《Journal of Pharmaceutical Sciences》：A multi-dimensional modeling framework integrating metabolomics analysis and process modeling for bioprocess characterization
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应亭石|静瑜桥|玉香湾|克瑞坊|玉霞金|建阳盘|东高|海滨王|海滨区中国浙江省杭州市浙江大学药学院药物信息学研究所，邮编310058摘要上游生物工艺的开发在很大程度上依赖于实验设计（DoE）和响应面方法论，这些方法通常关注终点结果，而忽略了细胞培养过程的动态变化。为了克服这一限制
应亭石|静瑜桥|玉香湾|克瑞坊|玉霞金|建阳盘|东高|海滨王|海滨区
中国浙江省杭州市浙江大学药学院药物信息学研究所，邮编310058
摘要
上游生物工艺的开发在很大程度上依赖于实验设计（DoE）和响应面方法论，这些方法通常关注终点结果，而忽略了细胞培养过程的动态变化。为了克服这一限制，本研究建立了一个多维建模框架，整合了确定性筛选设计（DSD）、时间分辨代谢组学和过程建模，以阐明关键工艺参数（CPPs）如何在细胞培养过程中调节抗体滴度和质量属性。
首先，基于DSD的响应面模型确定了抗体滴度和质量的关键调控因素。随后，代谢组学分析揭示了其背后的代谢机制：较高的温度和接种密度促进了氨基酸和能量的代谢，而pH值则调节了中心碳的流动。基于这些发现，开发了高斯过程回归（GPR）动态模型，该模型结合了时间序列代谢物谱和CPPs，能够高精度地预测活细胞密度和抗体滴度（测试集R2 > 0.90）。该模型的性能显著优于传统的线性（PLS）和复杂的机器学习方法（提升树、神经网络）。
这项工作为生物工艺的机制理解和实时预测提供了一种连贯的方法论流程，为生物工艺的优化和放大提供了有价值的工具。
引言
单克隆抗体（mAb）是一类重要的生物药物，用于治疗多种疾病，如癌症、哮喘、传染病、心血管疾病和自身免疫性疾病。1确保mAb产量和关键质量属性（CQAs）的一致性仍然是生物制药生产中的核心挑战。2,3遵循“质量源于设计”（QbD）框架需要建立一个稳健且被充分理解的过程，系统地阐明关键工艺参数（CPPs）——如pH值、温度、溶解氧（DO）和营养供给——对细胞生长、产品滴度和CQAs的影响。4,5
目前，生物制药生产中的上游过程表征主要依赖于实验设计（DoE）和响应面建模（RSM）。6虽然这些方法有效识别了重要的CPPs并评估了它们对终点响应的影响，但它们本质上提供了过程的静态描述。它们无法捕捉细胞培养系统的动态演变，也无法深入理解CPPs如何随时间影响细胞行为。这一限制限制了对生物工艺的机制理解和预测控制。
为了解决这一需求，时间分辨组学数据（如代谢组学）已成为一种有前景的方法。6,7代谢组学能够全面分析细胞内和细胞外的代谢物，反映细胞的实时生理状态。8,9结合多变量分析和途径解析，它可以提供CPPs如何调节代谢通量并最终影响抗体产生的机制见解。7,10另一方面，为了实现预测控制，结合时间数据的动态过程模型可以克服静态RSM的局限性。这些数据驱动的模型能够实时预测培养过程中的关键变量，如活细胞密度（VCD）和抗体滴度。11,12
然而，这些方法之间往往存在脱节：代谢组学研究可能缺乏结构化的工艺参数变化，而动态模型可能没有基于明确的代谢机制。因此，本研究的主要目标是开发一个集成的多维建模框架，将参数筛选、机制代谢阐明和实时动态预测结合起来，将生物工艺开发从经验性的终点优化提升到一个理性的、可预测的、基于机制理解的范式。
基于这一目标，本研究开发并展示了一种多维建模策略，整合了实验设计、代谢组学和动态建模。我们首先采用了一种确定性筛选设计（DSD）——一种高效的一步DoE方法，通过较少的实验即可识别出对滴度和产品CQAs影响最大的CPPs。13随后，通过正交偏最小二乘效应投影（OPLS-EP）建模和代谢途径分析进行了时间分辨代谢组学分析，以解码关键CPPs诱导的代谢重编程。OPLS-EP方法最初是为具有组内变异可能超过组间变异的依赖样本开发的。14目前，Eriksson等人将其应用于时间依赖的生物工艺代谢组学数据分析，旨在识别与大多数培养天数相关的代谢物。15最后，利用通过DSD识别的关键工艺参数和代谢组学分析获得的时间分辨代谢物谱，构建了动态过程模型，以动态预测整个培养过程中的VCD和抗体滴度。
为了展示和验证这一框架，我们选择了生产托珠单抗生物类似物的中国仓鼠卵巢（CHO）-K1细胞系作为模型系统。CHO-K1细胞因其强大的生长能力、适应无血清悬浮培养的能力以及类似人类的翻译后修饰能力而在工业生物制造中占据主导地位。16托珠单抗是一种针对白细胞介素-6受体（IL-6R）的单克隆抗体，广泛用于治疗自身免疫性疾病，并具有复杂的质量属性，使其成为研究工艺条件、细胞代谢和产品质量之间相互作用的合适模型分子。2,17
这一从参数筛选到机制解释，最终到动态预测的集成工作流程，提供了一个连贯的方法论流程。它不仅识别了工艺优化的关键因素，还为实时过程监测和控制提供了一个稳健、可解释的工具，有助于高效和理性的生物制造过程开发。
章节摘录
仪器和试剂
本研究使用的主要仪器包括Bruker Avance III 600 NMR光谱仪（Bruker，德国，配备24位自动进样器、5毫米BBO探头和Topspin工作站）；Agilent 1260 HPLC，配备VWD检测器；Agilent 1290 HPLC，配备FLD检测器（Agilent Technologies，美国）；METTLER XS105电子天平（Mettler Toledo，上海，中国）；以及Eppendorf 5424和5804 R离心机（Eppendorf，德国）。
氧化氘（D2O，99.9原子% D）和3-(三甲基硅基)
响应面建模
在CHO-K1细胞培养过程中，评估了五个可能存在高风险或控制困难的CPPs：pH值、温度、溶解氧（DO）、接种密度和喂养体积。DSD实验设计和相应的响应结果见表1和表S1。
共测量了10个响应变量，包括最终抗体滴度和9个CQAs：电荷变体（酸性和碱性）
结论
本研究采用了一种多维建模策略，系统地阐明了CPPs（包括pH值、温度、DO、喂养体积和接种密度）对CHO-K1细胞培养过程中抗体产量和质量属性的影响。首先，基于DSD的响应面模型显示，温度和接种密度是提高最终抗体滴度的核心因素，它们的回归系数显著为正。
资金信息
本工作得到了浙江省重点研发计划（CN）[项目编号2023C03116]和中国浙江省自然科学基金[项目编号LTGC24H280002]的支持。
数据可用性声明
支持本研究发现的数据可应合理要求向通讯作者索取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
