TRPM2与IKCA1之间的相互作用在小鼠小胶质细胞的温度依赖性运动及IL-1β产生中的作用

《The Journal of Physiological Sciences》：Involvement of interaction between TRPM2 and IKCA1 in temperature-dependent movement and IL-1β production in mouse microglia

　　艾库特·德韦奇（Aykut Deveci）| 加代子· Kashio（Makiko Kashio）| 桑德拉·德鲁伊切（Sandra Derouiche）| 雷静（Jing Lei）| 今泉勇二（Yuji Imaizumi）| 大矢纯（Susumu Ohya）| 岩田萌（Moe Iwata）| 富永诚（Makoto Tominaga）
日本国立自然科学研究机构生理科学研究所细胞信号传导部门，冈崎市，444-8787

**摘要**
瞬时电位黑素素2（TRPM2）在组织和细胞中的Ca2+信号传导中起着重要作用，并参与多种细胞功能。TRPM2诱导的Ca2+内流可能激活中等传导性的Ca2+-激活钾通道（IKCA1/KCa3.1/SK4），从而触发K+外流。本研究证明，TRPM2与IKCA1之间的功能相互作用参与了HEK293T细胞和小鼠原代小胶质细胞的体积变化。通过TRPM2进入细胞的Ca2+会导致K+外流，随后由于水分流失而使细胞收缩。此外，小鼠小胶质细胞在体外表现出温度依赖性的运动，这种运动受到生理温度范围内TRPM2-IKCA1相互作用的调节。这种相互作用还参与小胶质细胞的细胞因子生成。了解TRPM2-IKCA1相互作用如何促进细胞运动和细胞因子生成，对于开发治疗涉及TRPM2的疾病的新型策略具有重要意义。

**引言**
二价阳离子Ca2+作为细胞内信号分子，在人类和动物体内发挥着至关重要的生理作用，调控不同类型细胞的增殖、收缩和兴奋等过程[1][2]。Ca2+的稳态对细胞存活至关重要[3]。为了维持这种稳态，Ca2+的流动通过位于细胞膜或细胞内隔室膜上的转运蛋白或离子通道来实现[4]。在这些离子通道中，具有高Ca2+通透性的瞬时受体电位（TRP）通道作为生物传感器，对各种环境条件作出反应[5][6]。TRP黑素素2（TRPM2）是一种Ca2+通透性的非选择性温度敏感阳离子通道，不仅在脑中高表达，也在肺、肝、骨髓、脾脏和心脏等组织中表达[7][8]，在那里它作为多种刺激（包括氧化应激）的生物传感器。TRPM2在中枢神经系统（CNS）中的其他作用与其存在于小胶质细胞中有关，小胶质细胞是大脑中的巨噬细胞。TRPM2在小胶质细胞中似乎通过活性氧（ROS）和脂多糖（LPS）介导的信号通路发挥病理生理激活作用[9]。然而，大多数关于TRPM2在脑中的功能的研究都是在中风/缺血和神经退行性疾病的病理生理背景下进行的[10]，在这些情况下，TRPM2的激活与细胞因子释放、炎症加剧和神经元死亡有关。

我们之前报道过，通过几种高Ca2+通透性的TRP通道进入细胞的Ca2+会与Ca2+-激活的Cl-通道anoctamin 1（ANO1，也称为TMEM16A）相互作用，后者也被TRP通道进入细胞后的Ca2+激活。当ANO1激活时，包括K+在内的阳离子也会从细胞中流出，并通过水通道驱动水分流失。然而，哪些K+通道与ANO1耦合尚不清楚。此外，目前还不清楚在TRPM2通道激活后哪些类型的K+通道会被激活，而TRPV4与其与小导管、中导管和大导管Ca2+-激活K+通道的相互作用已被广泛研究，这些通道参与血管功能，无论是平滑肌细胞还是内皮细胞[11][12][13][14][15][16]。

在这项研究中，我们关注中等传导性的Ca2+-激活钾通道（IKCA1/KCa3.1/SK4），因为它与TRPM2具有共同的功能特性，即对细胞内Ca2+浓度升高的响应。这一内在特性使IKCA1通道能够在神经元中控制细胞兴奋性，同时维持K+稳态并调节非兴奋性细胞的体积[17]。IKCA1通道还负责平滑肌细胞和淋巴细胞的激活和增殖[18][19]。在中枢神经系统中，IKCA1通道主要位于小胶质细胞和内皮细胞中[20]。据报道，小胶质细胞中的IKCA1通道参与多种细胞功能，包括呼吸爆发、增殖和迁移，以及LPS介导的一氧化氮生成[21][22]。

小胶质细胞是中枢神经系统中一种特化的非兴奋性先天免疫细胞[23]，已知它们同时表达TRPM2和IKCA1通道[21][24]，这些通道通过监测微环境的变化（静息状态）或采取保护性特征（激活状态）来参与中枢神经系统的稳态[25]。这种表型变化赋予小胶质细胞运动能力，使它们能够沿着趋化梯度主动向损伤部位移动[26]。先前的研究表明，小胶质细胞在衰老的大脑和各种中枢神经系统相关疾病（如缺血性中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、多发性硬化症（MS）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）中发挥重要作用，通过介导神经炎症[27]。神经元-小胶质细胞通信的失调是神经退行性疾病的主要原因之一[28][29]。在本研究中，我们证明了TRPM2与IKCA1通道在HEK293T细胞和小鼠脑小胶质细胞中的相互作用，并发现这种相互作用参与了多种小胶质细胞功能。

**材料与方法**

**动物**
使用C57BL/6NCr小鼠（SLC Japan）作为野生型品系。TRPM2 KO小鼠由日本京都大学的森康夫（Yasuo Mori）博士提供[30]。用于体外延时成像的是出生后P0至P3阶段的TRPM2KO基因型小鼠。小鼠被饲养在受控环境中（12小时光照/12小时黑暗周期；室温22°C至24°C；相对湿度50%至60%），并可自由获取食物和水。所有涉及动物护理和使用的程序均获得了国立自然科学研究机构的机构动物护理和使用委员会的批准，并按照NIH关于实验室动物护理和使用的指南（NIH出版物编号85–23，修订于1985年）进行。

**细胞培养和转染**
HEK293T细胞在含有10%（体积/体积）胎牛血清（BioWest或Gibco）、青霉素-链霉素（分别为50单位/mL和50 μg/mL，Gibco）和GlutaMAX（2 mM，Gibco）的D-MEM（Wako）培养基中培养。转染前24小时，细胞以每35毫米培养皿5×10^5个细胞的密度接种。对于膜片钳和细胞体积变化记录，将HEK293T细胞培养在OPTI-MEM I培养基（Invitrogen）中的35毫米培养皿中，使用Lipofectamine（Invitrogen）和Plus试剂（Invitrogen）按制造商的方案转染0.7 μg表达载体和0.1 μg pGreen-Lantern 1 cDNA（pGL1）。孵育3至5小时后，细胞重新接种在盖玻片上，并在37°C的湿润CO2培养箱中进一步孵育。转染后20至26小时使用这些细胞进行实验。

**原代小鼠小胶质细胞的制备**
原代小鼠小胶质细胞的制备方法基于Doering 2010年的描述，并进行了修改。从出生后P0至P3阶段的小鼠大脑半球中制备混合胶质细胞培养物。组织用无菌Pasteur移液管（IWAKI）切碎，并在37°C下用胰蛋白酶（Gibco）消化8分钟。然后加入DNase（Roche），立即混合后加入马血清（Biowest）。细胞悬液以800 rpm离心6分钟。上清液被取出，细胞重新悬浮在新鲜培养基中，并通过100 μm尼龙细胞滤网（Falcon）过滤。解离并过滤后的细胞以混合胶质细胞培养物的形式接种在75平方厘米的组织培养瓶（Falcon）中，培养基为D-MEM（Dulbecco改良Eagle培养基-低葡萄糖；Sigma-Aldrich），其中含有10%（体积/体积）热灭活的牛血清（Sigma-Aldrich）、青霉素-链霉素（分别为10单位/mL和10 mg/mL，Gibco）和葡萄糖溶液（2 mg/mL，Otsuka），并在37°C的湿润CO2培养箱中培养10至20天，直到细胞达到100%的汇合度。通过摇动含有混合胶质细胞培养物的培养瓶并收集上清液中的漂浮细胞来获得原代小胶质细胞。细胞以每培养皿1×10^4个细胞的密度接种在含有12毫米盖玻片（Matsunami Glass，1082511226未洗涤（亲水）的35毫米直径培养皿中，并在37°C的湿润CO2培养箱中孵育，用于膜片钳实验。对于延时成像，细胞以每培养皿1×10^4个细胞的密度接种在含有14毫米玻璃底的35毫米直径培养皿（Matsunami Glass，D1153OH）中，并在37°C的湿润CO2培养箱中孵育。对于膜片钳实验，细胞以每培养皿2×10^6个细胞的密度接种在含有27毫米盖玻片（Matsunami Glass，D1114OH）的35毫米直径培养皿中，并在37°C的湿润CO2培养箱中孵育。

**电生理学**
转染的HEK293T细胞或原代小鼠小胶质细胞在37°C的培养基中孵育。盖玻片用含有140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM MgCl2、2 mM CaCl2、10 mM HEPES和10 mM葡萄糖的标准浴液清洗，pH值用NaOH调节至7.4。盖玻片安装在连接到重力流动系统的Warner Instruments腔室中，用于输送各种药物刺激和浴液。记录用吸管由水平拉拔器（Sutter Instruments，型号P-97）制成。对于图S1中的实验，我们使用了含有140 mM KCl、10 mM HEPES、5 mM EGTA和0至10 μM Ca2+浓度的KCl细胞内吸液溶液（pH值7.4）。对于图S2中的实验，我们使用了含有140 mM KCl、10 mM HEPES、5 mM EGTA和500 μM Ca2+的KCl细胞内吸液溶液（pH值7.4）。对于图S3，细胞内吸液溶液含有140 mM KCl、10 mM HEPES、5 mM EGTA和100 μM ADPR。细胞外溶液为标准浴液。对于所有细胞内游离Ca2+被固定在500 μM的实验，调整pH值前加入4.48 mM CaCl2（使用Webmaxc标准版本计算）。对于所有细胞内游离Ca2+被固定在100 μM的实验，在调整pH值前加入3.18 mM CaCl2。数据分析的采样频率为10 kHz，过滤频率为5 kHz（使用Axon Digidata 1550放大器和pClamp软件，Molecular Devices）。所有细胞系和小鼠原代小胶质的膜电位都固定在-60 mV。施加从-100到+100 mV的斜坡脉冲，持续500毫秒，每5秒一次。所有实验均在室温下进行。

**小胶质细胞运动的体外延时成像**
含有原代小鼠小胶质细胞的玻璃底培养皿放置在配备温度控制培养箱（Tokai Hit）的Fluoview FV1200显微镜（OLYMPUS）的载物台上，培养箱位于循环气体混合物（20% O2、5% CO2和75% N2）中。每个实验的载物台/盖玻片温度分别设置为37°C/40°C或40°C/41°C，至少在图像采集前1小时进行温度设置。通过使用金属探针和数字温度计（Unique medial）测量培养基温度来确定每个条件的温度设置。细胞以20倍相位对比物镜（Nikon Instech）每1分钟拍摄一次图像。图像采集使用Fluoview软件和Z-stack功能进行。使用ImageJ（NIH）中的Z-stack功能自动选择聚焦图像，并沿时间轴重建为一系列堆叠图像。使用ImageJ中的Manual Tracking and Migration插件工具分析小胶质细胞的迁移距离。使用Excel软件（Microsoft）计算单个细胞的迁移距离。迁移距离数据来自至少四个不同的玻璃底培养皿和四个不同的制备物，通过分析所有细胞或每个培养皿中约30个随机选择的细胞来收集。迁移力的统计分析使用JMP 14软件中的Wilcoxon/Kruskal-Wallis检验和Steel-Dwass方法进行。P值≤0.05被视为显著。

**共免疫沉淀和Western blotting**
基于不同量小鼠TRPM2和小鼠IKCA1质粒DNA的实验，我们分别使用1 μg/μl和0.2 μg/μl的TRPM2和IKCA1质粒DNA转染35毫米培养皿中的HEK293细胞（图S7）。转染24小时后，用冷的1x PBS轻轻冲洗HEK293T细胞，并收集在80 μL裂解缓冲液（含有1% Triton X-100、1 mM苯甲基磺酰氟和1×蛋白酶抑制剂混合物（Nacalai）中。所得细胞裂解液置于冰上15分钟，然后以12,000 x g离心20分钟。根据制造商的说明对细胞裂解液进行PNGase F（NEB，P0704）处理，但省略变性步骤（37°C，1小时）。所有后续步骤均在4°C下进行。重组蛋白G琼脂糖珠浆（40 μL；Thermo Fisher Scientific，15920010）与0.5 μg大鼠抗-HA（Roche，11867423001）在摇动条件下孵育4小时，经过三次离心和洗涤后收集结合了抗体的树脂，洗涤液使用含有1% Triton X-100的PBS。将细胞裂解液加入树脂中并在摇动条件下孵育过夜。通过加热至37°C并在30 μL样品缓冲液中加入50 mM DTT，将蛋白质从珠子上洗脱下来，此过程重复三次离心和洗涤。使用兔抗-HA（MBL，561）和兔抗-FLAG（MBL，PM020）抗体分别检测TRPM2和IKCA1。

从小胶质细胞共培养层中分离出小胶质细胞，并以每孔5×10^5个细胞的密度接种到含有涂层盖玻片的24孔板中，培养基为小胶质细胞培养基。2小时后，将培养基更换为含有100 ng/mL LPS O26:B6（Sigma-Aldrich）和/或10 μM TRAM-34（Cayman Chemicals）的新鲜小胶质细胞培养基，或在不含这些物质的情况下进行培养。细胞在37°C、5% CO2的湿润培养箱中孵育48小时。收集上清液立即用于细胞因子ELISA检测。剩余样本储存在-80°C以备后续分析。小鼠IL-1β的检测使用R&D systems（明尼阿波利斯，MN）提供的ELISA试剂盒，按照制造商的说明进行。使用Thermo Scientific Labsystems 1500 Multiskan读取结果。细胞因子产生的统计分析采用Wilcoxon/Kruskal-Wallis检验，随后在JMP 14软件上使用Steel-Dwass方法进行。p值≤0.05被视为显著。

**化学物质**
TRAM-34（Cayman Chemicals）溶解在DMSO（Wako）中。ADPR（Sigma-Aldrich）溶解在Milli-Q水中制成100 mM储备液，分装后储存在-80°C以备后续实验使用。LPS O26:B6（Sigma-Aldrich）溶解在Milli-Q水中制成100 μg/mL储备液，分装后储存在-20°C以备后续实验使用。分装的化学物质在用于膜片钳（ADPR）或ELISA及时间延迟成像实验的溶液中稀释至1:1000。最终DMSO浓度不超过0.1%。

**统计分析**
数据以平均值±标准误（SEM）表示。首先使用Shapiro-Wilk检验分析数据分布。参数数据的统计分析使用Origin软件（OrginLab）进行Student’s t检验或ANOVA，并使用Bonferroni方法进行事后检验。非参数统计分析在JMP 14软件上使用Wilcoxon/Kruskal-Wallis检验，随后使用Steel-Dwass方法进行。p值<0.05被视为显著。

**结果**
**TRAM-34是IKCA1通道的特异性抑制剂**
1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑（TRAM-34）是唑类抗真菌药物克霉唑的衍生物，已被证明是IKCA1的特异性抑制剂[31]。我们测试了TRAM-34对HEK293T细胞中表达的IKCA1的影响。在膜片钳溶液中用500 nM Ca2+激活IKCA1通道（接近EC50值，见图S1）后，我们从细胞外加入10 μM TRAM-34。在TRAM-34存在下，IKCA1介导的电流被抑制（见图S2），但在含有100 μM ADPR的膜片钳溶液中激活的小鼠TRPM2通道未受TRAM-34影响（见图S3）。同时，在表达IKCA1的HEK293T细胞中，ADPR和TRAM-34同时存在时未观察到IKCA1介导的电流。基于这些结果，TRAM-34和ADPR可以用来区分TRPM2和IKCA1介导的电流反应。

**ADPR激活的TRPM2导致HEK293T细胞中的IKCA1激活**
在同时表达TRPM2和IKCA1通道的HEK293T细胞中，初始电流的反转电位（Erev）为-56.8 ± 2.9 mV（红色箭头，n = 16），当膜片钳溶液中加入ADPR时，出现具有线性电流-电压（I-V）关系的瞬态电流（Erev为-29.0 ± 4.3 mV，橙色箭头，n = 16）。随后，出现反转电位为-62.2 ± 3.1 mV的电流（蓝色箭头，n = 16）（见图1 A, C, E）；在TRAM-34（10 μM；n = 14；见图1B, D, E）存在下未观察到这些电流。这种反转电位的改变表明ADPR扩散进入细胞并缓慢激活TRPM2，从而促进Na+和Ca2+的内流，随后激活IKCA1。TRAM-34完全抑制了这些缓慢激活的IKCA1通道。据报道，IKCA1相对于TRPM2具有更高的Ca2+敏感性[32],[33]，这可能导致IKCA1首先被激活。具有线性I-V关系的电流的反转电位不接近0 mV，表明TRPM2和IKCA1通道同时被激活。

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**图1. ADPR诱导TRPM2激活后Ca2+进入HEK293T细胞导致IKCA1激活。**
A. 表达IKCA1和TRPM2的HEK293T细胞的代表性全细胞电流迹线。TRPM2通道在细胞内加入100 μM ADPR时被激活（A）或同时加入10 μM TRAM-34时被激活（B）。从-60 mV的保持电位开始，每5秒施加一次-100 mV至+100 mV的斜坡脉冲，持续500毫秒。
C. 在(A)和(B)中由三角形标记的时间点处的电流-电压（I-V）曲线。
E. 上述实验中反转电位的比较。仅在没有TRAM-34和有TRAM-34的迹线之间观察到统计学显著性（p < 0.001）。*** p < 0.001（单因素ANOVA后进行Bonferroni多重比较检验）。

**IKCA1激活导致HEK293T细胞收缩**
IKCA1介导的K+外流可能伴随水分外流，从而导致细胞收缩。接下来我们在不同条件下进行全细胞膜片钳实验以观察细胞体积变化。使用荧光钙黄素可以清晰地观察细胞。当膜片钳溶液中含有500 nM Ca2+时，我们比较了表达IKCA1的细胞和pcDNA3.1转染的（假阳性）细胞。在表达IKCA1的细胞中，当细胞内含有500 nM Ca2+时，5分钟后细胞体积收缩了约22%（22% ± 2%，n = 14），10分钟后收缩了35%（35% ± 3%，n = 14）。而在假阳性转染细胞或用10 μM TRAM-34处理的表达IKCA1的细胞中未观察到这种收缩（见图2 A, C），这表明细胞内Ca2+激活IKCA1导致了细胞收缩，可能伴随水分外流。

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**图2. K+流动对HEK293T细胞体积变化的影响。**
A. 每种条件下的代表性细胞体积变化。
A. 在含有500 nM细胞内Ca2+的情况下，单独表达IKCA1的细胞（中间，橙色，n=14）与同时表达TRPM2的细胞（下方，红色，n=11）相比；与假阳性转染的细胞（上方，蓝色，n=12）相比。
B. 在含有100 nM细胞内ADPR的情况下，单独表达TRPM2的细胞（中间，绿色，n=11）与同时表达IKCA1的细胞（下方，灰色，n=11）相比。刻度尺表示20 μm。
C. 在整个记录过程中各条件下的细胞体积相对百分比的图表。黑色条形表示pcDNA3.1与IKCA1加TRAM-34（C）以及pcDNA3.1与TRPM2加IKCA1（D）之间的统计学差异（p < 0.001，单因素ANOVA后进行Bonferroni多重比较检验）。

**在不含细胞内Ca2+的情况下，同时表达TRPM2和IKCA1通道的HEK293T细胞中，加入细胞外ADPR后，观察到细胞体积在5分钟时收缩27%（27% ± 4%，n = 11），10分钟时收缩40%（40% ± 3%，n = 11）。** 这一结果表明，通过ADPR激活的TRPM2导致IKCA1激活，随后发生水分外流。而单独表达TRPM2的细胞没有收缩（见图2B, D）。这些结果与先前的研究一致，表明K+外流伴随Cl-外流和水分外流，从而减少细胞体积[34],[35]。

**TRPM2和IKCA1通道之间的物理相互作用**
由于缺乏适合TRPM2和IKCA1的抗体，我们使用带有HA标签的TRPM2和带有FLAG标签的IKCA1分别与抗-HA和抗-FLAG抗体进行共免疫沉淀实验，以检测TRPM2和IKCA1是否形成复合物（见图S4, 5）。仅在同时表达TRPM2和IKCA1的HEK293T细胞的裂解物中观察到TRPM2和IKCA1的共免疫沉淀（见图3，箭头所示），而在仅表达TRPM2或IKCA的HEK293T细胞中未观察到（见图3和图S6）。TRPM2和IKCA1的上层条带归因于N-糖基化形式，因为它们在用PNGase F切割N-连接糖基化后完全消失（见图S4-C）。

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**图3. TRPM2和IKCA1形成物理复合物。** 在HEK293T细胞中，IKCA1和TRPM2的共免疫沉淀（IP）。HEK293T细胞短暂转染空载体、单独的HA-Trpm2、单独的FLAG-IKCA或同时转染HA-Trpm2和FLAG-IKCA1，然后用抗-HA或抗-FLAG抗体进行免疫沉淀。使用针对HA标签和FLAG标签的抗体检测到的条带。在同时表达TRPM2和IKCA1的细胞中，选择性共免疫沉淀的N-糖基化（上层）和未糖基化（下层）形式的TRPM2和IKCA1用箭头标出（见图S4-C）。输入的免疫印迹显示了共免疫沉淀前的全细胞裂解物中的TRPM2、IKCA以及β-微管蛋白（βTB）条带。原始凝胶图像见图S6。

**ADPR（含100 nM Ca2+）激活TRPM2诱导小鼠初级小胶质细胞中的IKCA1激活**
为了在原生细胞中重现HEK293T细胞中观察到的TRPM2和IKCA1通道之间的功能相互作用，我们选择了小鼠小胶质细胞，因为据报道它们在功能上也表达这两种通道[21],[24],[29]。此外，我们之前还表明温度依赖性的小胶质细胞运动涉及TRPM2的功能[36]。我们从新生小鼠大脑中制备了几乎纯净的小胶质细胞培养物（见图S7）。用于小鼠小胶质细胞通道测量的膜片钳溶液中含有100 nM Ca2+，因为仅用100 μM ADPR无法激活IKCA1介导的通道（见图S8）。

**野生型（WT）小胶质细胞表现出较大的TRPM2介导的电流（Erev为-17.2 ± 2.3 mV，n = 11），随后是IKCA1介导的电流（Erev为-56.1 ± 2.2 mV，n = 11；见图4 A）。** Erev的变化与同时表达TRPM2和IKCA1通道的HEK293T细胞中观察到的变化相似。在TRAM-34（10 μM；n = 12）存在下，Erev的变化被消除，尽管仍然观察到初始的ADPR激活电流（见图4B）。同时，在TRPM2KO细胞中，无论是否存在TRAM-34，都未观察到TRPM2介导的电流或Erev的变化（数据未显示）。然而，在细胞内含有500 nM Ca2+的情况下，TRPM2KO细胞确实表现出可观察到的IKCA1介导的电流（Erev为-66.4 ± 3.1 mV，n = 11；见图4 C），但当TRPM2KO细胞用10 μM TRAM-34处理后，这些电流消失（见图4D）。综合这些结果表明，通过TRPM2的Ca2+内流激活了小鼠小胶质细胞中的IKCA1。

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**图4. ADPR通过TRPM2激活的小鼠初级小胶质细胞中的IKCA1通道。** WT和TRPM2 KO小鼠初级小胶质细胞的代表性全细胞电流迹线，不同时间点的I-V曲线由彩色三角形表示。从-60 mV的保持电位开始，每5秒施加一次-100 mV至+100 mV的斜坡脉冲，持续500毫秒。WT小胶质细胞在含有100 μM ADPR的膜片钳溶液中（A）或在含有10 μM TRAM-34的细胞外溶液中（B）（n=12）。TRPM2KO小胶质细胞在含有（C）500 nM Ca2+的膜片钳溶液中（n=11）或（D）500 nM Ca2+和10 μM细胞外TRAM-34的膜片钳溶液中（n=12）。

**小鼠初级小胶质细胞的体积变化取决于TRPM2-IKCA1相互作用**
接下来，我们利用膜片钳实验中的视频记录来评估小鼠初级小胶质细胞的体积变化（见图5）。首先，我们比较了用100 μM ADPR激活的WT和TRPM2KO小胶质细胞。在ADPR激活TRPM2后，WT小鼠初级小胶质细胞在5分钟时显著收缩了约21%（21% ± 5%，n = 5），10分钟后收缩了36%（36% ± 6%，n = 5）（见图5 A, D）。而在用10 μM TRAM-34预处理后进行全细胞构建时，TRPM2KO小鼠初级小胶质细胞的收缩现象消失（见图5 B, D）。这表明细胞体积的变化是由于IKCA1通道的激活，正如在HEK293T细胞中观察到的那样（见图2）。为了确认细胞体积变化确实与IKCA1通道的激活有关，我们直接在TRPM2KO小鼠初级小胶质细胞中用100 nM Ca2+激活IKCA1通道。我们在构建全细胞构型后5分钟观察到细胞显著收缩，幅度约为20%（20% ± 1%，n = 6），10分钟时收缩幅度达到37%（37% ± 2%，n = 6），并且这种收缩在用TRAM-34处理的细胞中得到了抑制（图5E-G）。这些数据表明，在小鼠原代小胶质细胞中，TRPM2被ADPR激活，允许Ca2+进入细胞。Ca2+的进入激活了IKCA1通道，从而促进了K+的外流，进而导致了细胞收缩。

图5. K+流对小鼠原代小胶质细胞体积变化的影响。A.B.C.E.F. 分别表示在100 nM细胞内Ca2+条件下各组细胞的代表性体积变化。A. 含有100 μM ADPR的KCl pipette溶液处理的野生型（WT）小胶质细胞（灰色，n=5）。B. 含有100 μM ADPR的TRPM2KO小胶质细胞（黑色，n=5）。C. 在细胞外存在10 μM TRAM-34的情况下，含有100 μM ADPR的WT小胶质细胞（绿色，n=8）。E. 在含有100 μM TRAM-34的情况下，含有500 nM Ca2+的TRPM2KO小胶质细胞（橙色，n=6）。刻度尺表示20 μm。（D）比较A（灰色，n=5）、B（黑色，n=5）和C（绿色，n=8）条件下的相对细胞体积变化百分比的图表；（G）比较E（橙色，n=6）和F（红色，n=8）条件下的相对细胞体积变化百分比的图表。黑色和绿色条形表示TRPM2KO与WT之间（D）或TRPM2 + TRAM34与WT之间（G）的统计差异（p <0.01（绿色）或p <0.001（黑色））。多重比较使用了单因素方差分析（ANOVA）和随后的Bonferroni检验。

我们观察到，在HEK293T细胞和小鼠小胶质细胞中观察到的体积变化提示我们研究这些通道是否与细胞迁移有关。由于细胞迁移可以被描述为细胞前端 protrusion（突起）和细胞尾部 retraction（回缩）的重复循环，这个循环可以建模为细胞前端的体积增加和细胞尾部的体积减少[26]。在 lamellipodium（伪足） protrusion（突起）期间细胞体积可能会增加，而在尾部 retraction（回缩）期间体积会减少[26]。此外，之前在迁移细胞中已经观察到局部体积减少了大约35%[37],[38]。这些先前报告的数值与我们在本研究中观察到的结果相似（图5）。

为了验证我们的模型，我们在37°C和40°C下对WT和TRPM2KO小胶质细胞进行了时间延迟成像（补充视频1）。在40°C时，WT和TRPM2KO小胶质细胞移动的距离显著大于37°C时的距离（分别为176.1 ± 5.1 μm，n = 120个细胞 vs 131.9 ± 5.1 μm，n = 120个细胞）。在两种温度下，TRPM2KO小胶质细胞移动的距离都显著短于WT小胶质细胞（图6B），这意味着小胶质细胞的温度依赖性移动涉及TRPM2，正如先前报道的[36]。当细胞预先用10 μM TRAM-34处理时，TRPM2KO小胶质细胞在37°C（97.3 ± 4.1 μm，n = 120个细胞）和40°C（112.4 ± 4.0 μm，n = 120个细胞）的温度依赖性移动几乎完全消失（图6B）。所有这些数据表明，TRPM2-IKCA1相互作用参与了小鼠原代小胶质细胞的温度依赖性移动，当这两个通道中的一个被删除或抑制时，迁移会受到损害。

以下是与本文相关的补充材料：视频S1。

之前的研究表明，TRPM2和IKCA1通道各自都参与了IL-1β的产生[39]，但TRPM2-IKCA1相互作用是否在小胶质细胞的细胞因子产生中起作用尚不清楚。在这里，我们研究了TRPM2-IKCA1相互作用是否参与小鼠原代小胶质细胞中的IL-1β产生（图7）。用100 ng/mL LPS刺激小胶质细胞时，与未经处理的对照细胞相比，IL-1β的释放量显著增加。在用100 ng/mL LPS刺激的TRPM2KO小胶质细胞中也观察到了IL-1β释放量的显著增加，尽管这种增加相对于WT来说不那么明显。这些数据表明TRPM2参与了小鼠小胶质细胞中的IL-1β产生，正如先前报道的[39]。为了研究IKCA1通道是否也参与IL-1β的产生，我们在含有10 μM TRAM-34的条件下用100 ng/mL LPS刺激了WT和TRPM2KO小胶质细胞。当IKCA1通道被TRAM-34阻断时，WT和TRPM2KO小鼠原代小胶质细胞中的LPS诱导的IL-1β产生几乎完全被消除。这些数据共同表明，LPS诱导的IL-1β产生需要TRPM2-IKCA1相互作用在小鼠原代小胶质细胞中发生。

TRPM2和IKCA1通道被广泛单独研究，但它们的相互作用之前尚未被探讨。在这项研究中，我们展示了通过ADPR激活的TRPM2进入细胞后的Ca2+会激活IKCA1，导致K+外流，进而驱动水分外流。在HEK293T细胞中，这种水分外流与35%到40%的细胞收缩相关，这与之前报道的IKCA1激活后伴随Cl-和水分外流的体积损失相似[34],[35]。TRPM2-IKCA1的功能性相互作用是基于共免疫沉淀实验中证明的物理相互作用（图3）。综合我们的结果，表明通过TRPM2进入细胞的Ca2+激活了Ca2+-激活的Cl-和K+通道，驱动水分外流，这可能涉及一个包含多达四个通道（TRPM2、IKCA1、Ca2+-激活的Cl-通道和水通道）的大复合体。

我们在HEK293T细胞和小鼠原代小胶质细胞中观察到了TRPM2和IKCA1之间的功能性相互作用，并且观察到细胞体积的类似减少（HEK293T细胞中为40%，小鼠小胶质细胞中为36%）。这些数据表明，这种相互作用可能在表达TRPM2和IKCA1的多种细胞类型中起作用。在这里，含有100 μM ADPR但不含Ca2+的pipette溶液处理了小鼠原代小胶质细胞，而只有当pipette溶液中同时存在100 nM Ca2+时才观察到IKCA1的活性。这一结果表明，通过TRPM2进入细胞的Ca2+不足以达到IKCA1激活所需的Ca2+阈值（图S8）。基于静息状态下细胞内Ca2+浓度（约100 nM），通过TRPM2进入细胞的Ca2+可以有效地激活小鼠小胶质细胞中的IKCA1，这些细胞可能表达的IKCA1通道水平低于转染的HEK293T细胞。我们还发现TRPM2和IKCA1之间的功能性相互作用参与了小胶质细胞的移动。细胞迁移被描述为细胞前端的体积增加和细胞尾部的体积减少[26]（图6 A），这两个区域的体积变化应该是一致的。因此，我们解释观察到的细胞收缩可以解释细胞尾部发生的现象。如果是这种情况，那么TRPM2和IKCA1通道蛋白在细胞前端（伪足）和尾部之间的分布可能是不均匀的。尽管由于缺乏合适的抗体，很难精确可视化细胞内TRPM2的分布，但未来的研究可能会产生支持这一假设的结果。之前的研究已经可视化和量化了高达35%的体积变化[37],[38]，这与我们在本研究中观察到的小鼠原代小胶质细胞的约37%细胞收缩相似（图5），并支持细胞体积变化确实可能与细胞迁移有关的可能性。

我们之前报道过，通过TRPV3进入细胞的Ca2+可以通过增加皮肤角质形成细胞中的EGF受体的磷酸化来促进快速伤口愈合[40]。在我们之前使用细胞插片进行的传统伤口愈合实验中，我们展示了进入人类皮肤角质形成细胞的Ca2+激活了ANO1，从而允许Cl-内流，通过减少p38的磷酸化程度来加速细胞周期[40]。伤口愈合过程中间隙的填充发生在几天内，这支持了细胞增殖在愈合中的作用。因此，我们认为，通过EGF受体磷酸化引起的细胞移动增加以及TRPV3和ANO1之间的相互作用引起的细胞增殖增加都可能有助于皮肤角质形成细胞的明显愈合。我们还之前报道过TRPV4和TRPM2参与了小鼠小胶质细胞的温度依赖性移动，其中TRPV4的作用似乎比TRPM2更为显著[36]。这种可能性是合理的，因为TRPV4和TRPM2都在人体温度范围内被激活。通过TRPV4和TRPM2进入细胞 的Ca2+可能以不同的方式促进细胞移动：通过TRPV4进入细胞的Ca2+可能通过促进肌动蛋白细胞骨架的重排来增强迁移，而通过TRPM2进入细胞的Ca2+可能通过细胞尾部收缩来促进迁移。像小胶质细胞这样具有高移动能力的细胞可能有多种机制参与迁移。小胶质细胞迁移的主要机制尚不清楚，但我们的结果显示，TRAM-34对IKCA1的抑制完全抑制了温度依赖性的小胶质细胞移动（图6），这表明细胞尾部收缩是移动的主要组成部分。

TRPM2和IKCA1都被报道参与细胞因子的产生，在这里我们展示了TRPM2-IKCA1相互作用在小鼠小胶质细胞中也对细胞因子的释放很重要[22],[39],[40]。有趣的是，用TRAM-34处理小胶质细胞几乎完全消除了LPS诱导的IL-1β产生（图7），这表明TRPM2-IKCA1相互作用对小鼠原代小胶质细胞中的IL-1β产生很重要。我们推测，当NLRP3（含有3个pyrin结构域的NLR家族成员）感知到K+外流时，可能会发生IL-1β的产生，正如先前报道的[41],[42]。NLRP3对K+外流的响应激活的分子机制尚不清楚，但NEK7（NIMA相关激酶），据报道在K+外流后作为NLRP3的结合蛋白起作用[41],[42]（图S9），可能起着作用。此外，TRAM-34对IKCA1的抑制可能导致小胶质细胞的膜去极化，从而减少通过TRPM2的Ca2+内流驱动力。因此，IL-1β转录水平的另一种可能的调节机制也可能参与其中，因为据报道IL-1β mRNA的表达受到Ca2+-依赖的PKC活性的增强[43]。TRAM34对IKCA1介导的去极化的抑制可能会减少TRPM2和TRPV4通道的驱动力，这可以解释用TRAM-34处理的小胶质细胞移动距离的大幅减少（图6）。

总之，我们的研究表明TRPM2和IKCA1相互作用，并且这种相互作用会产生不同的小胶质细胞表型。据报道，在炎症条件下，小胶质细胞中的IKCA1表达会增加[21]，因此TRPM2与IKCA1之间的相互作用可能在小胶质细胞的炎症相关功能中发挥更重要的作用。这些现象可能为开发针对涉及TRPM2和IKCA1的中枢神经系统（CNS）病理的治疗方法提供启示。尽管TRPV4与钙激活钾通道（Ca2+-activated K+ channels）之间的相互作用已经得到了充分研究[11][12][13][14][15][16]，但在本研究中并未发现其他TRP通道（除了TRPM2）能够与钙激活钾通道相互作用，同时这些TRP通道也具有较高的钙通透性[44]。由于我们之前已经报道了ANO1与TRPV4、TRPV3、TRPV1和TRPA1之间的相互作用[34][40][45][46]，许多其他具有高钙通透性的TRP通道也可能与钙激活钾通道相互作用，并参与各种依赖于钙的细胞事件。

**缩写列表：**
TRPM2：瞬时电位黑素原2（Transient potential melastatin 2）；IKCA1：中等电导钙激活钾通道（Intermediate conductance Ca2+-activated potassium channel）；ANO1：anoctamin 1；CNS：中枢神经系统（Central nervous system）；ROS：活性氧（Reactive oxygen species）；AD：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease）；PD：帕金森病（Parkinson’s disease）；MS：多发性硬化症（Multiple sclerosis）；ALS：肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis）；TRAM-34：三芳基甲烷-34（Triarylmethane-34）；ADPR：ADP-核糖（ADP-ribose）。

**伦理批准与参与同意：**
所有动物护理和实验程序均获得了我们机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）和国家生理科学研究所（National Institute for Physiological Sciences）的指导方针（21A008），同时遵守了ARRIVE指南。

**作者贡献：**
A.D.、M.K.、S.D.和M.T.设计了实验并撰写了论文。A.D.、M.K.、J.L.和M.I.进行了实验并分析了数据。Y.I.和S.O.提供了IKCA1质粒DNA，并参与了讨论。

**作者贡献声明：**
Moe Iwata：方法学研究；Susumu Ohya：资源提供；Yuji Imaizumi：资源提供；Jing Lei：数据管理；Sandra Derouiche：数据管理及概念化；Makiko Kashio：撰写初稿、数据管理及概念化；Aykut Deveci：撰写初稿、数据管理及概念化；Makoto Tominaga：撰写、审稿与编辑、撰写初稿、验证、监督、资金申请及概念化。