表面活化的镁基无细胞鱼鳞支架通过调控骨微环境来促进骨骼再生

《Materials Today Advances》：Magnesium surface-activated acellular fish scale scaffold for the enhancement of bone regeneration by regulating osteo-microenvironment

　　石龙苏|金戊白|山高|茹茗周|芳周
北京大学第三医院骨科，中国北京市海淀区北花园路49号，100191

摘要
支架是骨组织工程的核心，因此已经开发出了多种类型的支架。受鱼鳞的启发，我们制备了一种基于鱼鳞的骨组织工程支架，并通过聚多巴胺表面修饰在无细胞的鱼鳞表面上均匀固定镁离子（Mg2?），从而开发出一种多功能基于鱼鳞的支架（称为Mg/PAFS）。Mg/PAFS具有优异的机械性能，并能持续释放生物活性的Mg2?。实验结果表明，该支架不仅具有良好的生物相容性，还能促进细胞增殖和黏附。Mg/PAFS在体外实验中表现出良好的自由基清除活性、免疫调节活性、血管生成能力和成骨能力。进一步地，我们将Mg/PAFS植入小鼠颅骨缺损部位，结果证实Mg/PAFS能够在体内创建一个抗炎、促血管生成和促成骨的局部微环境，从而促进骨骼再生。此外，RNA测序结果为Mg/PAFS的成骨机制提供了线索。总体而言，我们开发的多功能支架为骨组织工程提供了新的选择，并有助于生物资源的可持续利用。

1. 引言
近年来，骨组织工程逐渐成为修复骨缺损的潜在策略。在骨组织工程的多种方法中，支架是实现良好骨骼再生的关键[1]。因此，支架已成为研究的热点，已开发出多种类型的支架[[1]，[2]，[3]]。在众多支架中，生物衍生支架因具有良好的生物相容性和生物活性而具有多重优势[2,4]。我们关注了天然鱼鳞。鱼鳞在食品工业中属于生物废弃物，受到的关注较少。然而研究表明，鱼鳞主要由类似于骨组织的细胞外基质组成，其主要成分包括I型胶原和羟基磷灰石[5]。基于其优异的机械性能、良好的细胞相容性和成骨能力，无细胞鱼鳞（AFS）已被用于修复骨缺损[[6]，[7]，[8]]。AFS表面具有天然的微纹理结构，为细胞附着、增殖和迁移提供了良好的表面形态[[9]，[10]，[11]]，使其具有作为三维支架的潜力。更为令人满意的是，其优异的机械性能主要归功于其独特的胶原纤维层排列，以及嵌入胶原纤维层中的针状羟基磷灰石晶体进一步提升了其机械性能[12,13]。基于上述优势，AFS是骨组织工程支架的理想候选材料。

除了促进骨形成和提供机械支撑外，理想的支架还应能够改善骨微环境以修复骨缺损[14]。首先，骨缺损部位通常存在高水平的活性氧（ROS）和炎症失调状态，这严重限制了骨骼的再生[15,16]。其次，良好的血管生成对于成骨过程至关重要[17]。血管为细胞提供氧气和营养。没有血管网络，新骨的形成也会受到阻碍。因此，为了构建一个有利于骨骼形成的微环境，支架还需要能够降低ROS水平、具有抗炎作用并促进血管生成。

镁（Mg）因其丰富的生物功能而受到广泛关注，包括调节酶活性、维持神经肌肉功能和心血管健康以及参与骨骼形成[18]。研究表明，金属镁和镁离子（Mg2?）可以促进骨骼再生[[19]，[20]，[21]]。除了直接刺激骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化并增强骨整合[19,22]外，镁还通过调节巨噬细胞的极化产生促骨免疫微环境[23]，并促进血管生成[[24]，[25]，[26]]。由此可见，金属镁和Mg2?是改善骨组织工程支架的潜在生物材料。然而，也应注意到金属镁的固有缺陷，如降解速度过快以及在体内产生氢气的化学反应可能导致组织坏死[27]。因此，将Mg2?引入AFS表面是增强其生物活性的有效策略。然而，AFS表面具有复杂的三维拓扑结构，一些先前的表面修饰方法难以在AFS表面均匀固定Mg2?[28]。受贻贝的启发，聚多巴胺（PDA）可以作为一种解决方案。基于氧化自聚合反应，PDA可以在各种复杂表面上形成功能性涂层[29]。PDA涂层不仅具有良好的生物相容性，还含有许多可以通过-OH和-OH基团螯合金属离子（如Mg2?）的功能基团[29,30]。因此，可以通过PDA涂层在AFS表面均匀固定Mg2?。更令人满意的是，PDA还具有高效的氧化还原能力和抗炎活性，可以降低ROS水平，进一步改善促骨免疫微环境[[31]，[32]，[33]]。

在此，我们制备了一种基于鱼鳞的骨组织工程支架，并通过PDA表面修饰在AFS表面均匀固定Mg2?，从而开发出一种多功能基于鱼鳞的支架。这种支架在有效促进骨形成的同时，还能通过清除ROS、抗炎和促进血管生成来进一步促进骨骼再生，构建一个有利于骨骼形成的微环境（图1）。为了验证表面修饰AFS的应用潜力，我们通过一系列实验研究了其特性、细胞相容性、ROS清除活性、巨噬细胞极化、血管生成和成骨能力。

2. 材料与方法
2.1. AFS的制备和表面修饰
根据我们之前的方案[34]制备AFS。从两条新鲜草鱼中获取天然鱼鳞（NFS）后，将鱼鳞依次浸入不同的溶液中：含0.1%乙二胺四乙酸的10 mM Tris-盐酸盐缓冲液（4°C，24小时）、1% TritonX-100溶液（4°C，4天）和混合核酸酶溶液（500 U/mL DNase I和1 mg/mL RNase A，37°C，24小时），最终得到AFS。随后，将AFS在碱性多巴胺溶液（2 mg/ml，pH 8.5）中功能化并继续反应24小时，得到PDA表面修饰的AFS（PAFS）。另外，将一组PAFS浸入MgCl?溶液（50 mg/ml，pH 8.5）中反应24小时，得到镁表面活化的AFS（Mg/PAFS）。

2.2. AFS的去细胞化效果
我们对NFS和AFS进行脱钙处理，并将其包埋在石蜡中用于切片，然后进行苏木精和伊红（H&E）染色及4’，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色以验证细胞核。使用DNA提取试剂盒定量残留DNA（n=5）。此外，应用傅里叶变换红外光谱（FTIR）半定量测定支架中的胶原和羟基磷灰石含量。根据文献中的方法[[35]，[36]，[37]]，首先获取NFS和AFS的红外光谱，然后分别积分酰胺I峰（1720-1590 cm?1）和磷酸盐峰（1200-900 cm?1）的峰面积，以比较去细胞化前后胶原和羟基磷灰石含量的变化。我们还使用FTIR检测AFS、PAFS和Mg/PAFS的光谱，以确认表面修饰的成功。

2.3. 支架的表征
将支架冻干，并使用扫描电子显微镜（SEM，日本JEOL）观察表面结构。同时，通过能量分散X射线光谱（EDS）评估碳（C）、钙（Ca）和镁（Mg）的分布和含量。为了测试支架的亲水性，我们使用接触角仪（Dingsheng，中国）测量水的接触角（n=3）。关于机械性能，我们首先使用原子力显微镜（AFM，德国Bruker）检测支架。接下来，收集力-位移曲线，并使用Nanoscope Analysis软件进行分析，以获得每个支架的杨氏模量（n=3）。我们还使用公式[33,38]测试支架的降解行为：降解率 = (M?-MR)/M? × 100%，其中M?为支架的初始重量，MR为设定时间点（2、4、6和8周）的剩余重量。

2.4. Mg2?的释放
将Mg/PAFS、PAFS和AFS浸入PBS溶液（不含Mg2?，10 mL，37°C）中13天（n=3）。在第1、4、7、10和13天收集溶液，并更换新鲜的PBS，然后使用电感耦合等离子体-光发射光谱仪（ICP-OES，PerkinElmer，美国）测量Mg2?浓度，并计算累积释放曲线[23,25]。

2.5. 体外实验
2.5.1. 细胞活力和增殖
在支架上接种2×10?/well的BMSCs（n=3），然后使用Calcein-AM/碘化丙啶（PI）试剂盒（Servicebio，中国）在第1和第3天检测BMSCs的细胞活力。在第1、4和7天使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8，Fude Biological，中国）检测细胞增殖。

2.5.2. 细胞黏附和形态
同样，在用固化环（Engineering For Life，中国）固定的不同支架上接种2×10?/well的BMSCs（n=3）。在第1和第3天，清洗并固定样本。然后使用卵白素标记细胞骨架。使用荧光显微镜进行观察和拍照。固定和干燥后，还使用SEM观察细胞-支架复合物。

2.5.3. ROS清除活性
从以下几个方面评估ROS清除活性：
1,1-二苯基-2-芘基肼（DPPH）清除能力：使用DPPH清除效率试剂盒（Yuanye，中国）检测不同支架的DPPH清除能力（n=3）。
细胞内ROS检测：将2×10?/well的BMSCs培养24小时（n=3），然后加入含200 μM叔丁基过氧化物（TBHP）的新鲜培养基，并继续培养2小时。随后使用ROS检测试剂盒（2′,7′-二氯荧光素二醋酸酯，DCFH-DA）进行检测，荧光信号由荧光显微镜捕获并通过SpectraMax iD5量化。
氧化应激下的细胞保护效应：继续培养24小时后，使用Calcein-AM/PI试剂盒和CCK-8检测细胞活力。

2.5.4. 巨噬细胞的极化
准备支架与RAW264.7细胞（5×103 cells/well，n=3）共培养。在第3天，使用ELISA试剂盒（SEKM-0034和SEKM-0010，Solarbio，中国）检测细胞上清液中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-10（IL-10）的含量。然后使用免疫荧光（IF）染色和定量实时PCR（qRT-PCR）评估巨噬细胞标记物（CD86和CD206）的表达。固定后，细胞与初级抗体（CD86，1:200，Proteintech，中国）和CD206，1:200，Proteintech，中国）孵育。第二天去除未结合的初级抗体，然后用相应的二级抗体染色，使用荧光显微镜拍照。此外，使用SteadyPure Universal RNA Extraction试剂盒（Accurate Biotechnology（湖南）提取总RNA，并使用Evo M-MLV RT Premix试剂盒（Accurate Biotechnology（湖南）反转录为cDNA，然后使用QuantStudio 3（Applied Biosystems，美国）进行检测。引物序列见表S1。

2.5.5. 血管生成能力
通过Transwell试验、管状形成试验和qRT-PCR评估体外血管生成能力：
Transwell试验：将2×10?/well的human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）悬浮在无血清培养基中，并加入24孔Transwell板的上室（n=3）。在下室加入含有10%血清的培养基。24小时后，擦去未迁移的细胞，并用结晶紫溶液染色迁移的细胞。最终拍照并计数迁移的细胞。
管状形成试验：首先在24孔Transwell板的下室涂覆Matrigel（BD Bioscience，美国），然后在下室接种8×10?/well的HUVECs，在上室加入不同的支架（n=3）。孵育8小时后，使用ImageJ软件测量管状形成相关参数（管数和连接数）。
qRT-PCR：通过qRT-PCR评估与血管生成相关的基因（VEGFA和HIF-1α）的表达。

2.5.6. 成骨能力
将BMSCs与不同的支架在成骨培养基中共培养（1×10? cells/well，n=3）。分别在第7天和第14天使用碱性磷酸酶（ALP）染色试剂盒和阿利扎林红（ARS）染色试剂盒（Solarbio，中国）评估成骨潜力。在培养14天后，使用IF染色和qRT-PCR检测成骨相关标记物（RUNX2和OPN以及COL-1α）的表达。

2.5.7.RNA测序
在Mg/PAFS组和对照组进行14天的成骨诱导后，使用Trizol试剂裂解BMSCs，然后送至Majorbio创建6组样品文库并进行测序（n = 3）。数据获取后，进行了差异表达分析。接下来进行了基因本体论（GO）术语富集分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析和基因集富集分析（GSEA），以探索可能的成骨通路。所有分析均使用Majorbio提供的在线平台2.6进行。

2.6. 体内实验
2.6.1. 动物实验
根据体外实验结果以及实验动物的伦理和福利要求，本研究仅设置了三个组：对照组、AFS组和Mg/PAFS组。实验方案获得了北京大学健康科学中心动物护理和使用委员会的批准（批准编号：DLASBD0205）。参考相关文献[6,39]，我们使用小鼠建立了颅骨缺损模型。选择符合纳入标准（健康、雄性、8周龄、体重：24±2克）的C57BL/6J小鼠。通过随机数表将小鼠随机分为三组。小鼠通过腹腔注射戊巴比妥麻醉后，在颅骨两侧各建立了一个全层缺损（直径：3毫米）。分别将AFS和Mg/PAFS移植到缺损部位，对照组则注射PBS溶液。手术完成后，将小鼠放入保温毯中进行恢复。恢复后，将小鼠转移到特定的无病原体屏障环境中继续饲养。不限制小鼠的活动和饮食，并定期监测其状态。如果小鼠出现伤口、颅内感染或精神异常，则对其进行安乐死。通过腹腔注射过量麻醉剂实施安乐死。手术后的第2周和第8周，对小鼠进行安乐死以获取颅骨、心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏，并用4%甲醛固定。

2.6.2. 微CT评估
所有颅骨均通过德国Bruker公司的微CT扫描，并使用软件进行三维可视化处理。然后计算相对骨体积与总体积（BV/TV）、小梁数（Tb.N）、小梁厚度（Tb.Th）和小梁间距（Tb.Sp）。

2.6.3. 组织学评估
所有颅骨先用乙二胺四乙酸脱钙，脱水后浸入石蜡中切片。术后第8周收集的颅骨用H&E染色和Masson三色染色法评估新骨形成情况，并进行RUNX2、OCN、CD31和EMCN的免疫组化染色，以进一步评估体内的成骨和血管生成情况。此外，术后第2周收集的颅骨还通过CD86和CD206的免疫组化染色法评估体内的免疫调节作用。最后，还对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行H&E染色，以评估支架的生物安全性。

2.7. 统计分析
数据以平均值±标准差的形式报告。两组间比较使用Student's t检验，多组间比较使用单因素方差分析（ANOVA）。所有分析均使用GraphPad Prism软件完成。p值<0.05被认为是统计学上显著的。（ns：无显著差异，?：p<0.05，??：p<0.01，???：p<0.001，????：p<0.0001）

3. 结果与讨论
3.1. 支架的脱细胞效果和特性
收获鱼鳞后，我们根据之前发表的方案[34]完成了脱细胞处理。如图2A所示，组织学染色表明AFS中的细胞已被成功去除。进一步的DNA含量定量分析显示，与NFS相比，AFS中的DNA含量显著减少，符合成功脱细胞的标准（<50 ng/mg）[40]。脱细胞过程不可避免地会导致鱼鳞成分的减少。我们使用FTIR分析了胶原蛋白和羟基磷灰石的含量。如图2B所示，脱细胞后胶原蛋白和羟基磷灰石的含量分别减少了24.59%和27.14%。我们的脱细胞方案很好地保留了细胞外基质成分[34]。此外，我们还使用FTIR验证了表面改性的成功（图S1）。我们发现PAFS和Mg/PAFS在1510 cm?1和1620 cm?1处出现了新的特征峰，这主要是由于PDA中苯环骨架的伸缩振动和吲哚环的C=C伸缩振动所致。这证明了PDA的成功涂层。Mg/PAFS在500 cm?1处有一个更明显的特征峰，主要是由于Mg-O键的振动，表明Mg2+的成功负载。

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图2. 支架的脱细胞效果和特性。A. H&E和DAPI染色及DNA含量。B. 胶原蛋白和羟基磷灰石含量。C. 支架的宏观视图、表面微观结构及C、Ca和Mg的元素分布图。D-G. 支架的水接触角、杨氏模量、降解率和Mg2+累积释放曲线。
从宏观上看，AFS是无色透明的，而PAFS和Mg/PAFS呈深棕色（图2C）。SEM显示三种类型的支架表面都具有自然的微观纹理结构，表现出特征性的三维结构（图2C）。这种特征性的纹理结构可以激活多种反应，如细胞迁移、黏附和分化[41]。这也是三维组织工程研究中的热点话题。可以看出Mg/PAFS无需特殊处理即可自然具有特征性的三维结构[42]，具有成为三维支架的潜力。EDS元素分布图显示C、Ca和Mg元素分布均匀，Mg/PAFS中的Mg元素含量显著高于AFS和PAFS（图2C）。定量分析显示，Mg/PAFS中的Mg元素含量约为AFS和PAFS的10倍（图S2）。PDA表面改性后，PAFS能有效负载Mg2+并使其在AFS表面均匀固定。PDA的表面改性有效解决了AFS复杂表面结构上难以均匀固定Mg2+的问题。这是因为PDA富含多种功能基团，赋予了其特殊的黏度[29,30]。支架的亲水性对细胞黏附具有重要影响[28]。PDA改性后，PAFS和Mg/PAFS的水接触角显著降低，表明其亲水性显著提高（图2D），这有助于细胞黏附和定植。我们的结果与Wei等人的研究[25]相似，他们使用PDA改善了聚醚醚酮材料的表面亲水性。我们使用AFM获得力-位移曲线并检测机械性能（图S3），结果发现三种类型的支架杨氏模量相似，约为6 GPA（AFS：6.06±1.17 GPA；PAFS：6.27±1.90 GPA；Mg/PAFS：6.17±1.65 GPA）（图2E）。这一杨氏模量接近皮质骨和无细胞骨基质的模量[43]。作为骨组织工程支架，其优异的机械性能使其具有更好的应用潜力。Mg/PAFS无需添加其他复杂成分来增强机械性能[44]，仅凭自身成分和独特的“Bouligand”结构就具有优异的机械性能[12,13]，能够为骨缺损部位提供良好的早期机械支撑。此外，鱼鳞作为生物废弃物来源广泛，可作为无细胞骨基质的良好替代品。关于降解率（图2F），在2周、4周和6周时没有显著差异。到第8周时，PAFS和Mg/PAFS的降解率低于AFS。这种差异可能是由于PDA的表面改性所致。作为无细胞基质材料，Mg/PAFS具有生物降解的特性，既避免了水凝胶快速降解的缺点[45]，又解决了金属支架难以降解的问题[46]。使用PDA成功且均匀地在AFS表面固定Mg2+后，我们评估了Mg2+的释放效果。图2G和图S4显示AFS和PAFS几乎不释放Mg2+，而Mg/PAFS可以缓慢且持续地释放Mg2+超过14天，表现出良好的缓释效果。

3.2. 支架的生物相容性
良好的生物相容性是支架应用的前提。我们从细胞活力、细胞增殖和细胞黏附三个方面评估了支架的生物相容性。图3A显示支架上可见少量死亡细胞。定量分析表明，所有支架的细胞存活率均超过95%，且相似（图3B）。CCK-8显示培养1天时两组无差异，但到第4天和第7天时，Mg/PAFS上的细胞增殖明显更好，数量高于PAFS和AFS（图3C），说明Mg2+的释放促进了细胞增殖[47]。培养1天和3天的细胞经细胞骨架染色后在荧光显微镜下观察（图3D）。发现AFS上的细胞排列无序，而PAFS和Mg/PAFS上的细胞紧密黏附在支架表面的三维结构上，排列有序。这表明PAFS和Mg/PAFS具有更好的细胞黏附能力。SEM显示结果也一致（图3E）。PAFS和Mg/PAFS上的细胞更紧密地黏附在支架上，沿着支架表面的起伏和沟槽排列，并伸出更多的伪足。支架良好的细胞黏附能力有利于BMSC在骨缺损修复过程中的定植和随后的增殖与分化[48]。

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图3. A-B. 与支架共培养的BMSCs的活/死细胞染色图像及细胞活力。C. 通过CCK-8评估的细胞增殖。D. 在支架上培养的BMSCs的细胞骨架染色图像。比例尺=200 μm。E. 在支架上培养的BMSCs的SEM图像。红色箭头表示黏附的细胞。比例尺=50 μm。（有关此图例中颜色的解释，请参阅文章的网络版本。）

3.3. 支架的ROS清除活性
高水平的ROS对骨缺损的治疗不利[15]。ROS的过度产生和积累会导致氧化应激，损害细胞结构和功能[49]。PDA富含多种还原基团，具有良好的氧化还原能力。多种用PDA改性的骨组织工程支架也表现出良好的ROS清除活性[32,50,51]。因此，我们首先检测了DPPH的清除效率（图4A）。结果显示，PAFS和Mg/PAFS的DPPH清除效率与维生素C相似，可达到80%以上，显著高于AFS。Mg/PAFS的优异抗氧化性能保护细胞免受高水平的ROS损伤。接下来，我们直接使用DCFH-DA探针定量检测细胞内的ROS产生（图4B和C）。健康环境下的细胞ROS水平较低。TBHP诱导后，细胞内产生大量ROS。加入PAFS和Mg/PAFS后，ROS可以被有效清除，其水平显著降低。定量分析显示，PAFS和Mg/PAFS组的ROS水平与未加TBHP的对照组相似。进一步地，我们评估了氧化应激下的细胞活力。TBHP诱导后，对照组和AFS组有许多死亡细胞，而PAFS和Mg/PAFS组几乎没有死亡细胞（图4D）。CCK-8结果也显示PAFS和Mg/PAFS组的细胞活力最高（图4E）。这些发现表明Mg/PAFS通过清除ROS有效保护细胞免受氧化应激损伤。可以看出Mg/PAFS可以清除ROS，改善骨缺损部位的骨微环境，有利于骨再生。

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图4. A. 支架的DPPH清除效率。使用维生素C（40 μg/mL）作为阳性对照。B-C. 不同条件下BMSCs的细胞内ROS水平。D. 不同条件下BMSCs的活/死细胞染色图像。E. 不同条件下通过CCK-8评估的细胞活力。比例尺=200 μm。

3.4. 支架的免疫调节活性
当发生骨缺损时，免疫系统反应最快，巨噬细胞也参与骨组织再生[52]。巨噬细胞有两种不同的极化表型。M1表型可引起慢性炎症，而M2表型则能抑制炎症并促进组织修复[53]。这两种极化状态是动态调节的，并且能协同促进骨骼再生。然而，研究表明，在骨缺损部位炎症调节是不平衡的，M1巨噬细胞长期占主导地位，引发高水平的不良炎症，这严重阻碍了骨组织的修复[54]。因此，理想的支架应能够促使巨噬细胞更多地向M2极化，减少M1极化，以改善骨免疫调节微环境。我们使用RAW264.7细胞来探索支架的免疫调节活性。首先，我们检测了共培养后细胞上清液中的促炎细胞因子（TNF-α）和抗炎细胞因子（IL-10）（图5A）。ELISA结果显示，与其它组相比，用Mg/PAFS处理的细胞分泌的TNF-α减少，而IL-10的分泌增加。进一步地，我们检测了CD86和CD206的表达。qRT-PCR显示，与AFS和PAFS组相比，Mg/PAFS组中CD86的mRNA表达水平显著降低，而CD206的表达显著增加（图5B）。类似地，免疫荧光染色也显示了相同的结果。从荧光图像（图5C）和定量分析结果（图S5A）来看，Mg/PAFS组的CD86蛋白表达最低，CD206蛋白表达最高。这表明Mg/PAFS具有很好的抗炎效果。一些研究表明，Mg2+可以调节巨噬细胞的顺序激活，从而产生促进骨形成的免疫微环境[23,55]。PDA不仅可以作为在表面固定Mg2+的介质，还可以与Mg2+协同作用，发挥抗炎作用，进一步改善免疫微环境[56]。因此，Mg/PAFS的组合可以发挥良好的免疫调节活性，从而产生促进骨骼再生的微环境。

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图5. 体外免疫调节活性和血管生成能力。A. 细胞上清液中TNF-α和IL-10的含量。B-C. CD86和CD206的表达水平及免疫荧光染色图像。刻度条=100 μm。D-F. 使用Transwell测定和管状结构形成实验来检测支架对HUVECs迁移和血管生成能力的影响。刻度条=200 μm。G. HUVECs中VEGFA和HIF-1α的表达水平。

3.5. 支架的血管生成能力
在骨骼再生过程中，新血管的形成不仅为细胞代谢提供了所需的氧气和营养物质，还提供了大量的成骨前体细胞以及钙和磷离子，这些都是骨形成过程中的关键成分，这一生理过程被称为骨形成-血管生成耦合[57]。HUVECs的迁移是血管形成的重要过程。我们首先使用Transwell测定来评估HUVECs的迁移情况。结果显示，对照组、AFS组和PAFS组的迁移HUVECs数量相似，但Mg/PAFS组的迁移细胞数量更多（图5D和E）。Mg/PAFS释放的Mg2+可以显著增强HUVECs的迁移，有利于血管生成。在管状结构形成实验中，Mg/PAFS组的HUVECs在8小时内可以形成大量的明显管状结构，而其他组仅形成了一些壁不连续的分支结构（图5D）。定量分析显示，Mg/PAFS组的管状结构和连接点数量显著多于其他三组（图5F）。VEGFA和HIF-1α是血管生成过程中的重要细胞因子[58]。多项研究发现Mg2+可以促进VEGFA和HIF-1α的表达，从而促进血管生成[59],[60],[61]。我们的qRT-PCR结果显示，对照组、AFS组和PAFS组的VEGFA和HIF-1α的mRNA表达水平相似，但Mg/PAFS组的表达水平显著更高（图5G）。这些结果与其他研究一致[59],[60],[61]。从上述结果来看，Mg/PAFS具有良好的血管生成能力，可以显著促进体外血管生成，进一步改善骨微环境，促进骨骼再生。

3.6. 体外骨形成能力
当然，支架的骨形成能力是其关键。多项研究表明AFS具有良好的骨形成能力[6],[7],[8]。PDA[56]和Mg2+[19,20]也被证实可以诱导BMSCs的骨向分化。因此，Mg/PAFS理论上也应具有良好的骨形成能力。在我们的研究中，我们通过检测ALP活性、钙结节沉积以及RUNX2、OPN和COL-1α的表达来比较它们的骨向分化能力。首先，分别进行了ALP染色和ARS染色，以评估早期和晚期的骨形成指标（图6A）。我们发现，AFS组的ALP活性和钙结节沉积量高于对照组和AFS组。由于Mg2+具有刺激骨向分化的能力[19,20]，Mg/PAFS组具有最高的ALP活性和最多的钙沉积。进一步的定量分析也显示了类似的结果（图S5B）。接下来，免疫荧光染色图像（图6B和C）和定量分析（图S5C）表明，Mg/PAFS组的RUNX2、OPN和COL-1α的蛋白质荧光密度最高，表明其蛋白质表达相对最高。RT-qPCR也显示上述标志物在Mg/PAFS组的表达水平最高（图6D）。因此，综上所述，Mg/PAFS具有优异的骨形成能力。

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图6. 体外骨形成能力。A. ALP和ARS染色图像。刻度条=200 μm。B-C. RUNX2、OPN和COL-1α的免疫荧光染色图像。刻度条=100 μm。D. RUNX2、OPN和COL-1α的表达水平。

3.7. RNA测序
为了初步探索Mg/PAFS的骨形成机制，我们依次进行了差异表达分析、GO富集分析、KEGG富集分析和GSEA分析，以发现潜在的信号通路。结果显示两组之间存在巨大差异，有1015个上调基因和330个下调基因（图7A）。GO富集分析表明，这些上调基因在细胞外基质调节、细胞周期和细胞发育相关功能中显著富集（图7B）。随后的KEGG富集分析显示，Mg/PAFS组在ECM-受体相互作用、细胞周期、PI3K-Akt信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和MAPK信号通路等通路中表现出更高的富集程度（图7C）。通过GSEA分析也发现，与ECM-受体相互作用和PI3K-Akt信号通路相关的基因在Mg/PAFS组中显著富集（图7D）。ECM-受体相互作用是细胞与微环境之间交流的核心机制，通过调节粘附、迁移、增殖和信号转导等过程影响生理活动[62]。ECM-受体相互作用在骨形成-血管生成耦合中起着重要作用。在骨形成过程中，储存在细胞外基质中的信号分子被释放出来，与靶细胞上的整合素受体相互作用，激活细胞内信号通路，促进骨形成和血管生成[63]。整合素可以感知细胞外基质的机械刺激和物理性质，调节细胞活动，并参与细胞间交流。PI3K-Akt信号通路是一个经典的信号通路，参与多种生理过程，它可以通过多个层面调节成骨细胞的增殖和分化，以及骨代谢平衡，并通过调节cyclins促进成骨前体细胞的增殖，还可以激活与骨形成相关的标志物（如RUNX2）和Wnt/β-catenin信号通路，从而促进骨形成[64],[65],[66]。研究表明，Mg2+可以通过PI3K-Akt和Wnt信号通路促进骨形成[27]。RNA测序结果为Mg/PAFS的骨形成机制提供了线索。下一步是设计一些分子生物学实验进行深入研究。

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图7. RNA测序。A. Mg/PAFS组与对照组的差异表达分析。B-C. Mg/PAFS组与对照组相比TOP 20个上调的GO术语和KEGG通路。D. ECM-受体相互作用和PI3K-Akt信号通路的GSEA分析。

3.8. 体内骨再生
骨缺损修复是一个非常复杂的过程，需要免疫调节、血管生成和骨形成等多种过程的协同作用。Mg/PAFS在体外实验中表现出良好的ROS清除活性、免疫调节活性、血管生成能力和骨形成能力，可以形成抗炎、促血管生成和促骨形成的局部微环境。我们进一步评估了Mg/PAFS在体内的骨缺损修复能力。因此，我们分别在术后2周和8周评估了其免疫调节、骨形成和血管生成情况（图8A）。

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图8. 体内骨再生。A. 动物实验示意图。B. 颅骨的三维重建图像、二维拓扑结构和定量分析。C. 骨缺损区域的H&E染色和Masson三色染色。D. CD86、CD206、RUNX2、OCN、CD31和EMCN的免疫组化染色。刻度条=100 μm。

术后8周，我们处死小鼠并取其颅骨，使用Micro-CT进行3D可视化（图8B）。我们发现Mg/PAFS组的新骨量最多。接下来，我们进行了定量分析，测量并分析了BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp等指标。Mg/PAFS组的上述指标均表现出最佳效果。组织学染色（图8C）显示对照组仅有一些纤维组织，没有明显的新骨形成；而AFS组出现更多的新骨组织，Mg/PAFS组的新骨量最多，几乎完全覆盖了骨缺损区域。因此，Mg/PAFS在体内表现出最佳的骨再生效果。从图8C还可以看出，Mg/PAFS的体内降解率也低于AFS。AFS和Mg/PAFS是具有与骨组织相同组成的生物材料，它们的降解产物可以直接用于骨再生[5]。尽管Mg/PAFS的降解率略低于AFS，但它仍然具有显著的生物可降解性。术后8周已经发生了明显的降解和组织再生。较慢的降解速率也可能为骨缺损提供更好的早期机械支持。然后，我们进行了免疫组化染色，评估骨缺损区域CD86、CD206、RUNX2、OCN、CD31和EMCN的表达情况（图8D）。术后2周，我们首先评估了体内的免疫调节效果。发现AFS组的CD86蛋白最多，但在Mg/PAFS组显著减少。作为M2巨噬细胞的特异性指标，CD206在骨免疫调节中起关键作用。Mg/PAFS组的CD206蛋白最多（图S6A）。Mg/PAFS在体内也表现出抗炎效果。术后8周，我们进一步评估了体内的骨形成和血管生成情况。Mg/PAFS组的RUNX2、OCN、CD31和EMCN表达最高（图S6B和C）。最后，小鼠内脏的HE染色确认了支架的良好生物安全性（图S7）。

研究表明H型血管可以调节骨形成-血管生成耦合[67]。在骨组织中，富含氧气的血液从动脉流出，首先进入以CD31和EMCN高表达为特征的H型血管，然后进入表皮的L型血管，最后进入中央静脉[67]。研究发现，H型内皮细胞不超过内皮细胞的2%，但有趣的是，超过82%的RUNX2阳性成骨前体细胞选择性地分布在H型血管周围[24]。我们的研究结果证实，Mg/PAFS组的RUNX2、CD31和EMCN表达水平最高。这表明Mg/PAFS可以调节骨形成-血管生成耦合，促进骨骼再生。

总之，Mg/PAFS可以通过发挥免疫调节、促血管生成和促骨形成作用，形成有利于骨形成的骨微环境，促进骨骼再生。在这项研究中，通过简单修改AFS使其能够持续释放Mg2+，制备了一种多功能骨组织工程支架。这将为鱼鳞在骨组织工程中的应用提供参考和基础，也为骨缺损修复提供了新的、更有优势的选择。当然，这项研究也有一些局限性。首先，我们仅在体外检测了Mg/PAFS在13天内的Mg2+释放曲线。需要验证更长期的体外或体内释放曲线。其次，尽管我们仅修改了鱼鳞的表面，理论上不会影响其内部组成和结构（如羟基磷灰石的晶体结构），但还需要进一步的实验验证。最终，我们仅对Mg/PAFS的成骨机制进行了初步探索，还需要一些分子生物学实验来深入阐明这一机制。4. 结论总而言之，我们基于鱼鳞制备了一种多功能骨组织工程支架（Mg/PAFS）。该支架具有优异的机械性能，并能够持续释放Mg2+。Mg/PAFS通过良好的ROS清除、免疫调节、促血管生成和促成骨作用，创造出有利于骨形成的局部微环境，从而促进骨骼再生。总体而言，我们开发的多功能支架为骨组织工程提供了新的选择，并有助于生物资源的可持续利用。资助本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号81971160）的支持。CRediT作者贡献声明苏世龙：概念设计、数据管理、方法学研究、软件开发、初稿撰写及审稿编辑。白金武：数据管理、方法学研究、资源提供、软件开发、审稿编辑。高达：软件开发、项目监督、验证、审稿编辑。周如冰：项目监督、验证、审稿编辑。周芳：概念设计、资金争取、结果验证、数据可视化及审稿编辑。