Ru-复合物功能化的真菌粘附型上转换纳米系统，用于近红外光动力抗真菌治疗

《Materials Today Advances》：Ru-complex functionalized fungus-adherent upconversion nanosystem for NIR photodynamic anti-fungal therapy

　　李敏颖|刘泽宇|谢秋林|黄家林|赵明海|郑Judun|廖玉辉
中国南方医科大学皮肤病医院传染病分子诊断与治疗中心，广州，510091

**摘要**
真菌感染对全球健康构成了严重威胁，这一问题因治疗选择有限和药物抗性不断增加而变得更加严峻。基于钌（Ru）复合物的光动力疗法（PDT）提供了一种有前景的替代方案，能够规避药物抗性问题，但其应用受到组织光穿透性差和在病原体内部积累不足的限制。为了解决这些挑战，我们开发了一种基于上转换纳米粒子（UCNPs）的药物装载核壳纳米系统，命名为UCNP@dmSiO2-Ru，该系统将掺杂Yb/Tm的UCNPs与聚吡啶钌（II）光敏剂结合在一起。在980 nm的照射下，UCNPs会发出可见光，通过能量传递激活钌复合物，从而产生局部单线态氧。体外实验表明，这种纳米粒子能够附着在真菌细胞上，并显示出强大的抗真菌活性。在小鼠伤口感染模型中，局部应用后进行近红外光照射显著加速了伤口愈合并减少了真菌负担，且未观察到明显的毒性。这项工作提供了一种能够附着在真菌上的PDT纳米系统，具有近红外激活功能，克服了组织穿透性的限制，为治疗深部真菌感染提供了有希望的策略。

**1. 引言**
真菌感染对全球健康构成了日益严重的威胁，尤其是对免疫系统受损的个体影响更为显著[1]。世界卫生组织最近将念珠菌、曲霉菌和隐球菌列为最危险的真菌病原体之一，估计每年有约160万人死于侵袭性真菌疾病，这一数字与结核病的死亡率相当，且是疟疾死亡人数的三倍以上[2,3]。此外，随着免疫抑制疗法的广泛应用，这些感染的发病率预计还会进一步上升。
在过去几十年中，治疗真菌感染的进展有限，可用的药物也非常有限。而这些有限的选择现在又受到抗菌药物抗性增加的威胁[4]。一个显著的例子是耳念珠菌（C. auris），其具有很高的多重耐药性[5]。自2009年首次被发现以来[6]，C. auris已在世界各地引发了多起医院爆发，凸显了开发新的治疗方法的迫切需求[7]。同时，广泛使用的多烯类和唑类药物的脱靶毒性不仅限制了剂量的增加，还延长了治疗时间[8],[9],[10]。这些相互关联的挑战凸显了一个关键且未满足的临床需求：迫切需要开发新的非抗生素治疗策略以避免药物抗性。
光动力疗法（PDT）作为一种有前景的抗菌策略，其机制与传统药物靶点不同[11,12]。光敏剂（PSs）在光的作用下产生的细胞毒性活性氧（ROS）可对病原体造成广谱、不可逆的氧化损伤，显示出对抗真菌感染的有效性[13,14]。在PSs中，钌（II）聚吡啶复合物因其优异的光物理性质、良好的生物相容性和通过分子设计可调的特性而受到广泛关注[15],[16],[17]。临床阶段的分子TLD1433对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）表现出纳米摩尔级的光动力灭活效果[18]。此外，这类复合物即使在复杂环境中（包括高渗条件、酸性pH值、缺氧以及生物膜内）也能保持抗菌活性[19,20]。然而，由于可见光的组织穿透性浅以及许多PSs与病原体的结合特异性差[23]，它们在深部感染中的应用仍然受到限制，导致在目标微生物细胞内的积累不足。纳米载体工程为同时解决这些挑战提供了有希望的途径。
掺镧的上转换纳米粒子（UCNPs）作为一种有前景的变革性纳米平台，能够解决光穿透深度有限的问题[24]。UCNPs可以吸收深穿透的近红外（NIR）光并将其转化为高能量的可见光，从而有效地激活附着的光敏剂[25]。基于上转换的光动力疗法（UCNP-PDT）系统在构建智能药物递送[26]、集成治疗诊断[27]和多模式治疗剂[28]方面显示出巨大潜力，用于病原体感染和肿瘤治疗。其中，上转换-Ru复合材料通过荧光共振能量传递（FRET）实现了高效的ROS生成[29]。此前，我们报道了一种碳氮化物改性的UCNP-Ru纳米杂化体，在超声-NIR双重刺激下对白色念珠菌（C. albicans）生物膜的杀菌率达到99.9%，这突显了“上转换-Ru”系统在抗真菌治疗中的巨大潜力。
基于以上所有研究，我们开发了一种基于UCNPs的光动力疗法（PDT）纳米系统，用于根除真菌感染。UCNPs首先被树状介孔二氧化硅（dmSiO2）壳层包裹，然后装载聚吡啶钌复合物（Ru）光敏剂，最终形成UCNP@dmSiO2-Ru纳米粒子。以最常见的侵袭性真菌病原体C. albicans作为模型生物，建立了皮肤伤口感染模型。在原位治疗过程中，纳米粒子附着在C. albicans上，通过荧光共振能量传递（FRET）过程在NIR照射下产生的ROS有效杀死了真菌并促进了伤口愈合（图1）。本研究旨在评估UCNP@dmSiO2-Ru对病原真菌的光动力效果，并在相关的临床前感染模型中评估其治疗潜力。这项工作提供了一种可行的非抗生素、无抗性的光动力纳米医学方法，用于真菌感染，为克服传统抗真菌PDT中固有的药物抗性和组织穿透性挑战提供了具有临床前景的策略。

**2. 结果与讨论**
**2.1. UCNP@dmSiO2-Ru的合成与表征**
为了实现NIR光动力抗真菌治疗策略，制备了一种功能性纳米粒子UCNP@dmSiO2-Ru。如图1所示，首先合成上转换纳米粒子（UCNPs），然后将其包裹在树状介孔二氧化硅（dmSiO2）壳层中。随后通过混合过程装载钌（Ru）复合物。通过1H NMR和HRMS对Ru复合物进行了表征（图S1和S2），并使用不同浓度的标准Ru溶液通过UV-Vis吸收光谱评估了其装载效率（图S3）。计算得到的Ru复合物装载效率为6.85%。透射电子显微镜（TEM）图像显示了合成纳米粒子的形态演变（图1A）。包裹有dmSiO2的UCNPs具有不规则的树状表面，并观察到粒子尺寸的增加。纳米粒子核心的TEM图像显示晶格条纹间距为0.3 nm，与六方相NaYF4的（100）面间距一致[30]（图1B）。尽管装载Ru复合物后粒子形态没有显著变化，但元素映射显示粒子上Ru信号增强（图1B）。动态光散射（DLS）测量表明Ru复合物装载后粒子尺寸增加（图1C）。然而，从TEM图像对粒子直径的统计分析显示粒子尺寸约为100 nm（图S4）。同时，表面电位从-16.5 mV显著变化到+10.6 mV（图1C），表明纳米粒子获得了正电荷，这表明Ru复合物在其表面分布。原始UCNPs和UCNP@dmSiO2-Ru的X射线衍射（XRD）图案保持不变（图1D），证实了二氧化硅壳层的修饰和Ru复合物的装载不会影响上转换纳米粒子的晶体结构。综上所述，这些结果证明了UCNP@dmSiO2-Ru的成功合成。

**2.2. ROS生成与体外抗真菌效果**
上转换发光光谱和钌复合物的吸收光谱是决定FRET是否发生的关键参数。如图2A所示，在980 nm激发下，UCNPs在450 nm和475 nm处显示出发射峰，分别对应于Tm3+的1D2 → 3F4和1G4 → 3H6跃迁。这些发射带与Ru复合物在460 nm左右的吸收最大值很好地重叠，后者来源于金属到配体的电荷转移（MLCT）跃迁。这种光谱重叠对于实现有效的FRET至关重要。装载Ru复合物后，发射光谱（以700 nm处的发射峰为基准进行归一化）在460 nm处显著降低（图2B），表明发生了荧光共振能量传递（FRET）。为了进一步验证这一过程，测量了荧光衰减曲线（图2C和S5）。装载Ru复合物后，UCNP的平均荧光寿命从313.35 μs降至272.99 μs。使用公式[31]计算出的FRET效率为12.88%。为了评估该系统在NIR光下产生ROS的能力，使用了1,3-二苯异苯并呋喃（DPBF）作为单线态氧（1O2）的特异性化学探针。如图2D和图S6所示，在980 nm照射下，当DPBF单独存在或与纳米载体共培养时，其UV-Vis吸收几乎不变。然而，在UCNP@dmSiO2-Ru处理组中，DPBF的特征吸收逐渐减弱，证实12.88%的FRET效率足以在近红外激发下生成有效的活性氧。随后，使用C. albicans作为模型评估了该纳米系统的体外抗真菌效果。在NIR光照射（980 nm, 1.0 W/cm2, 30 min）下，100 μg/mL UCNP@dmSiO2-Ru的处理效果达到了94.62%的真菌清除率（图2E和F），且效果具有浓度依赖性（图2G）。相比之下，未经光照处理的对照组未显示出明显的抗真菌活性（图2F和图S7）。此外，使用DCFH-DA荧光探针检测到光照后真菌细胞内的ROS积累显著增加（图2H）。propidium iodide（PI）染色（图2I）视觉上证实，在UCNP@dmSiO2-Ru和光照联合处理后，几乎没有真菌细胞存活，这与观察到的高清除率一致。

**3. 结论**
我们开发了一种基于UCNPs的光动力疗法（PDT）纳米系统，用于根除真菌感染。UCNPs首先被树状介孔二氧化硅（dmSiO2）壳层包裹，然后装载聚吡啶钌复合物（Ru）光敏剂，形成最终的UCNP@dmSiO2-Ru纳米粒子。以最常见的侵袭性真菌病原体C. albicans作为模型生物，建立了皮肤伤口感染模型。在原位治疗过程中，纳米粒子附着在C. albicans上，通过荧光共振能量传递（FRET）过程在NIR照射下产生的ROS有效杀死了真菌并促进了伤口愈合（图1）。本研究旨在评估UCNP@dmSiO2-Ru对病原真菌的光动力效果，并在相关的临床前感染模型中评估其治疗潜力。这项工作提供了一种可行的非抗生素、无抗性的光动力纳米医学方法，用于真菌感染，为克服传统抗真菌PDT中固有的药物抗性和组织穿透性挑战提供了具有临床前景的策略。相比之下，哺乳动物细胞膜的外层主要由电中性的脂质组成，而带负电荷的磷脂主要分布在内膜层[36]。真菌表面的负电荷明显强于哺乳动物细胞，这与我们的实验结果一致，实验结果显示纳米颗粒的吸附显著减少，表面电荷变化很小（图S9）。这一特性为设计针对性的抗真菌剂提供了策略，例如使用带正电荷的聚合物胶束来实现对真菌表面的选择性吸附[37]。此外，扫描电子显微镜（SEM）进一步揭示了不同处理后真菌的形态变化（图3B）。与对照组和仅接受光照的组相比，经过UCNP@dmSiO2-Ru处理并同时接受光照的真菌细胞表面有纳米颗粒附着，并且出现了明显的损伤迹象，包括凹陷和破裂。这些结果证实了UCNP@dmSiO2-Ru的吸附和强效杀菌作用。总体而言，这些发现表明UCNP@dmSiO2-Ru能够附着在白色念珠菌（C. albicans）的表面。在980纳米近红外（NIR）光激发下，该系统通过高效的能量转移（FRET）过程激活Ru复合物，产生大量活性氧（ROS），最终有效杀死了病原真菌。

2.3. 生物安全性评估
生物安全性是考虑临床应用时的一个重要因素。在本研究中，我们使用MTT试验评估了不同浓度纳米颗粒的细胞毒性，并通过新鲜红细胞的溶血试验评估了它们的血液相容性。体外结果显示，在用于抗真菌治疗的浓度下，UCNP@dmSiO2-Ru对哺乳动物细胞系的细胞毒性很小（图4A），并且溶血率均低于1%，表明没有显著的溶血活性（图4B）。为了进一步评估体内毒性，我们将纳米颗粒通过静脉注射给予小鼠。实验期间没有观察到明显的体重变化（图4C），血液生化指标（BUN、CREA、ALB、ALT、AST）显示没有显著异常（图4D）。组织病理学检查也未发现主要器官的急性病理变化（图4E）。这些数据表明，这种纳米颗粒不会引起显著的毒性副作用，提示其具有良好的治疗窗口。

2.4. 体内治疗真菌伤口感染
被细菌和真菌等微生物感染的伤口通常会出现持续的炎症和愈合延迟[38]。在本研究中，我们使用白色念珠菌感染的伤口小鼠模型评估了UCNP@dmSiO2-Ru的抗真菌效果和伤口愈合结果。感染通过局部接种白色念珠菌建立，12小时后开始光动力疗法。第8天收集组织以评估治疗效果（图5A）。到第8天，仅接受光照的对照组、仅接受UCNP@dmSiO2-Ru但不接受光照的组中仍可见较大的结痂（图5B）。相比之下，UCNP@dmSiO2-Ru + 光照组（UCNP@dmSiO2-Ru + L）的伤口闭合最快，第6天的愈合率超过90%，第8天接近完全愈合（图5C）。相比之下，对照组、仅接受光照的组和仅接受纳米颗粒的组（不接受光照）的愈合率分别为72.22%、74.85%和75.36%（图5D）。此外，纳米颗粒的给药没有导致小鼠体重显著变化，表明没有明显的系统毒性（图5E）。纳米颗粒加光照组伤口部位的真菌负荷显著减少（图5F），这与之前的体外抗菌结果一致。总体而言，这些数据证实UCNP@dmSiO2-Ru介导的光动力疗法可以同时消除真菌感染，加速伤口结构修复，并且不会产生显著的系统毒性。

2.5. 通过组织染色评估体内伤口愈合
为了评估开发的UCNP@dmSiO2-Ru在近红外光下促进感染伤口修复的治疗效果，收集了各组伤口的组织切片。治疗后的第8天，分析集中在伤口区域的表皮和真皮层。发现接受光动力疗法（UCNP@dmSiO2-Ru + L）的伤口在组织修复方面具有显著优势：表皮显示出连续、完整且明显增厚的再上皮化结构，而真皮中的炎症细胞浸润显著减少。相比之下，对照组、仅接受光照的组和仅接受纳米颗粒的组表现出表皮结构缺陷、再生延迟，并伴有广泛的持续免疫细胞浸润（图6A）。进一步的Masson三色染色显示，UCNP@dmSiO2-Ru + L组真皮中的胶原沉积面积明显大于其他组，表明细胞外基质合成更为活跃（图6B）。此外，包括伤口全层厚度（图S10）、表皮厚度（图6C）和胶原含量（图6D）在内的定量数据综合分析表明，UCNP@dmSiO2-Ru + L组的皮肤趋向于正常状态。总之，这些组织和定量发现共同表明，基于UCNP@dmSiO2-Ru的光动力疗法可以通过有效清除病原体和调节炎症微环境来显著促进感染伤口的结构修复，是一种治疗真菌感染伤口的有效策略。

3. 结论
侵袭性真菌感染的威胁日益严重，再加上像耳念珠菌（C. auris）这样的多重耐药菌株的出现以及传统抗真菌药物的毒性，凸显了迫切需要通过不同机制发挥作用的新治疗策略[39]。在本研究中，我们设计了一种高效的纳米平台，以解决传统光动力疗法（PDT）针对真菌疾病的两个主要局限性：组织渗透性差和缺乏选择性（这可能导致药物递送不足[40]。开发的近红外激活纳米颗粒（UCNP@dmSiO2-Ru）能够通过高效的能量转移实现原位光子转换，并与电荷介导的吸附协同作用，在深部组织穿透的近红外光激活下在真菌细胞内精确且局部地产生活性氧。通过战略性材料整合，将光的浅层渗透这一物理限制转化为一个可解决的工程问题。通过使用上转换纳米颗粒（UCNPs）作为分子内转换器，激活波长与光敏剂的吸收谱分离，从而将有效治疗深度扩展到传统PDT的限制之外[41]。此外，电荷反转设计赋予了纳米平台内在的结合能力，使其更倾向于结合带负电荷的真菌细胞。这种策略超越了传统PDT依赖的被动扩散，引入了基于静电相互作用的主动结合机制。尽管结果令人鼓舞，但我们的研究仍存在一些局限性，需要进一步研究。首先，虽然伤口模型在局部、可及的感染中展示了有效性，但该平台对真正深层或系统性感染（例如播散性念珠菌病）的表现需要在更具挑战性的模型中进行验证。其次，尽管初步的安全数据令人鼓舞，但长期安全性研究对于临床转化至关重要。未来的工作应调查这种纳米系统的生物分布、代谢和慢性毒性。还需要在动物模型中进行重复剂量毒性研究，以评估慢性效应，如炎症或基因毒性。了解清除途径（肾脏或胆道）将有助于最小化滞留风险。这些研究将有助于更好地进行风险效益分析，并指导更可靠的抗真菌纳米治疗剂的开发。未来的研究可以集中在提高其生物相容性和靶向递送性能上。合成纳米载体常常面临免疫原性和非特异性摄取等挑战。天然存在的细胞外囊泡以其高生物相容性和免疫逃逸能力而闻名，可作为靶向药物递送载体[42,43]。利用细胞外囊泡使纳米颗粒具有仿生特性可能增强纳米系统的隐蔽性和靶向特性。最后，探索该平台对其他关键真菌病原体（如烟曲霉（Aspergillus fumigatus）和新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）以及临床分离出的耐药菌株（如耳念珠菌）的有效性，对于定义其在各种侵袭性真菌疾病中的广谱潜力至关重要。总体而言，这种纳米颗粒为下一代抗菌疗法的发展奠定了有前景且可适应的基础，有望应对多重耐药真菌感染带来的日益严峻的临床挑战。

4. 材料与方法
4.1. 材料
TmCl3·6H2O（≥99.99%）、YbCl3·6H2O（≥99.99%）、YCl3·6H2O（≥99.99%）、1-十八烯（ODE，≥90%）、油酸（OA，≥85%）、氟化钠（≥99.99%）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，≥99%）、正硅酸四乙酯（TEOS，≥99.99%）、水杨酸钠（NaSal，≥99.5%）、1,2-双（三乙氧基硅基）乙烷（BTEE，≥96%）、三乙醇胺（TEA，≥99.5%）和乙醇均购自上海阿拉丁生化科技有限公司。碘化丙啶（PI）、4,6-二氨基-2-苯基吲哚、二甲基（DAPI）、活性氧物种测定试剂盒（DCFH-DA）和MTT细胞增殖及细胞毒性测定试剂盒购自北京贝泰美科技有限公司。RPMI 1640和DPBF（1,3-二苯基异苯并呋喃）购自Thermo Fisher Scientific。Sabouraud葡萄糖肉汤（SDB）培养基购自环凯微生物公司。

4.2. NaYF4: Yb/Tm上转换纳米颗粒（UCNPs）的合成
核心UCNPs采用热分解法制备[14]。简要来说，将YCl3·6H2O（0.78 mmol）、YbCl3·6H2O（0.215 mmol）和TmCl3·6H2O（0.005 mmol）与油酸（OA，31 mmol）和1-十八烯（ODE，47 mmol）混合，并加热至150°C持续40分钟。冷却后，加入含有NaOH（2.5 mmol）和NH4F（4 mmol）的甲醇溶液。在真空条件下去除甲醇后，将溶液加热至290°C并保持90分钟。混合物逐渐冷却至室温，生成的纳米颗粒沉淀出来，用乙醇洗涤，最后分散在环己烷中。

4.3. UCNP@dmSiO2-Ru的构建
首先，使用改进的CTAB模板方法将UCNPs包覆上树枝状介孔二氧化硅（dmSiO2）壳[44]。简要来说，将100 mg CTAB溶解在20 mL去离子水中。在剧烈搅拌下加入含有NaYF4: Yb/Tm UCNPs（2 mL，30 mg）的环己烷溶液，随后加入水（40 mL）、乙醇（6 mL）、NaSal（40 mg）和TEA（50 μL）。然后逐滴加入BTEE（60 μL）和TEOS（40 μL），并搅拌过夜。产物通过离心（12,000×g，10分钟）收集，用含HCl的热乙醇洗涤，最后分散在10 mL乙醇中。接下来，按照先前的方法合成Ru（II）复合物[14]。最后，将Ru（II）复合物通过在乙醇/水（1:10）混合物中搅拌过夜加载到UCNP@dmSiO2载体上。所得UCNP@dmSiO2-Ru纳米颗粒通过离心（12,000×g，10分钟）收集。Ru（II）复合物通过1H NMR和HRMS进行表征。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：14.3（s，1H），9.28（d，1H），9.12（d，1H），8.89（d，2H），8.85（d，2H），8.35（d，1H），8.22（t，2H），8.11（t，2H），8.04（d，2H），7.95-7.83（m，5H），7.67-7.55（m，4H），7.36（t，2H），6.84（t，1H）。HRMS（ESI）显示C43H36N8O3Ru [M-2ClO4-H]1+的分子量为769.1270。4.5. 活性氧（ROS）生成的检测
使用DPBF作为化学探针来监测单线态氧（1O2）的生成。采用980 nm近红外激光（1 W/cm2）来检测UCNP@mSiO2-Ru的单线态氧生成能力。实验中，将UCNP@dmSiO2-Ru（0.4 mg）溶解在2 mL的DPBF溶液（50 mM）中，并在不同时间点（0、5、10、15、20、25和30分钟）记录其UV-Vis吸收光谱。

4.6. FRET效率的计算
使用Edinburgh FLS1000荧光光谱仪测量样品的荧光寿命。通过拟合衰减曲线得到平均荧光寿命，然后利用FRET效率公式[31]计算FRET效率。
公式（1）：y = y0 + A1e^(-xt1) + A2e^(-xt2)
公式（2）：τ = (A1 * t1^2 + A2 * t2) / (A1 * t1 + A2 * t2)
公式（3）：E = 1 - τDA / τD
其中，x表示时间；y表示在时间x处测得的荧光强度；y0表示基线偏移；t1、t2表示两个不同的衰减时间常数；A1、A2表示这两个分量在x=0时的幅度；E表示FRET效率；τDA表示存在受体的情况下供体的荧光寿命；τD表示没有受体的情况下供体的荧光寿命。

4.7. 体外抗真菌实验
将C. albicans（SC5314菌株）在Sabouraud葡萄糖培养基中培养过夜。将真菌悬液调整至2 × 10^6 CFU/mL，与UCNP@dmSiO2-Ru（0、25、50或100 μg/mL）或PBS（对照组）共培养4小时，随后用980 nm近红外激光（1.0 W/cm2）照射30分钟。通过计数琼脂平板上的菌落形成单位（CFU）来确定真菌的存活率。

4.8. 纳米粒子粘附和真菌形态观察
将细胞爬片放入24孔板中，每孔加入500 μL的C. albicans悬液（2 × 10^4 CFU/mL）。在30°C下，真菌在RPMI 1640/SDB培养基中培养12小时。之后，将培养基更换为含有钌复合物或纳米粒子的新鲜培养基。培养4小时后进行DAPI染色，清洗真菌细胞，并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行观察。对于超微结构检查，用2.5%的戊二醛固定C. albicans细胞，通过梯度乙醇系列脱水，然后用扫描电子显微镜（SEM，Zeiss Sigma 300）成像。

4.9. 带电测定实验
将C. albicans在摇床中培养过夜，然后用PBS清洗，制备成浓度为5 × 10^7 CFU/mL的悬液，取100 μL用于实验。先用50 μg/mL的PEI处理30分钟，随后将真菌与100 μg/mL的UCNP@dmSiO2-Ru共培养5分钟，再清洗并用PBS离心。观察真菌的颜色变化，并测量其ζ电位。此外，将10^6个HUVEC细胞与100 μg/mL的UCNP@dmSiO2-Ru共培养5分钟，清洗并用PBS离心，观察细胞沉淀物的颜色变化，并测量其ζ电位。

4.10. 生物安全性评估
为了评估细胞毒性，用不同浓度的UCNP@CR（0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL）处理HUVECs。共培养24小时后，使用MTT法测量细胞存活率。还进行了溶血实验，使用不同浓度的UCNP@CR（0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL）。将纳米粒子与红细胞共培养24小时，然后离心。拍摄上清液并在570 nm处测量其吸光度。为了评估系统毒性，将纳米粒子悬浮液（100 μL，1 mg/mL）静脉注射到小鼠体内。每天监测体重。14天后，收集血清和主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行血液生化分析和组织学检查。

4.11. 体内伤口愈合模型
雄性BALB/c小鼠（6-8周龄）来自广州Regal生物科技有限公司（中国广州）。所有动物实验均经过广东省Laidi生物医学研究所机构动物护理和伦理委员会的审查和批准（批准编号LDSW2025030-1）。小鼠在特定无病原体（SPF）条件下饲养，温度为22 ± 2°C，湿度为50 ± 10%，光照周期为12:12小时。它们被放置在带有自动灭菌玉米芯垫料的单独通风笼中，并提供无菌水。实验前小鼠适应7天。在小鼠的背部皮肤上建立C. albicans伤口感染模型。第-1天，对小鼠进行麻醉，剃除背部毛发，并使用皮肤活检钳制造一个6毫米的全层伤口。每个伤口接种10 μL的C. albicans悬液（2 × 10^8 CFU/mL）。12小时后（记为第0天），24只小鼠随机分为四组：PBS + 暗光、PBS + 光照、UCNP@dmSiO2-Ru + 暗光和UCNP@dmSiO2-Ru + 光照。伤口分别用UCNP@dmSiO2-Ru（200 μg/mL，20 μL）或PBS（对照组）处理，光照组接受980 nm（1 W/cm2）的NIR光照30分钟。每天拍摄伤口区域的照片并测量其大小。在指定时间点对小鼠实施安乐死，并收集伤口组织进行真菌负荷定量（通过CFU计数）和组织学分析（Hematoxylin-Eosin (H&E)染色，Masson染色）。所有体内实验均重复进行两次，每组3只小鼠（每组总共6只，来自两个独立实验）。如果小鼠在接种后12小时内没有可见感染（伤口区域无红斑或渗出物），或在终点评估前出现严重疾病（例如体重下降超过20%、嗜睡），或意外死亡，则将其排除。在实验中，没有小鼠符合这些标准，因此所有小鼠均被纳入最终分析。在分组、处理和结果评估过程中使用了盲法。

4.12. 统计分析
数据以平均值±标准差（SD）表示。组间差异通过配对学生的t检验、单因素方差分析（ANOVA）以及Tukey事后检验进行分析。p值小于0.05被认为具有统计学意义。鉴于体内研究的探索性质和有限的样本量（每个实验n = 3），统计功效可能不足。尽管如此，观察到的效应大小在两个独立实验中是显著且可重复的，从而证实了生物学发现的可靠性。

CRedI作者贡献声明
李敏颖：概念化、数据管理、正式分析、验证、初稿撰写、审稿与编辑。
刘泽宇：概念化、资金获取、项目管理、验证、初稿撰写、审稿与编辑。
谢秋林：正式分析。
黄家林：正式分析。
赵明海：数据管理。
郑俊东：资金获取、项目管理、监督、审稿与编辑。
廖玉辉：资金获取、项目管理、监督。