综述：四面体框架核酸：基于合理结构设计的生物医学应用中的结构-性能关系

《Materials & Design》：Tetrahedral framework nucleic acids: rational structural design and structure-property relationships for biomedical applications

　　苏晓峰|史思荣|王云|徐凯|董占晨|刘珊珊|卢伟通|村伟|曹华|姜燕|林云峰
基于证据的护理中心，四川大学西华医院/四川大学西华护理学院，成都610041，中国

**摘要**
在结构设计中实现纳米级精度仍然是传统非结构传递系统面临的重大挑战。四面体框架核酸（tFNAs）以其原子级精确的10纳米金字塔结构而脱颖而出，成为克服这些限制的多功能分子底盘。本文阐明了tFNA的结构设计及其结构-性质关系。初步讨论定义了tFNA的物理化学基础，重点介绍了其可编程自组装如何决定机械刚性和酶稳定性。在此基础上，分析了生物纳米界面的工程化，详细说明了tFNA支架如何进行平面外熵控制以优化探针方向，并通过平面内空间图案化来协调诊断感应中的多价识别。此外，根据载荷要求和材料演变对治疗策略进行了分类，涵盖了静态支架、动态响应系统和集成宏观水凝胶。最后，讨论了临床转化中的关键障碍，并提出了基于材料的对策，以促进这些纳米结构从实验室研究向临床应用的转变。

**1. 引言**
在现代生物医学工程中，高效传递复杂的生物大分子（如核酸和蛋白质）是一个重大的材料科学挑战。传统的有机纳米颗粒被广泛用作传递载体。其中，基于脂质的囊泡已成为临床生物相容性的黄金标准，而合成聚合物则提供了多样的功能化选项。然而，这些非结构系统经常遇到材料级别的瓶颈。具体来说，它们通常存在结构异质性和不可预测的载荷装载问题，这些问题因内吞体逃逸效率有限而更加复杂。为了解决这些问题，材料科学家开发了先进的多功能复合材料，如壳聚糖-石墨烯系统，这些系统在共同传递多种治疗剂方面显示出巨大潜力。尽管取得了这些进展，传统的聚合物网络和二维纳米复合材料仍然主要依赖于非特异性的静电相互作用或大面积表面吸附（例如π-π堆叠）来进行载荷结合。这种缺乏纳米级空间精度的情况常常导致释放动力学不可预测和生物活性变化。

**2. 功能化仿生纳米平台**
功能化仿生纳米平台，特别是伪装成细胞膜的载体，已被设计用来提高渗透性并规避免疫清除。然而，它们的制造依赖于复杂的“自上而下”的生物提取过程，这引入了批次间的结构变异性，使得材料标准化变得复杂。此外，下一代先进生物材料必须表现出对特定疾病微环境的动态适应性。例如，响应刺激的宏观网络（如基质金属蛋白酶响应性水凝胶）为智能组织修复建立了新的范式。然而，将这种动态响应行为和穿透屏障的能力无缝集成到单一纳米级载体中——而不牺牲结构精度——仍然是一个巨大的工程挑战。因此，迫切需要向“自下而上”的、纯合成的、原子级精确的结构纳米材料转变。在这方面，四面体框架核酸（tFNA）作为一种纳米级平台应运而生。tFNA由合理设计的单链DNA序列构建，能够自组装成高度可预测的三维金字塔结构。与随机组装的聚合物网络或高度复杂的膜涂层颗粒不同，tFNA的固有刚性支架和极端的空间可编程性有效克服了传统非结构载体所受的分子间空间障碍。作为刚性机械间隔物，tFNA的拓扑结构允许在其孤立顶点处精确定位多个功能基团（如靶向配体、响应开关和治疗载荷），从而实现高度同步的多功能协同作用。

**3. tFNA的结构设计与性质关系**
第2节首先定义了tFNA的物理化学基础，强调了其可编程自组装如何决定机械刚性和界面稳定性。在此基础上，第3节探讨了生物纳米界面的精确工程化。我们批判性地分析了刚性tFNA支架如何进行平面外熵控制以优化生物识别，并利用平面内空间图案化来协调多价靶向。第4节全面评估了基于tFNA的治疗纳米载体的合理设计。通过采用载荷驱动的分类方法，我们研究了传递小分子与生物大分子所需的结构策略，并追踪了从静态纳米支架到响应刺激的动态机器以及宏观水凝胶整合的材料演变过程。最终，通过将纳米级结构精度与宏观功能性能联系起来，本文旨在为下一代智能生物材料和靶向纳米药物的开发提供可操作的设计原则和关键见解。

**4. 材料架构与物理化学特性**
**4.1. 可编程自组装与拓扑结构**
tFNAs的制造依赖于沃森-克里克碱基配对中的高保真分子识别。tFNAs通过自下而上的“一锅法”自组装过程构建。这种合成是通过快速热退火循环中的热力学最小化来驱动的。如图1A所示，四种序列可编程的单链DNA（ssDNA）前体按化学计量比混合。混合物通常被加热到95°C以变性任何二级结构，然后迅速冷却到4°C。这种编程的温度梯度有助于互补片段的精确杂交，确保形成预定义的四面体拓扑结构并实现高产率。

**4.2. 机械刚性与酶稳定性**
基于DNA的材料的结构完整性主要受其抵抗核酸酶介导降解的机械强度控制。传统的线性DNA链缺乏抵抗酶攻击所需的刚性。如图2A所示，这些柔性序列具有较高的构象自由度，因此容易被酶处理和切割。相比之下，tFNAs的刚性三维结构提供了显著的机械防御机制，抵抗酶的切割。tFNAs的六条刚性双螺旋边缘形成了一个预应力框架，抵抗酶结合所需的弯曲，其密集的四面体几何结构物理上阻挡了酶分子对DNA骨架的接触。这种结构确定性确保了tFNAs在不同批次间的物理化学性质保持一致，为后续的生物界面工程提供了坚实的基础。

**4.3. 物理化学属性：尺寸、电荷和代谢清除**
tFNAs的生物性能本质上受其独特的表面化学性质和结构确定性的控制。柔性线性核酸需要阳离子转染剂才能被细胞摄取；而tFNAs则能够自发内化。tFNAs的10纳米尺寸是一个关键的生物物理触发因素，使其能够在富含胆固醇的脂质筏中定位，从而引发 Caveolae 介导的内吞作用。这种尺寸驱动的内吞作用克服了阴离子质膜带来的强烈静电屏障。tFNAs的密集磷酸骨架产生强烈的负表面电荷，通过几何驱动的“角度攻击”定向来规避这种排斥。由于其各向异性，四面体在初始膜接触时采用顶点优先的相互作用模式，从而最小化热力学能量状态，减少了有效截面接触面积，降低了整体静电排斥。这种精确的空间定向显著减少了有效接触面积，从而最小化了全局静电排斥。

**5. 生物纳米界面的精确结构工程**
构建具有分子级精度的生物纳米界面是材料科学中的一个基本但尚未解决的挑战。传统的功能化方法通常依赖于柔性聚合物或单链核酸，受到高构象熵和随机表面聚集的影响，导致界面性质不均匀。tFNAs提供了一种从“随机化学修饰”到“理性结构构建”的过渡。作为刚性“分子底盘”，tFNAs对界面施加了严格的几何约束，克服了这些限制。本节阐明了tFNAs架构如何在两个维度上机械工程化生物界面：（1）通过平面外熵控制来强制探针方向（第3.1节）；（2）通过利用离散拓扑进行精确的空间图案化（第3.2节）。这些策略从根本上重新配置了生物识别的热力学和动力学。相比之下，刚性的tFNA支架对探针施加了精确的熵控制。通过施加拓扑约束，tFNA抑制了锚定探针的熵卷曲，迫使它们保持直立和有序的取向。这种结构驱动的熵调节最小化了非特异性纠缠，并最大化了目标的可及性（图4A）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像

图4. 用于熵控制的刚性支架：从机制到应用。(A) 柔性的单链DNA（ssDNA）探针自然呈现卷曲构象，导致空间位阻和非特异性表面吸附。相比之下，刚性的tFNA支架通过施加熵控制，迫使探针保持直立取向。这种“垂直于平面”的策略通过将结合域提升远离污染界面，有效抑制了背景干扰。使用BioRender.com创建。(B) 基于这种可访问的界面，刚性取向显著加速了反应动力学。与容易“躺平”的柔性探针不同，直立的tFNA确保结合域完全暴露在溶液中，从而便于快速捕获免疫细胞表型。转载自Signal Transduct Target Ther（参考文献52），版权所有（2024年），经Springer Nature许可。(C) 用于复杂3D扩增的支架：刚性的tFNA基体有效防止了长聚合物在电极表面的熵坍塌。转载自Advanced Materials（参考文献53），版权所有（2024年），经John Wiley and Sons许可。

首先，这种熵调节通过克服空间位阻来优化简单生物界面的性能。在静态灵敏度方面，tFNA维持的直立取向有效抑制了复杂基质中的非特异性结合。例如，在同时检测霉菌毒素时，Li等人利用tFNA支架来锚定信号探针。这种刚性结构最小化了复杂样品中的背景干扰。类似地，这种刚性固定策略已扩展到与2D材料的耦合。在病毒检测系统中，tFNA支架调节了铋烯表面的电子转移，证明了刚性取向对于提高电化学传感的选择性至关重要。[51]。

除了静态灵敏度外，直立构象还显著加速了反应动力学。通过确保探针完全暴露而不是平躺在表面上，tFNA增加了可访问结合位点的局部有效浓度。Chen等人在免疫细胞表型分析中展示了这一优势，tFNA支架实现了最佳的空间取向。这种结构优势将检测时间缩短至30分钟内，突显了熵控制在快速诊断中的关键作用。[52] 此外，当构建复杂的3D信号放大器时，tFNA的刚性是不可或缺的。与简单探针不同，这些长的HCR聚合物极易在电极表面发生熵坍塌。刚性的tFNA基体有效防止了这种坍塌，保持了可访问的3D构象，使得能够在微量体积中超灵敏地检测到细胞因子。[53]

最后，刚性支架为复杂的动态分子机器提供了所需的结构稳定性。与静态结合不同，动态操作需要一个“无故障”的环境。Zhang等人利用刚性的tFNA框架作为DNA行走者的稳定“3D轨道”，防止了不受控制的空间位阻，确保了精确的运动，实现了19.8阿姆的检测限（LOD）。[54] 这一策略已被证明适用于促进其他动态系统，如APE1蛋白行走者[55]和无酶目标回收放大[56],[57],[58]，其中刚性支撑保证了探针在多步反应过程中的持续可及性。

3.2. 可编程拓扑用于空间图案化

除了刚性之外，tFNAs的离散拓扑结构还能够实现功能性配体的精确侧向空间图案化。通过操纵顶点上配体的化学计量比和距离，tFNAs可以诱导特定的受体聚集或实现与目标表面的精确几何匹配（图5A）。这种策略最显著的应用是在细胞分选中。Yin等人开发了一种拓扑工程化的配体系统，根据特定的化学计量结构排列多个配体。这种精确的空间图案化诱导了细胞膜上的受体聚集，从而通过亲和效应增强了结合强度，并提高了细胞亚型诊断的灵敏度（图5B）。[59] 类似的拓扑设计也被成功应用于识别肝细胞癌亚型。[60]

图6. 图7. 下载：下载高分辨率图像（890KB）下载：下载全尺寸图像

图5. 用于空间图案化的可编程拓扑。(A) 操纵配体的几何形状和密度。使用BioRender.com创建。(B) 配体的化学计量比排列诱导细胞膜上的受体聚集，以实现精确的细胞分选。转载自Angew. Chem. Int. Ed.（参考文献59），版权所有（2020年），经John Wiley and Sons许可。(C) 利用tFNA的离散3D拓扑结构构建高局部密度的“热点”，调节CRISPR-Cas12a的跨切割，以实现超灵敏的信号放大。转载自Angew. Chem. Int. Ed.（参考文献64），版权所有（2023年），经John Wiley and Sons许可。

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图6. 裸露tFNA的固有生物活性：结构驱动的细胞和细胞器调节。(A) 示意图展示了裸露tFNAs如何通过拓扑结构被内化到干细胞中，调节细胞内信号传导以促进增殖和靶向分化。转载自Bioactive Materials（参考文献67），版权所有（2021年），经Elsevier许可。(B) tFNA在高葡萄糖氧化应激下调节牙囊干细胞的微环境重塑。转载自Chinese Chemical Letters（参考文献69），版权所有（2024年），经Elsevier许可。(C, D) 关键的拓扑比较：示意图（C）和共聚焦显微镜（D）显示，虽然单链DNA（ssDNA）无法修复高葡萄糖引起的细胞器碎片化，但tFNA的刚性3D几何结构积极恢复了线粒体和内质网之间的结构网络和相互作用。转载自NANO TODAY（参考文献70），版权所有（2021年），经Elsevier许可。(E, F) 蛋白质水平验证（E）和机制示意图（F）展示了tFNA支架的固有生物活性如何通过改变细胞内促凋亡和抗凋亡因子的分布来减轻线粒体介导的凋亡。转载自Nano Lett（参考文献71），版权所有（2021年），经American Chemical Society许可。

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图7. 基于tFNA几何配置的小分子结构依赖性装载。(A) 示意图和多柔比星（DOX）插入刚性tFNA框架的表征。DOX的平面芳香系统在DNA螺旋边缘实现了高亲和力的π-π堆叠，提供了稳定负载所需的结构完整性。转载自Advanced Materials（参考文献73），版权所有（2025年），经John Wiley and Sons许可。(B) 阿 Asiatic acid（AA）通过多价相互作用稳定在DNA螺旋的次要或主要沟槽中。这种“拓扑屏蔽”防止了疏水性TCM单体的过早聚集，增强了它们的体内稳定性。在骨再生模型中，这种稳定的装载方式允许精确输送AA，以协调免疫-血管-骨生成微环境。转载自Advanced Science（参考文献74），版权所有（2025年），经John Wiley and Sons许可。(C) HApt-tFNA@DM1（HTD）缀合物的模块化组装通过将maytansine（DM1）通过双功能连接器连接到特定的DNA末端，实现了药物与载体的确定比例（3:1）控制。转载自Advanced Materials（参考文献75），版权所有（2022年），经John Wiley and Sons许可。

在微生物检测中，这种“模式匹配”能力被用于双位点识别。Tang等人采用了一种双识别策略，其中tFNA支架被设计为同时结合细菌16S rRNA基因的两个目标区域。探针之间的空间接近度由tFNA的几何结构精确控制，确保了高特异性。[61] 类似地，在病毒检测中，Li等人设计了多触手tFNA-磁珠卫星。特定的拓扑结构允许高密度显示识别元件，从而快速诊断多种SARS-CoV-2突变株。[62]

此外，tFNA拓扑结构还支持复杂信号转导的层次化组装。例如，tFNA自组装的树状大分子被用来有效聚集脂多糖，识别细菌外膜。[63] 在核酸检测中，tFNA提供的精确空间控制允许通过交错的双tFNA单元构建“polyDNA拉链”，并调节具有不同局部密度的框架热点报告器（图5C）。[64] 这种能力还扩展到调节酶级联反应，其中tFNA支架控制酶之间的距离以优化催化效率。[65]

4. 治疗性纳米载体的合理设计

4.1. 固有生物活性：结构驱动的细胞调节

虽然第3节阐明了细胞外生物纳米界面的结构工程，但本节探讨了内化tFNA的细胞内治疗效应。独立于外源负载，裸露的tFNA由于其纳米级几何结构和机械刚性而表现出固有的生物活性。与易快速降解且几乎不自发被细胞摄取的柔性单链核酸（ssDNA）不同，带负电的tFNAs的3D框架通过细胞膜上的结构“角攻击”促进了有效的caveolin介导的内吞作用。进入细胞后，这种结构调节直接影响宏观细胞行为，如增殖、迁移和分化。[66] 例如，由滑膜来源的间充质干细胞（SMSCs）内化的刚性tFNA支架在机械和化学上改变了细胞内微环境，指导软骨生成分化（图4A）。[67] 同样，在病理性的高葡萄糖微环境中，裸露的tFNAs通过减轻ROS介导的氧化应激，成功恢复了牙囊干细胞（DFSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）受损的骨生成分化能力（图4B）[68],[69]。重要的是，这种生物活性完全依赖于3D拓扑约束，而不是组成DNA链的化学组成。

除了调节全局细胞行为外，tFNAs的固有生物活性还调节细胞器的动态。在严重的氧化应激下，如高血糖微环境中，细胞稳态会被破坏，经常导致细胞器碎片化。研究表明，裸露tFNAs的内化成功恢复了这些细胞内网络的结构完整性。具体来说，比较共聚焦成像显示，虽然柔性的1D ssDNA无法防止线粒体碎片化，但tFNAs的刚性3D结构积极恢复了线粒体和内质网之间的相互作用（图4C–D）。[70] 通过改变细胞内促凋亡和抗凋亡蛋白的分布，这种结构调节有效减轻了线粒体介导的凋亡（图4E–F）。[71] 总而言之，这些机制表明，精确可编程的DNA拓扑结构可以作为独立的、结构驱动的纳米药物。

4.2. 物理插层策略：小分子的输送

传统的纳米载体，如聚合物胶束和脂质体，已经为临床药物输送建立了坚实的基础，通过体积物理包裹实现。尽管这些系统在高容量装载方面表现出色，但它们依赖于随机自组装，通常导致封装状态的分布而不是单一的分子定义。此外，在生理环境的动态剪切应力下保持结构完整性对许多超分子组装来说仍然是一个非平凡的工程挑战。相比之下，tFNA的数学上可定义的框架提供了一种基于空间可访问性的补充范式。通过利用DNA双螺旋的可编程静电场和拓扑周期性，tFNAs实现了可预测的药物装载和空间限制的结合位点，使载体在整个输送过程中保持高保真的3D几何完整性。

最近的计算洞察严格定义了这些装载范式。全原子分子动力学和对接模拟显示，小分子的空间容纳受其3D结构兼容性的控制。虽然平面分子可以插入，但非平面物种，如肽基精氨酸脱亚胺酶类型4抑制剂GSK484，在热力学上被限制无法插入。[72] 强制插入这种大分子会破坏DNA框架的完整性；相反，它们通过多价氢键和静电相互作用在四面体架构的次要/主要沟槽和内外角处稳定。首先，物理插层是具有平面芳香系统的负载物的主要设计策略。平面分子，如多柔比星（DOX）和其他蒽环类药物，通过π-π堆叠相互作用插入相邻的G-C碱基对之间。从材料设计的角度来看，这种策略不需要对DNA链进行化学修饰，同时保持了框架的机械刚性，并有效地将客体分子屏蔽在螺旋堆中。由此产生的复合物表现出增强的结构稳定性，这对于在系统循环过程中保持负载物完整性以及最小化脱靶效应至关重要。当tFNAs集成到复杂的输送环境中时，这种结构保真度尤其有利。例如，Ma等人（2025年）设计了骨髓基质细胞（BMSC）衍生的纳米囊泡来封装装载DOX的tFNAs。通过利用BMSC膜的天然归巢能力，这种混合系统有效地绕过了骨髓-血液屏障。在这种情况下，tFNA骨架作为刚性的内部支架，稳定了插入的DOX，显著减少了传统脂质体配方中常见的药物过早泄漏现象（图8A）。

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图8. 基于tFNA的空间可访问性和结构保护用于生物大分子的输送。(A) 示意图展示了适配体功能化的tFNAs（apt-tFNA）为生物大分子输送提供空间可访问性。该复合物通过微侵入性结膜给药方式递送一种针对VEGFA的治疗性适配体，有效穿透多个生理层，到达眼底以治疗脉络膜新生血管。转载自《美国化学会杂志》（参考文献43），版权所有（2025年），经美国化学会许可。（B）坚固的四面体框架（tDF）结构通过硫醇键与金纳米颗粒（AuNPs）结合，确保捕获的DNA在tDF-SNA上呈垂直排列，从而提高目标siRNA的捕获效率。相比之下，标准SNAs或双链球形核酸（ds-SNA）由于采用柔性线性链，在AuNP表面呈倾斜排列，导致目标siRNA捕获效率较低。转载自《德国应用化学国际版》（参考文献76），版权所有（2024年），经John Wiley and Sons许可。（C）四种单链DNA快速热自组装形成tFNA支架，随后在室温下孵育6小时。这有助于骨生成生长肽沿框架边缘密集整合，作为保护性外骨骼，限制不稳定生物大分子的构象变化。转载自《Advanced Science》（参考文献77），版权所有（2022年），经John Wiley and Sons许可。与平面插层不同，沟槽结合范式解决了非平面、体积庞大的疏水单体因空间限制而无法与DNA堆叠的问题。例如五环三萜类化合物如亚洲酸（AA）等客体分子可以在四面体结构的次要或主要沟槽及内外角稳定存在。这种适应是通过多价相互作用实现的，包括氢键作用和疏水驱动的脱溶剂化。设计重点在于拓扑屏蔽；通过将疏水单体嵌入沟槽中，tFNA支架充当分子“外骨骼”，防止药物过早聚集并保护负载物免受酶降解。在颅面骨再生模型中，这种稳定的装载方式确保AA精确递送，通过STAT3磷酸化重新编程线粒体代谢，证明tFNA介导的沟槽结合能有效将结构稳定性转化为特异性功能调控（图8B）。[74]。虽然这些非共价策略利用了DNA的内在空间空腔，但某些应用需要更高的化学计量精度，因此需要使用化学连接剂。当需要固定化学计量比或特定空间取向时，会采用共价结合。如Ma等人所示，强效微管抑制剂如美坦辛（DM1）可以通过双功能连接器连接到DNA链的3′或5′末端。这种策略能够创建适配体引导的药物结合物，其药物与载体的比例显著提高至3:1，是传统结合物的两倍（图8C）。通过用DM1修饰S1、S2和S3链，同时保留S4用于HER2靶向适配体，实现了空间解耦。这种精确的模块化组装确保治疗性负载物不会对框架的自组装或受体结合事件产生空间干扰。最终，这种空间定向的共价递送利用tFNAs的固有刚性，促进细胞内化并有效调控复杂的生理微环境。[75]。4.3. 空间可寻址性与保护：生物大分子的递送虽然小分子的递送主要利用DNA双螺旋的内部拓扑环境，通过物理插层或沟槽结合来稳定疏水负载物，但大体积生物大分子的运输需要转向外部模块化整合。对于适配体、寡核苷酸和肽等治疗剂，tFNA从被动容器演变为可编程底盘。这里的核心设计原则是可寻址性：通过利用tFNA顶点和边缘的离散3D坐标，研究人员可以超越随机封装，实现对复杂生物负载物的空间取向和化学计量比的精确控制。整合核酸配体（尤其是适配体）的主要理由在于空间解耦。与传统结合物不同，tFNA提供了刚性结构缓冲，确保适配体保持其活性三维构象，从而实现高亲和力受体结合。这一几何确定性原理通过抗血管内皮生长因子A（VEGFA）适配体整合的tFNA（apt-tFNA）得到体现。tFNA的拓扑刚性和校准的流体动力学尺寸（约10纳米）经过专门设计，可以利用细胞旁途径，使适配体穿过紧密连接的外血液-视网膜屏障。这种微侵入性转运展示了精确的几何控制如何克服独立生物大分子无法穿透的强大生物屏障（图9A）。[43]。下载：下载高分辨率图像（368KB）下载：下载全尺寸图像图9. 刺激响应tFNA平台的结构设计逻辑。（A）BDS-A的设计利用tFNA的顶点可寻址性来固定带粘性末端的DNA连接器。这种空间排列促进了DNA-RNA杂化“锁”的形成，仅在细胞内进入时才发生酶促“解锁”。相比之下，BDS-B采用拓扑屏蔽策略，将负载物物理隔离在四面体笼内，增强对抗系统降解的结构保护。转载自《Nature Protocols》（参考文献79），版权所有（2024年），经Springer Nature许可。（B）示意图显示了pH响应纳米盒内的构象到机械转变。通过将富含胞嘧啶的i-基序序列编码到支架中，材料在酸性条件下从柔性链转变为刚性四链结构。这种局部结构应变触发了四面体框架的机械解离，为溶酶体逃逸提供了精确的时间控制。转载自《Advanced Materials》（参考文献82），版权所有（2022年），经John Wiley and Sons许可。对于siRNA等基因调控序列，tFNA结构充当高度稳定的结构屏障。这种静态配置将负载物的治疗效力与其固有的环境敏感性分离。设计理念在于创建一个刚性拓扑环境，物理隔离脆弱的磷酸二酯骨架免受核酸酶切割。一个有力的例子是基于四面体DNA框架的球形核酸（tDF-SNAs）的开发。受冠状病毒刺突结构的启发，研究人员采用界面工程技术在金纳米颗粒表面密集排列坚固的tDFs。该平台不依赖刺激响应触发器，而是利用纯几何确定性和空间阻碍来增强递送效果。刚性tDF单元创建了一个宽敞稳定的微环境，防止生物分子缠结，降低siRNA杂交的焓障碍。这一结构优势将siRNA双链效率从20%提高到95%。此外，这种刺突静态结构改变了内吞途径，采用独立于网格蛋白的细胞吞噬机制，显著促进溶酶体逃逸和直接胞质摄取。因此，仅通过优化拓扑界面，tDF-SNAs将细胞摄取提高了1到2个数量级，并使基因沉默效果提高了2倍（图9B）。[76]。不稳定肽的递送，如骨生成生长肽（OGP）、免疫肽小鼠β-防御素2、抗菌肽和特立帕肽，利用tFNA作为分子外骨骼来限制其构象（图9C）。[73]，[77] DNA框架的高机械刚性降低了连接肽的熵灵活性，从而最小化代谢失活并延长其生物半衰期。tFNA支架快速自组装后，在室温下孵育6小时，有助于OGP沿框架边缘密集整合。该设计利用DNA外骨骼的庞大空间体积彻底包裹肽，保护它们免受过早代谢切割，同时保持其生物活性构象。4.4. 动态结构重配置：刺激响应系统为了克服静态递送的局限性（如过早泄漏和不良的时空控制），tFNAs被设计为生物可切换的递送系统（BDS）。核心设计理念从被动封装转变为动态重配置，其中DNA框架作为智能门控器，响应病理微环境中的特定生化或物理化学信号。[78]。细胞内酶活性和氧化还原梯度为负载物释放提供了高精度触发。一种策略是利用RNase H介导的DNA-RNA杂化链切割。通过将miRNA嵌入四面体边缘或将其连接到顶点，研究人员开发了在循环期间保持惰性但在内化后快速酶解杂化连接器的系统（例如BDS-A和BDS-B）[79]。基于这一基础逻辑，Wang及其同事最近开发了一种生物可切换的Tri-miR-22模拟递送系统（BiRDS）。细胞进入后，内源性RNase H识别并切割这些特定杂化连接器。这种靶向酶促作用导致BiRDS载体从刚性三维四面体转变为柔性二维结构[80]。除了酶促水解外，氧化还原响应系统还利用细胞内的化学梯度。例如，利用细胞外和细胞内环境间谷胱甘肽（GSH）浓度的显著差异，通过二硫键整合实现切割。在四面体DNA-RNA纳米笼（TDRN）中，GSH诱导的切割触发框架的解体。这种机制在肿瘤细胞的还原环境中特异性激活siRNA负载物，同时在正常组织中保持结构完整性[81]。内溶酶体（pH≈5.0）或肿瘤微环境（pH≈6.5）的酸性变化是结构转变的通用信号。最稳健的设计原理利用i-基序转变，其中富含胞嘧啶的序列在酸性条件下从柔性单链转变为刚性四链四聚体。Gao等人利用这一原理构建了pH响应纳米盒；在低pH下形成i-基序导致四面体支架的机械解离，促进溶酶体逃逸和随后的封装siRNA释放。这一概念扩展到宏观级层次系统，如通过杂交链反应形成的pH响应水凝胶微胶囊，其中i-基序编码的壳在肿瘤间质中选择性地降低其刚性，以实现细胞摄取和负载物释放[82]。先进的tFNA平台整合外部刺激或特定分子识别，实现“按需”释放。受生物防御机制的启发，设计了适配体门控外骨骼来感知膜生物标志物；例如，AS1411与细胞表面核糖蛋白的结合触发tFNA载体的全局构象崩溃，仅在目标位置释放强效负载物如蜂毒肽[83]。此外，光响应系统提供了非侵入性的时空控制手段。利用近红外照射，以金纳米颗粒为中心的upconversion-nanoparticle四面体实现靶向分解。同时，靶向光敏剂递送利用Mucin 1识别。这种特定的生物分子门控确保活性氧的生成严格限制在肿瘤细胞内，从而最小化对周围健康组织的附带损伤[84]。4.5. 层次化组装：从纳米支架到DNA水凝胶基质将tFNAs整合到水凝胶基质中代表了一种复杂的层次化组装策略，弥合了离散纳米结构和宏观治疗支架之间的差距。通过从自由扩散的“纳米包”转变为局部“大容量储库”，这些系统避免了快速系统清除，在病理微环境中提供持续的治疗窗口。根据组装逻辑，这些平台分为物理混合复合材料、异质网络和纯框架基水凝胶。最直接的持续定位策略是将tFNAs封装在传统聚合物基质中。在这种“客体-宿主”配置中，水凝胶作为多孔屏障，而物理嵌入的tFNAs保持脆弱负载物的结构完整性。无论底层基质交联机制如何，都可以实现这种纯物理捕获。例如，利用化学交联的宿主，研究人员通过紫外光固化将tFNAs整合到GelMA基质中。这种层次化设计确保生物活性miR-29c缓慢扩散到骨缺损部位，显著促进骨生成[85]。或者，使用物理交联的宿主，SA@TSCC系统将功能化的tFNAs与海藻酸盐混合。在鼻腔富Ca2+环境中暴露时，海藻酸盐链在原位快速、响应刺激地发生离子凝胶化。这种机制将tFNAs“纳米包”捕获在柔性水凝胶中，显著延长其在鼻黏膜上的保留时间，无需共价固定[86]。下载：下载高分辨率图像（403KB）下载：下载全尺寸图像图10. 宏观tFNA-水凝胶矩阵的层次化组装策略。示意图展示了SA@TSCC系统的原位离子凝胶化。鼻腔内的内源性Ca2+触发海藻酸盐快速交联。这一过程将功能化的tFNAs纳米包物理捕获在黏膜表面。伴随的扫描电子显微镜图像显示了形成的多孔屏蔽网络。转载自《Advanced Materials》（参考文献86），版权所有（2026年），经John Wiley and Sons许可。（B）硫醇功能化的tFNAs（SH-p3T）共价整合到甲基化透明质酸（HAMA）骨架中。紫外（UV）照射引发高效的硫醇-烯点击反应。这种靶向点击结合将tFNA从被动负载物转变为复合水凝胶（HA-p3T）中的活性结构节点。扫描电子显微镜（SEM）图像证实了这种结构框架的坚固性和相互关联性。转载自《Biomaterials》（参考文献90），版权所有（2025年），经Elsevier许可。（C）离散的tFNA构建块（Ta和Ta*）通过直接序列编码进行交联。这种编程式的层次化杂交驱动宏观凝胶化过程，形成自支撑的三维纯DNA水凝胶（TDH）。这种最终的组装逻辑完全消除了对合成聚合物或外源性化学交联剂的需求。转载自《Advanced Materials》（参考文献91），版权所有（2025年），经John Wiley and Sons许可。

4.5.1. 异质交联网络
为了提高支架的机械和生物保真度，tFNAs已经从被动添加剂演变为主动交联节点。与早期依赖脆弱的单链DNA（ssDNA）连接器或弱物理缠结的设计不同，现代材料设计强调界面共价锚定，以创建坚固的结构网络。这一转变目前主要由两种化学策略推动：自由基引发的共聚反应和生物正交点击化学。[87],[88],[89] 传统DNA水凝胶的一个主要挑战是高合成温度（例如46.3℃）和寡核苷酸的高成本，这限制了细胞封装。为了解决这个问题，Su及其同事开发了一种聚合物改性的异质DNA水凝胶。通过使用乙烯基或丙烯酸酯改性的DNA序列，tFNA单元作为多臂大分子交联剂，并通过温和的37℃聚合过程无缝集成到合成聚合物基质中。[87] 对于需要极端界面稳定性和最小空间阻碍的应用，硫醇-烯点击功能化的水凝胶是一个重要的里程碑。一个典型的例子是BBPs-tFNA/HAMA系统，其中硫醇端化的tFNAs（SH-tFNA）通过共价键接在甲基丙烯酸化的透明质酸（HAMA）骨架上。这种“点击”集成确保了DNA框架在聚合物基质中的结构锚定，防止在动态体内环境中过早渗出（图8B）。[90]

超越依赖聚合物的网络，这种层次化组装的巅峰是构建纯DNA网络，其中tFNA本身作为唯一的构建块。这种“框架即基质”的范式消除了合成聚合物的潜在免疫原性，并且可以在不同的空间尺度上进行精细工程化。在宏观层面上，物理诱导为结构演变提供了强大的触发器。例如，施加旋转力可以将离散的tFNA单元转化为自支撑的三维纯DNA水凝胶（TDH）。这种快速的物理凝胶化过程不需要外源性化学交联剂，代表了基于DNA的生物材料中的最高结构纯度（图8C）。[91] 将这种纯组装逻辑转化为纳米尺度，可以开发出用于靶向系统递送的动态纳米凝胶支架，如PP-FNANG。在这些纳米结构中，治疗序列（例如siRNA）通过粘性末端杂交作为特定的交联剂来连接tFNA单元。这种模板生长不仅实现了高效负载协同作用剂（如多柔比星），还确保了siRNA的功能保真度。[92]

5. 临床转化的挑战与未来展望
虽然tFNAs代表了从随机软物质载体到确定性、结构工程化纳米平台的重大范式转变，但它们从临床前实验室研究向临床应用的过渡仍受到若干材料科学障碍的制约。[93],[94],[95] 解决这些挑战需要超分子化学、界面工程和可扩展制造的共同努力。将tFNAs转化为临床应用的最大挑战在于在复杂的生理环境中保持其精确的拓扑结构。尽管刚性框架相比线性DNA增强了抗核酸酶能力，但裸露的tFNAs在体内的稳定性有限（通常最多7天），[96] 这对于需要长期治疗窗口的疾病（如骨关节炎或糖尿病组织再生）来说是不够的。此外，特定给药途径的恶劣微环境（例如口服给药时的胃酸降解）需要先进的结构强化。为了应对这一问题，未来的材料设计必须关注结构刚性和界面防护。在骨架水平上的化学修饰，如位点特异性的磷硫酯连接，可以显著提高抗核酸酶能力。[97] 同时，利用仿生膜伪装或将tFNAs整合到宏观水凝胶网络中可以提供物理屏障，防止快速清除。此外，当tFNAs进入血液时，其高度可控的空间排列容易受到非特异性生物污染（蛋白质冠效应）的影响。[98] 这种动态蛋白质吸附如何改变精心设计的“垂直于平面”的熵控制和“平行于平面”的配体几何形状，仍然是生物纳米界面研究中一个关键且未被充分探索的领域。

tFNAs的一个独特结构-性质关系是它们高效的细胞内化能力，这是由细胞膜上的“角/角度攻击”机制驱动的。然而，在功能化过程中出现了一个重要的工程悖论：在孤立的顶点上结合体积较大的靶向配体、诊断探针或大分子药物会导致严重的空间阻碍，从而破坏角攻击的固有几何优势。为了解决这种几何冲突，未来的研究必须转向动态响应的递送系统，类似于生物可切换递送系统（BDS）。通过采用非共价策略，如刺激响应的静电吸附或高度特异性的疏水相互作用，功能基团可以暂时被屏蔽或在目标细胞微环境中特异性释放。[89] 这种“隐蔽到激活”的转变可以在循环和内化过程中保持裸露tFNAs的拓扑优势，仅在细胞内定位时才显示功能探针。

此外，将这些基于DNA的纳米载体从实验室推向临床应用需要与已建立的平台（如脂质体和合成聚合物）进行客观的基准测试。在免疫原性和稳定性方面，纯tFNAs通常比阳离子聚合物表现出更好的生物相容性，后者经常遇到毒性问题。此外，虽然脂质体和聚合物依赖于随机自组装——这往往导致结构异质性和在生理剪切应力下的早期载荷泄漏——但刚性DNA框架保持了高保真的三维几何完整性。然而，这种结构精度带来了装载能力的折中；脂质体在批量封装方面具有优势，而tFNAs则受到确定性的化学计量装载限制（例如，特定的分子比例）。

向临床范式的转变要求严格的制造标准化和成本降低。最严重的限制是基础材料的生产成本。与可以使用廉价脂质前体的微流控混合快速扩大规模的脂质纳米颗粒不同，通过传统的固相磷酸酰胺合成方法大规模生产高纯度、序列特异性的DNA链在经济上仍然具有挑战性。[99] 克服这一转化瓶颈将不可避免地需要向可扩展的生物技术制造转变，例如酶促合成或工程化的噬菌体表达系统。即使在合成之后，昂贵的靶向分子的定制化学 conjugation 也会显著增加生产成本。为了实现商业可行性，材料科学家必须开发一个通用的、“即插即用”的tFNA底盘，配备标准化的化学连接器。此外，从微尺度实验室自组装向工业规模的良好生产规范（GMP）生产过渡需要克服重大的化学工程障碍。优化热力学退火轨迹和标准化大规模纯化协议（例如工业HPLC）对于消除批次间的结构差异至关重要。

除了克服结构和制造障碍外，预测降解DNA片段的精确代谢命运也是临床批准的一个严格监管前提。虽然tFNAs的最终降解产物是高度生物相容的内源性核苷酸，但追踪它们的中间药代动力学清除途径（例如肾脏排泄与网状内皮系统吸收）对于建立长期生物安全性至关重要。[50],[99],[100],[101] 此外，目前的临床前研究主要依赖于小鼠模型，这些模型由于显著的免疫学和生理学差异，缺乏预测人类临床结果的能力。为了弥合这一转化差距，未来的研究必须在大型动物模型（例如猪或非人灵长类动物）中进行严格的疗效和毒理学验证。只有通过这种严格的生理学基准测试，才能最终确定基于tFNAs的治疗剂的真正临床潜力和安全性。

总体而言，通过从简单的化学混合物转向合理设计的拓扑结构，tFNAs重新定义了生物纳米界面控制和 cargo 驱动递送的极限。随着跨学科策略克服体内稳定性和可扩展合成的剩余障碍，这些精确的DNA架构有望成为下一代智能生物材料和精准纳米医学的基础底盘。

未引用的参考文献。[5]

CRediT作者贡献声明：
Xiaofeng Su：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、可视化、验证、概念化。
Sirong Shi：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、监督、概念化。
Yun Wang：撰写——审阅与编辑、概念化。
Ke Xu：概念化。
Zhanchen Dong：概念化。
Shanshan Liu：概念化。
Weitong Lu：概念化。
Wei Cun：概念化。
Hua Cao：概念化。
Yan Jiang：概念化。
Yunfeng Lin：可视化、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念化。