抗生物膜作用及抗蠕虫药Rafoxanide对食源性金黄色葡萄球菌细胞壁合成的抑制

《LWT》：Anti-biofilm effect and inhibition of cell wall synthesis in foodborne Staphylococcus aureus by rafoxanide, an anthelmintic drug

　　

摘要 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种主要的食源性病原体，其日益严重的抗菌素耐药性和与生物膜相关的持久性威胁着乳制品的安全。传统抗生素疗效的下降凸显了对替代策略的需求。本研究评估了Rafoxanide对乳制品相关S. aureus的抗菌活性及其对生物膜和细胞壁生物合成的影响。从483份生乳样本中鉴定出100株S. aureus分离株，其中包括27株阿莫西林耐药菌株和5株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株。分子分型确定ST398和MRSA ST59-t437-SCCmec IV为主要谱系。所有分离株对Rafoxanide均高度敏感，最低抑菌浓度(MIC)为1 μg/mL。Rafoxanide主要干扰生物膜发育的初始粘附阶段，抑制生物膜形成并部分破坏成熟生物膜。该效应与胞外聚合物(EPS)产生减少和粘附相关基因(srtA和clfB)的下调有关。转录组谱分析和超微结构分析表明肽聚糖和磷壁酸途径受到破坏。分子对接表明其与多种壁磷壁酸(WTA)生物合成酶存在相互作用，支持了其多靶点作用模式。此外，Rafoxanide增强了耐药分离株对β-内酰胺类药物的敏感性，且在15天的连续传代过程中未观察到MIC升高。这些发现强调了Rafoxanide作为控制乳制品系统中S. aureus污染的替代策略的潜力。

论文解读：抗蠕虫药Rafoxanide对食源性金黄色葡萄球菌的多靶点抑制作用研究

研究背景与意义

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为一种重要的革兰氏阳性病原体，不仅是临床感染的常见病因，也是全球范围内导致食物中毒的主要食源性病原体之一。特别是在乳制品生产、加工和储存过程中，S. aureus极易污染并定植，带来严重的食品安全风险。更为棘手的是，S. aureus能够形成生物膜(biofilm)，这是一种由胞外聚合物(EPS)包裹的结构化微生物群落，能够显著增强细菌对抗生素、消毒剂和环境压力的耐受性，导致持续性污染和耐药基因的传播。随着传统抗生素（如β-内酰胺类）在食品源S. aureus中耐药率的不断攀升，寻找能够有效控制耐药菌及生物膜的新策略迫在眉睫。在此背景下，药物重定位(drug repurposing)成为一条极具吸引力的途径。Rafoxanide作为一种兽医临床广泛使用的水杨苯胺类抗蠕虫药，虽已报道具有一定的抗菌潜力，但其对乳制品源S. aureus，特别是对其生物膜形成的抑制机制尚不清晰。该研究旨在阐明Rafoxanide对奶牛源S. aureus的抗菌及抗生物膜机制，为其在乳制品安全生产中的应用提供理论依据。该研究成果已发表于《LWT》杂志。

关键技术方法

研究人员从河南省奶牛场的483份生乳样本中分离出100株S. aureus，并从中筛选出27株阿莫西林耐药株进行全基因组测序(WGS)。研究选取了3株代表性多重耐药菌株（SA07、SA13、SA78）进行深入的功能验证。主要技术方法包括：微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)；结晶紫染色法定量检测生物膜形成动力学及Rafoxanide对生物膜形成和成熟生物膜的抑制与清除率；基于荧光显微镜观察SYTO9/PI双染后的生物膜形态与细胞活性；通过转录组测序(RNA-seq)分析差异表达基因(DEGs)；利用透射电子显微镜(TEM)观察菌体超微结构变化；采用AutoDock Vina软件进行分子对接模拟，探究Rafoxanide与壁磷壁酸(WTA)合成酶的结合能力；并通过连续传代实验评估耐药性发展倾向及联合药敏试验验证其对β-内酰胺类抗生素的增敏作用。

研究结果

3.1. 牛奶中金黄色葡萄球菌分离株的遗传特征

通过对27株阿莫西林耐药株的全基因组测序分析，研究人员发现ST398是最主要的序列型(33.33%)，其次是ST188和ST59。值得注意的是，鉴定出的5株MRSA均属于ST59-t437-SCCmec IV谱系，这是一种典型的社区获得性MRSA(CA-MRSA)。此外，85.18%的耐药分离株表现出强生物膜形成能力。所有测试菌株对Rafoxanide均高度敏感，MIC均为1 μg/mL。

3.2. Rafoxanide对金黄色葡萄球菌表现出显著的杀菌活性

时间杀菌曲线显示，Rafoxanide对SA07、SA13和SA78三株代表菌株的处理在24小时内呈现出明显的浓度依赖性杀菌效果。在16 μg/mL浓度下，细菌载量最高降低了约4.92 log10 CFU/mL，证实了Rafoxanide在体外对S. aureus具有显著的杀菌效力。

3.3. 金黄色葡萄球菌生物膜形成的动态特征

生物膜动力学监测显示，受试菌株的生物膜生物量在24小时达到第一个峰值（成熟期），随后在48小时左右出现下降（分散期），继而在72小时出现第二个增长峰。这一三相生长-分散-再生长模式符合S. aureus生物膜发育的经典五阶段模型。

3.4. Rafoxanide对金黄色葡萄球菌的抗生物膜活性

Rafoxanide能够以剂量依赖的方式抑制生物膜形成并破坏已建立的成熟生物膜，但其对生物膜形成的抑制效果（32 μg/mL时抑制率最高达84.05%）优于对成熟生物膜的清除效果。Resazurin代谢活性测定显示，随着药物浓度增加，生物膜细胞的代谢活力显著下降。荧光显微镜观察进一步证实，经Rafoxanide处理后，生物膜结构变得稀疏，死细胞比例增加，细胞密度显著降低。

3.5. Rafoxanide通过损害细菌粘附抑制早期生物膜形成

通过在生物膜周期的不同时间点加入Rafoxanide，研究发现其主要作用于前8小时，即生物膜发育的初始阶段。纤维蛋白原粘附实验进一步证实，Rafoxanide显著损害了细菌的粘附能力，表明其抗生物膜机制主要靶向初始附着过程。

3.6. Rafoxanide通过减少EPS产生抑制生物膜形成

对生物膜基质主要成分的分析表明，Rafoxanide处理显著降低了胞外多糖、蛋白质及胞外DNA(eDNA)的含量，其中胞外蛋白质的减少最为显著。这表明Rafoxanide破坏了构成生物膜骨架的关键结构元件。

3.7. 转录组分析揭示Rafoxanide抗菌活性的分子机制

转录组学分析显示，Rafoxanide处理显著下调了生物膜形成调控相关基因（如srtA, clfB, agr系统基因）、金属离子转运基因以及细胞壁生物合成相关基因。后者包括壁磷壁酸(WTA)合成相关基因(tag/tar操纵子)、脂磷壁酸(LTA)合成基因(ltaS)以及肽聚糖合成基因(murA, sgtB, pbpA)。RT-qPCR验证了这些基因的下调。TEM观察直观地显示了经Rafoxanide处理的菌体细胞壁变薄、结构破坏及内容物泄漏。

3.8. Rafoxanide与WTA生物合成酶的分子对接分析

分子对接模拟结果显示，Rafoxanide与WTA生物合成关键酶（TarB, TagG, TarI, TagH）具有较强的预测结合亲和力。其中与TarB的结合最强(-8.1 kcal/mol)，主要涉及疏水相互作用；与TagG的结合涉及氢键和疏水作用。这为Rafoxanide干扰WTA合成通路提供了结构生物学层面的支持。

3.9. Rafoxanide的低耐药倾向性及β-内酰胺类药物再敏化作用

连续15天的传代实验表明，对照组头孢噻呋(Ceftiofur)处理导致MIC值显著上升（最高达128倍），而Rafoxanide组的MIC值始终未变，显示出极低的耐药诱导倾向。联合药敏试验发现，1 μg/mL的Rafoxanide能使阿莫西林、青霉素和甲氧西林对受试菌株的MIC值降低8至64倍，显著增强了β-内酰胺类抗生素的杀菌活性。

结论与讨论总结

综上所述，该研究阐明了Rafoxanide对乳制品相关S. aureus（包括MRSA）的多靶点抗菌机制。Rafoxanide一方面通过损害细菌初始粘附和胞外聚合物(EPS)产生来抑制生物膜形成，另一方面通过协同干扰肽聚糖、WTA和LTA途径破坏细胞壁生物合成。分子对接结果支持了Rafoxanide与WTA合成酶的潜在相互作用。此外，Rafoxanide在实验室条件下表现出低耐药发展倾向，并能有效恢复耐药菌株对β-内酰胺类药物的敏感性。这些综合特性，加上其作为兽用抗寄生虫药的良好安全记录，凸显了Rafoxanide作为一种有前景的替代或辅助策略，用于控制乳制品生产链中生物膜相关S. aureus污染的潜力。