转录本长度、温度和冻干对mRNA-脂质纳米粒子稳定性的影响

《Journal of Pharmaceutical Sciences》：Effect of transcript length, temperature, and lyophilization on mRNA-lipid nanoparticle stability

　　

马纳萨·奇拉拉（Manasa Chillara）|赵薇薇（Weibo Zhao）|乔纳森·S·多迪克（Jonathan S. Dordick）|托德·普日比琴（Todd Przybycien）

伦斯勒理工学院化学与生物工程系，纽约特洛伊，邮编12180

摘要

冻干可以提高mRNA-脂质纳米颗粒（LNPs）的长期稳定性，然而冻干的物理化学和功能影响仍待进一步探索。在本研究中，我们调查了关键变量（如mRNA长度、配方条件和冻干状态）对mRNA-LNPs稳定性的影响。我们合成了编码单聚体（egfp）₁、二聚体（egfp）₂和四聚体（egfp）₄序列的mRNA构建体，以系统地改变mRNA长度。我们确定了一种合适的LNPs组成和冻干条件，用于生成用于长期稳定性研究的冻干mRNA-LNPs。冻干后，mRNA-LNPs的物理化学性质发生了初步变化，但在储存过程中无论是冻干样品还是水性样品都保持了稳定性。然而，这些性质并不能可靠地预测其功能稳定性。在室温下储存的水性（egfp）₁-LNPs在28天内显示出增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达量迅速下降了50倍。相比之下，冻干mRNA-LNPs在28天内仅下降了6倍，随后在84天内逐渐下降到9倍。冻干似乎会导致两种或更多种LNPs亚群的存在，从而产生功能异质性。此外，我们使用一级速率模型计算了灭活速率常数，作为未来mRNA-LNP稳定性建模的基础。

引言

COVID-19大流行凸显了迫切需要有效、能够快速开发并广泛应用的疫苗。信使RNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）疫苗因其疗效和加速的开发时间表而特别成功。^1,2除了COVID-19和其他传染病，mRNA-LNPs目前还被探索作为癌症免疫治疗、^3,4蛋白质替代疗法、^5,6以及基因组编辑^7,8的有希望的新生物制剂。然而，mRNA-LNPs的稳定性仍然是一个重大挑战，通常需要超低温条件进行储存和分发。⁹

^{10, 11, 12,13,14}和酶促降解^{15, 16, 17的影响。此外，LNPs载体通常由四种脂质成分组成：一种阳离子或可电离脂质、一种中性辅助脂质、胆固醇和PEG脂质，在某些条件下可能会聚集、降解或与mRNA发生反应，从而可能影响整体功能效果。15, 16, 17影响mRNA-LNP储存稳定性的关键因素包括温度和水分含量。这使得冻干成为通过去除配方中的水分来保持mRNA-LNP结构和功能的一种有前景的方法。18,19}

村松等人²⁰和艾等人²¹证明了冻干可以显著提高在室温下储存的mRNA-LNP配方的长期稳定性。此外，有证据表明，在4°C下储存的冻干制剂可以保持与在-80°C下冷冻的水性制剂相当的稳定性和生物活性，这凸显了它们减少对超冷链依赖的潜力。^20,22除了这些基础研究之外，研究人员还探索了优化冻干过程本身的方法，例如，研究连续冻干以改进传统的批次方法²³。尽管如此，对冻干如何影响mRNA-LNP的物理化学和功能特性的全面理解仍然不完整。这一挑战源于mRNA-LNPs的脆弱性，因为在冻干过程中即使是微小的改变也会显著影响颗粒大小和封装效率，而这两者对维持其功能至关重要²²。此外，实验条件的变化，包括mRNA有效载荷和LNPs组成的差异，使得建立标准化框架以理解冻干如何影响mRNA-LNP稳定性变得困难。

在这项研究中，我们调查了mRNA长度、配方参数、冻干条件和温度对mRNA-LNPs长期稳定性和功能的影响。使用一系列编码单聚体增强型绿色荧光蛋白（egfp）₁或串联egfp序列的mRNA构建体，包括二聚体（egfp）₂和四聚体（egfp）₄形式²⁴，我们系统地将mRNA长度从1179个核苷酸变化到3375个核苷酸，其中最大的构建体大约与mRNA-1273和BNT162b COVID-19疫苗mRNA的有效载荷大小相当²⁵。然后我们进行了为期84天的全面稳定性研究，比较了在不同储存温度下冻干和非冻干的水性mRNA-LNP配方，评估了物理化学参数（如颗粒大小分布、ζ电势和封装效率）和功能（基于细胞的蛋白质表达）。与水性制剂相比，冻干mRNA-LNPs在室温下可保持高水平的蛋白质表达长达84天。然而，mRNA有效载荷长度的增加导致即使在冻干后，在较高温度下功能也会下降。冻干过程还产生了具有不同功能的纳米颗粒亚群，从而导致蛋白质表达谱较广以及随时间变化的降解速率。此外，基于细胞的蛋白质表达数据被用来确定表观灭活速率常数' role="presentation">$k_{d\left(app\right)})))$$k_{d\left(ap\right)}))$使用一级速率模型对每种mRNA-LNP配方进行了定量分析，得出了它们的稳定性概况。

章节片段

材料

用于编码（egfp）₁、（egfp）₂和（egfp）₄mRNAs的线性化质粒从GenScript（新泽西州皮斯卡特维）获得。T7 RiboMAX Express大规模RNA生产试剂盒从Promega（威斯康星州麦迪逊）购买。CleanCap AG从TriLink BioTechnologies（加利福尼亚州圣地亚哥）购买。Monarch RNA纯化试剂盒从New England Biolabs（马萨诸塞州伊普斯威奇）购买。Qubit RNA XR检测试剂盒和Quant-iT RiboGreen检测试剂盒从ThermoFisher Scientific（马萨诸塞州沃尔瑟姆）获得。

单聚体和串联egfpmRNAs的生成

合成了一系列编码单聚体（egfp）₁和串联egfp序列的mRNA构建体，包括二聚体（egfp）₂和四聚体（egfp）₄形式，同时保持所有构建体的UTR和poly(A)长度不变（图1A）。这提供了从1179到3375个核苷酸的mRNA长度范围。通过凝胶电泳验证了合成mRNAs的长度（图1B）。通过将mRNAs转染到HEK-293T细胞中测试了这些构建体的功能

讨论

我们系统地研究了影响mRNA稳定性的关键因素，重点关注三个关键变量：LNPs配方、mRNA有效载荷长度和冻干。mRNA-LNPs是在水性溶液中使用（egfp）_1,2,4mRNA串联体和适合的脂质组成制备的，这些在体外功能检测中表现良好。受控的T-junction混合方法广泛用于可扩展的LNPs生产⁴⁶，确保了批次间的纳米颗粒形成可重复性。

结论

总之，我们的研究提供了关于mRNA长度、冻干和储存条件如何影响mRNA-LNPs稳定性的宝贵见解。这些发现强调了仅依靠批量物理化学评估来控制mRNA治疗质量的不足。相反，我们的结果支持一种更全面的评估方法，结合物理化学表征和功能测量，以更好地理解配方性能。功能测量提供了

数据可用性

本研究中的数据可应要求从相应作者处获得。

资助

本项目得到了国家生物制药制造创新研究所（NIIMBL）的项目奖励协议和国家标准与技术研究所（NIOST）的财务援助奖70NANB21H085的支持。

利益冲突声明：作者声明没有已知的可能影响本文报告工作的竞争性利益或个人关系。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢以下人员：Marlene Belfort和Kaalak Reddy（奥尔巴尼大学RNA研究所）在建立我们的RNA实验室方面提供的建议；Erin Dong和Erik Sontheimer（马萨诸塞大学陈医学院）提供的编码egfp的质粒，这对我们的初步研究至关重要；Mariah Arral、Kathryn Whitehead、Kyle Tynan和James Schneider（卡内基梅隆大学）在mRNA-LNP生成和表征方面的指导；