47700的代谢途径。改编自[101]。

量化策略必须明确。一些程序只需要定性确认，而其他程序则需要定量结果用于解释、监测或趋势分析。对于合成阿片类药物，非常低水平的定量分析对校准设计、权重和最低限性能有更高的要求。当定性确认足够时，方法可以优先考虑选择性和灵敏度而不是宽范围的定量[60]。由于合成阿片类药物的结果可能用于临床决策和法医鉴定，实验室应记录分析上可靠的鉴定标准，包括保留时间预期、诊断性离子比或碎片离子，以及在异构体或干扰存在时明确的确认规则。随着药物的发展，需要记录碎片/转化和色谱条件的更新，以确保结果的可解释性和可比性[13]、[16]。

色谱选择性应针对实际的共暴露模式进行测试。合成阿片类药物的案例通常包括同时使用的苯二氮卓类药物、兴奋剂或其他镇静剂，这些化合物可能会影响基质效应和色谱行为。因此，在开发和验证过程中，实验室应评估代表性混合物，而不仅仅是单一分析物的 spiked 样品。这种方法有助于揭示在简化实验中可能不明显的分洗和离子抑制现象，并降低常规案例与验证样本表现不同的风险[61]、[62]、[63]、[64]。

色谱通常是确认性防御能力的隐性决定因素。对于合成阿片类药物，分析问题不仅仅是是否能够检测到某个离子；更重要的是该方法是否能够将目标化合物与结构相似的干扰物和异构体区分开来[38]、[65]、[66]。实际措施包括测试不同的固定相、调整流动相pH值以改善碱性化合物的峰形，以及设置足够窄的保留时间窗口以检测漂移，同时又不会过于狭窄以至于轻微的基质驱动的位移导致错误排除。如果在校准时间限制内无法实现分离，实验室应明确承认这一限制，并计划正交的确认路径[58]、[67]、[68]、[69]、[70]、[71]。

一个相关的实际决策是选择广泛的多类检测组还是具有共享色谱系统的模块化检测组。广泛检测组可以提高操作效率，但在存在多种化合物时可能会增加共洗风险并使离子比行为复杂化。如果在同一周期内监测多个MRM转化，停留时间不可避免地会减少，从而相应降低灵敏度和信噪比。这可能会导致高效力合成阿片类药物的假阴性结果增加，因为这些药物在生物流体中的浓度通常非常低。

模块化设计中，合成阿片类药物在方法的专门部分或使用专用色谱系统进行分析，可以提高选择性，但会增加分析复杂性。最佳选择取决于工作量和当地合成阿片类药物的流行情况，但设计理由应予以记录，因为这会影响该方法未来的扩展[13]、[15]、[16]、[17]。标记物选择最好被视为一个证据问题。对于几种合成阿片类药物家族，代谢物知识不完整或变化迅速，不同的研究可能会强调不同的候选标记物。实验室可以通过分层标记物方法来管理这种不确定性：将得到充分支持的初级代谢物作为核心目标，将次级代谢物作为探索性目标（特别是在HRMS中），并记录随着案例积累如何升级标记物证据。这种方法可以在不过度依赖单一标记物集的情况下提高检测能力，因为该标记物集日后可能被证明不是最优选择[14]、[54]、[57]、[59]、[72]、[73]、[74]、[75]、[76]、[77]、[78]、[79]、[80]、[81]。

当使用代谢物标记物进行解释时，实验室还应记录他们所不知道的信息。例如，母体化合物与代谢物的缺失可能反映了快速代谢、不稳定性、采样延迟或分析损失。同样，仅在非常低水平下检测到母体化合物可能反映了近期暴露、污染或残留。解释性评论最好以一致性而非确定性为基础，除非对特定类似物的证据基础非常充分[78]、[79]、[80]、[81]。

5. HRMS：广度、发现能力和回顾性
高分辨率质谱解决了靶向确认的一个核心限制：靶向检测方法无法检测其未针对的化合物。HRMS提供准确质量的全面扫描数据，可以针对可疑列表进行筛选，并使用非靶向方法进行查询。这种广度对于合成阿片类药物尤为重要，因为新类似物的出现速度可能快于靶向检测组的更新速度，而且参考标准可能无法及时获得[8]、[12]、[67]、[82]、[83]。为了跟上合成阿片类药物的发展，需要定期更新可疑/目标列表、诊断库和HRMS数据集，以便在新化合物出现时能够进行回顾性查询[84]、[85]。还需要定期重新评估免疫测定的交叉反应性和确认标准，因为小的结构变化可能会影响性能[25]、[86]、[87]。

数据依赖的采集方式可以提高丰度较高的离子的碎片质量，但在复杂基质中可能会遗漏低水平分析物。数据独立的采集方式可以提高完整性，但由于光谱混合会增加解释负担。一种实用的方法是根据实验室目的选择采集模式：法医案例中的广泛筛查可能受益于更全面的采集，而专注的临床工作流程可能更重视速度和稳健性。重要的是，选择方式需要记录下来，因为它会影响低水平合成阿片类药物的灵敏度，从而影响假阴性的风险[79]。

数据处理和审查程序是HRMS程序中变异性的常见来源。自动化流程可以加速筛查，但如果阈值没有根据基质和仪器条件进行调整，可能会传播假阳性结果。一种实用的方法是将自动化检测与结构化的人工审查相结合：审查者确认质量准确性、同位素模式行为、碎片证据、色谱峰形以及加合物形式的合理性。审查还应明确考虑源内伪影和共洗现象。标准化的审查检查表可以提高不同分析师之间的一致性，并随着可疑列表的更新减少漂移[45]、[52]、[88]、[89]、[90]。无论如何，HRMS提供的前所未有的机会和性能可能会受到处理大量数据的困难的影响，不透明的处理和鉴定程序（尤其是使用AI工具时）使得错误监控变得更加困难和耗时。因此，使用这些非常强大的技术时应准确权衡其潜在的缺点。

由于HRMS能够进行广泛筛查，它还可以揭示关于局部流行情况的错误假设。回顾性挖掘经常显示，某种化合物在被认定为公共卫生问题之前曾间歇性出现，或者被认为不存在的化合物实际上以低频率存在[91]。这些见解具有实际意义：它们有助于确定哪些分析物值得进行靶向检测，哪些代谢物需要优先处理，以及如何调整筛查标准。因此，建议将回顾性结果视为方法策略的输入，而不仅仅是学术发现[47]、[48]、[92]、[93]、[94]、[95]。

HRMS检测后的实际问题是接下来应该采取什么行动。实验室应定义升级的阈值：例如，在某些监测情境中，高置信度的HRMS鉴定（精确质量、同位素模式、多个诊断性碎片和保留时间与标准匹配）可能是可报告的，而中等置信度的检测结果则可能需要在报告前进行靶向LC-MS/MS确认或正交验证。这些阈值通常反映了结果的后果和数据的预期用途，应予以记录以确保分析师之间的一致性[43]、[45]、[58]、[66]、[68]、[70]、[89]、[93]、[96]。

回顾性挖掘需要作为一个受控过程来实施。当新类似物被添加到可疑列表中时，实验室可以定义一个回顾性窗口（例如，之前的6-12个月），并使用一致的设置重新处理存储的数据[23]、[92]、[97]。然后可以对检测结果进行分类确认，结果可以决定是否将该化合物纳入靶向检测组。这在HRMS监测和LC-MS/MS确认之间创建了一个“反馈循环”，使靶向方法与现实世界的暴露模式保持一致[81]、[84]、[86]、[97]、[98]。

6. 常导致假阴性和假阳性的分析前和分析中的陷阱
对于合成阿片类药物，分析前变量可以决定检测的成功与否。最重要的不确定性来源包括不稳定性、转化为降解产物以及在运输或储存过程中的损失，这些因素可能会降低母体化合物的浓度，有时只留下代谢物作为暴露的证据。这意味着样品处理实际上是分析方法的一部分。建议实验室在实际条件下验证稳定性：台式暴露、自动采样器储存、冻融循环以及在实际使用的温度和持续时间下的储存。如果不稳定性显著，实验室应制定操作规则，例如处理前的最大允许延迟和冷藏运输的要求[48]、[50]、[57]。

如上所述（见第4节HPLC-MS/MS确认），残留效应值得特别强调，因为它是一个经常被忽视的问题。某些合成阿片类药物样本中的浓度可能极高，而其他样本中的浓度可能很低：一个管理不当的高浓度样本可能会污染整个序列并产生假阳性结果。主要陷阱及其相应的缓解措施在前一节和多个文献中进行了讨论[12]、[17]、[36]、[79]、[99]、[100]。基质效应是生物样本中一个众所周知且持续存在的问题。它们很少使分析无效，但在验证过程中应准确评估。在血液和尸检样本中，磷脂、溶血和腐败可能会产生显著的离子抑制和不可预测的干扰[68]、[86]。在尿液中，离子强度和共排泄物质的变异性可能会改变响应因子并影响提取效果。因此，稳健的内部标准化至关重要[10]、[29]、[85]。如果有同位素标记的标准，必须使用它们；如果没有，必须采用替代方法，并结合保守的验收标准和加强的质量控制，特别是在低浓度情况下[90]、[91]。

污染似乎比其他分析前和分析中的陷阱少见。然而，处理扣押材料、高浓度标准或高度阳性案例的实验室应考虑物理分离工作区域、单向工作流程和专用消耗品。对于痕量水平的合成阿片类药物，即使是微量的环境污染也可能产生可分析的信号并导致难以事后反驳的假阳性结果。程序空白样品、谨慎的标准处理和明确的规则可以降低这种风险。当观察到异常结果时，重新提取和在独立分析序列中的确认可以增强防御能力[66]、[68]、[69]。

此外，建议实验室预期稳定性和吸附性可能不会在整个检测组中均匀分布。某些类似物在常规处理下可能是稳定的，而其他类似物可能会降解或吸附。因此，基于检测组的稳定性评估如果只关注少数代表物可能会产生误导。一种实用的方法是评估每个化学系列中代表性化合物的稳定性，并将新添加的化合物视为需要在常规报告前至少进行基本稳定性表征的对象。当稳定性证据不足时，实验室仍然可以报告检测结果，但应对其解释进行限定并避免基于浓度的推断。

上述所有陷阱都需要额外的预防措施和实验室资源，从而增加成本和时间消耗。仔细的方法验证可以限制资源支出，每个对策都应根据实际需求和预算限制进行权衡。在资源有限的情况下，应通过设计来确保质量，首先准确评估并消除那些对识别影响最大的问题，如残留物和污染。本节的可视化总结见图5。下载：下载高分辨率图像（463KB）下载：下载全尺寸图像图5. 第6.7节的可视化总结。异构现象、同位素巴和正交证据的重要性异构现象是合成阿片类药物分析中的一个核心障碍。位置异构体可能具有相同的质量，并产生几乎相同的碎片，在标准反相梯度下可能共同洗脱。在靶向LC-MS/MS中，这可能导致多重反应监测（MRM）结果不明确。在高分辨率质谱（HRMS）中，精确质量和通用碎片可能无法区分候选物。这种不确定性不仅仅是形式上的：异构体之间的法律地位、流行程度和效力可能不同，错误分配可能会影响法医辩护和临床解释[13]、[101]、[102]、[103]。色谱优化是第一道防线。使用不同的固定相、改进的梯度或二维分离可以解决某些异构体问题。然而，在常规处理量限制下，色谱分离并不总是可行的。因此，实验室应认识到色谱分离不足的情况，并避免过于自信地报告结果。在这种情况下，报告到类别级别或作为有限的一组候选物可能比在没有充分证据的情况下断言特定异构体更为合理。离子迁移率提供了额外的分离维度，可以改善区分度，特别是对于容易形成原体的硝唑类化合物。当具备离子迁移率（IM）仪器时，实验室可以将碰撞截面（CCS）值和迁移率分离模式纳入置信度标准，前提是这些值经过验证并随时间保持稳定[86]、[104]。最近发布了一个关于NSO结构鉴定的大型CCS数据库[105]。鉴于芬太尼在某些国家的广泛传播，使用IM来提高其识别度并避免由异构体、同位素巴和原型体引起的错误最近受到了很多科学关注。例如，使用高分辨率IM和轨道阱质谱研究了芬太尼的原体行为，提供了关于错误识别案例的重要信息[106]，类似的方法也应用于硝唑类化合物[43]。Zarkoun等人发表了关于使用IM进行芬太尼鉴定的概述[107]，而Miller等人描述了一种使用纳米ESI-IM-MS/MS或实时直接分析（DART）-IM-MS/MS的高通量工作流程来区分234种芬太尼[108]。正交技术如GC-MS(/MS)有时可以解决LC-MS(/MS)难以分离的异构体，光谱方法可以支持被扣押材料的确认[109]、[110]、[111]。实际上，GC柱化学提供的不同分离机制和不同的亲和力等级（可能在衍生化后）可以为任何LC条件下无法分离的化合物提供差异化的保留时间。对于生物样本，正交确认需要更多的资源，但在高后果案例或标准和支持有限的新兴化合物中可能是至关重要的。因此，实验室应定义正交确认的优先规则，并确保这些方法在操作上是可行的，即使是有选择地应用。可以实施一个实用的优先框架作为实验室变更控制和报告政策的一部分。例如，当首次在当地观察到某种化合物时，当HRMS识别出可疑化合物但缺乏标准确认时，或者当结果可能支持法律行动或公共卫生警报时，可以触发正交确认。该框架将正交确认正式化为一个有记录的质量过程，提高一致性和可辩护性。图6提供了可视化总结。下载：下载高分辨率图像（289KB）下载：下载全尺寸图像图6. 第7.8节的可视化总结。微采样和替代基质微采样和替代基质越来越受到重视，因为它们可以简化收集、存储和运输，并支持分散式采样模型[112]、[113]、[114]，并且提供了多种方法和采样设备，可以适应不同的需求和情况。干燥基质还可以通过限制酶活性和水解来提供稳定性优势。对于合成阿片类药物，这些物流优势尤其具有吸引力，特别是在及时运输和冷链维护困难的情况下。然而，采用必须基于证据，因为干燥格式本身也会引入分析不确定性[32]、[78]、[115]、[116]、[117]。在法医背景下使用微采样时，文档记录和可追溯性尤为重要。设备选择、样本标记、存储条件和提取程序必须标准化，以减少变异性并支持可辩护性[118]、[119]。在这些限制下，可以获得有关阿片类药物药代动力学的显著数据（见图7中的曲马多示例）。尽管微采样方法很有用，但采样体积和结果的血细胞比依赖性仍然可能很大，除非采用体积法（即固定体积采样）（见图8）。实验室还应考虑如何将替代基质的结果与常规基质的结果进行比较，特别是如果利益相关者期望数值可比性。当现有的平均转换因子不可用时，应进行进一步的生物学研究来近似这些因子，这超出了常规实验室职责的范围，而且非常耗时和资源密集。如果无法建立可比性，报告需要明确说明这一点并相应地限制解释[120]、[121]。图7. 通过干血斑采样和HPLC-HRMS分析评估的曲马多及其两种主要代谢物的药代动力学示例。改编自[119]。图8. 当采用体积微采样方法（微流控生成的干血斑）时，不同血细胞比值下分析物浓度结果的低变异性。改编自[119]。除了微采样格式外，几种替代生物基质在新型合成阿片类药物的分析中也引起了兴趣[122]。例如，口腔液已被越来越多地用于检测NPS，包括芬太尼类似物和其他合成阿片类药物，使用色谱-质谱技术[21]、[41]、[90]、[96]、[123]、[124]。已经开发并验证了基于LC-MS/MS和GC-MS的方法，用于检测口腔液中的多种新型合成阿片类药物（NSO）[79]、[125]、[126]、[127]，表明基质具有反映近期暴露的潜力，尽管分析物的低浓度和基质变异性仍然是高效力阿片类药物的分析挑战。角质基质如头皮毛和体毛提供了延长的检测窗口，能够回顾性地评估重复或慢性暴露于合成阿片类药物的情况[19]、[75]、[91]、[128]。最近的应用验证过的UPLC-MS/MS工作流程对真实毛发样本的研究记录了暴露于这些物质的人群中存在芬太尼、相关类似物和非芬太尼类阿片类药物（如硝唑类）的情况，强调了毛发检测在血液或尿液无法覆盖的时间范围内的长期监测效用[69]、[122]、[129]、[130]。汗液也被提出作为替代样本，特别是在传统样本不可用或难以获得的情境中，因为它可以长时间积累母体和代谢物[131]；然而，关于高效力合成阿片类药物的数据仍然有限，基质中的低分析物浓度和个体间变异性需要在常规应用前进一步评估。每种替代基质都带来了与结合机制、低外源物质水平和潜在外部污染相关的独特分析挑战。需要严格的方法验证、特定基质的提取策略和对浓度数据的谨慎解释，以便将这些基质有效地整合到新型合成阿片类药物的全面分析工作中。图9总结了本节讨论的关键步骤。图9. 第8.9节的可视化总结。结论：解释和报告分析确认只是实验室任务的一部分；最后一步是将结果转化为有意义的解释。对于合成阿片类药物，由于其极高的效力、同类化合物之间的药代动力学差异以及频繁的多物质暴露，解释变得复杂。仅凭浓度很难预测临床结果，相同的浓度可能因耐受性、时间和共暴露情况而具有不同的含义。死后重新分布和降解可能会进一步扭曲测量值。因此，建议实验室将浓度置于具体情境中，并避免过于自信的因果陈述。与临床医生、调查人员和公共卫生利益相关者的沟通本身是一项技术任务。报告需要传达分析事实及其局限性：检测到了哪种化合物（或类别）、适用哪种置信度等级、是否通过标准确认了身份以及相关的解释限制（例如，潜在的异构体不确定性或仅检测到代谢物）。在疫情爆发情况下，可以优先考虑快速沟通途径，但早期报告仍应保守编写，并随着确认证据的积累进行更新。合成阿片类药物可以在非常低的浓度下被检测到，当信号接近分析限值或代谢物主导谱型时，解释变得具有挑战性。在工作场所和监管环境中，定义的截止值和报告规则（包括最近的芬太尼更新）决定了低水平发现是否可采取行动，而临床和法医环境继续优先考虑可靠的确认和避免假阳性。合成阿片类药物凸显了分析能力和解释阈值之间的持续紧张关系。由于效力高，临床相关的暴露可能发生在接近或低于其他阿片类药物的传统决策阈值的浓度下。同时，低浓度下分析伪影（残留物、污染、吸附损失）的影响不成比例。因此，建议实验室定义适合目的的决策阈值，并避免未经证实就转移其他药物类别的截止值。当定量解释不可靠时，带有明确确认标准的定性报告可能是最合适的方法。在临床环境中，决策阈值必须与可操作性相关联。如果结果主要用于指导治疗，则可能优先考虑灵敏度和快速周转时间，报告可能包括强调即使在低测量浓度下效力也可能很高的解释性注释。在法医环境中，阈值必须符合法律和证据标准，实验室在报告非常低水平的发现之前可能需要额外的确认步骤。当使用延迟运输或干燥微采样格式时，应评估在实际分析条件下的稳定性，因为降解会降低检测能力和解释的准确性。图10提供了可视化总结。资金来源本综述文章没有收到公共、商业或非营利部门的任何特定资助。作者贡献声明Chiara Pia Iattoni：撰写——审阅和编辑，撰写——原始草稿。Hugo M. Santos：撰写——审阅和编辑，撰写——原始草稿，数据管理。Carlos Lodeiro：撰写——审阅和编辑，撰写——原始草稿，数据管理。José L. Capelo：撰写——审阅和编辑，撰写——原始草稿，数据管理。Roberta Di Lecce：撰写——审阅和编辑，撰写——原始草稿，数据管理。Roberto Mandrioli：撰写——审阅和编辑，撰写——原始草稿，概念化。Laura Mercolini：撰写——审阅和编辑，撰写——原始草稿，监督，方法学，正式分析，概念化。Michele Protti：撰写——审阅和编辑，撰写——原始草稿，可视化，正式分析，概念化。利益冲突声明R.M.作为《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis Open》的顾问编辑委员会成员，未参与本文的同行评审，也未获取有关其同行评审的信息。本文的编辑过程的全部责任委托给了另一位期刊编辑。所有其他作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能影响本文报告的工作。