《Materials Today Bio》：Engineering anisotropic tissues: from structured scaffolds to magnetic actuation
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自20世纪晚期，组织工程学被引入以在体外复制人体组织用于生物医学应用。早期概念依赖于在三维（3D）支架中培养细胞以复现体内结构。然而，天然组织不仅是三维的，而且具有结构复杂性、异质性及各向异性——骨骼肌便是一个典型范例。这些各向异性特征不仅是结构性的，它们还显
自20世纪晚期，组织工程学被引入以在体外复制人体组织用于生物医学应用。早期概念依赖于在三维（3D）支架中培养细胞以复现体内结构。然而，天然组织不仅是三维的，而且具有结构复杂性、异质性及各向异性——骨骼肌便是一个典型范例。这些各向异性特征不仅是结构性的，它们还显著影响组织的力学和功能。因此，复制这种跨尺度的结构和力学复杂性对于工程化生理相关的组织模型至关重要。在概述体内各向异性组织的多样性及其功能意义后，本综述探讨了当前基于材料和制造的各向异性组织工程策略。方法涵盖从表面工程化的二维（2D）基底和架构聚合物支架，到基于水凝胶的3D生物打印，通过对材料特性的微纳尺度控制实现细胞引导排列。此外，新兴技术利用外力（如电刺激或声流体刺激）诱导微观结构特征，另一些则利用细胞固有的自组织能力。在这些外部驱动的方法中，基于磁的策略尤为前景广阔，因其能够提供远程、空间精确且动态可调的组织构象控制，涵盖微观和宏观尺度。本综述强调了其生成传统方法无法实现的各向异性架构的能力，并讨论了必须解决的关键挑战，以确立基于磁的方法作为一种新兴策略，从而扩展工程化功能性各向异性组织的设计空间。
1. 引言
组织工程学自20世纪80年代末被首次提出以来，已日益明确二维（2D）细胞培养不足以完全重现天然组织的复杂性。三维（3D）细胞培养不仅增进了对于体内生物学过程的理解，也为药物筛选模型和潜在移植物提供了巨大潜力。尽管3D培养能构建比2D更复杂的结构，但尚未复现体内组织的全部复杂性。与均质的各向同性细胞接种支架不同，体内器官具有复杂的几何形状，且许多呈现出关键的各向异性特征。人体内多种组织具有结构和功能特性（如刚度），这些特性随测量方向的变化而变化。骨骼肌组织是天然组织中各向异性的主要例证，它在每个尺度上（从整个器官到肌原纤维）都呈现出强烈的排列方向。这种显著的纤维状各向异性将几何形状与功能联系起来，因为这种排列优化了组织所有功能单元的协调一致收缩以产生力量。因此，复制这种复杂的体外架构已成为组织工程中更好地复现原生解剖结构的下一个逻辑步骤。
从使用各向异性2D基底开始，各向异性组织工程逐渐演变为3D方法，如模块化组装或模塑，最终催生了器官芯片（Organ-on-Chips）技术的出现。静电纺丝（Electrospinning）和生物打印的发展使得创建更复杂的各向异性几何结构成为可能。然而，尽管取得了这些进展，大多数传统方法仍受限于其对预定支架架构的依赖，这限制了对组织构象的动态控制，且难以调节厚3D构建体深层的组织结构。特别是，实现对各向异性的远程时空控制并重现动态组织重塑过程仍然是重大挑战。因此，新方法开始利用声学或磁力等远程控制策略作为组织工程和刺激的工具。基于磁性纳米粒子（最初用于成像目的），磁组织工程始于细胞片的生成，随后该技术复杂性逐渐增加，展示了创建复杂各向异性架构的能力，同时实现了远程刺激。通过实现无接触、可逆且空间可控的驱动，磁方法为克服传统支架策略的几个关键局限性提供了一条有前景的途径。在概述人体内各种各向异性组织后，本综述调查了旨在体外复现各向异性的不同策略，包括利用细胞固有自组织特性的方法。这些策略被介绍为基础性策略，同时也突出了剩余的局限性。重要的是，基于磁的技术将被作为一种有前景的各向异性组织工程途径引入。
2. 人体内的各向异性组织：结构、力学与功能
a. 定义与评估活体组织中的各向异性
各向异性材料的标志是其特性随测量方向的变化而变化。重要的是，各向异性不一定意味着空间异质性。在生物组织中，各向异性产生于多个尺度，从某些器官的细长几何形状到细胞的极化和排列，甚至细胞外基质（ECM）成分的组织。这些结构特征通常可以通过组织学、荧光、偏振光和第二谐波显微术等成像技术进行评估，从中可以提取取向分布或排列指数。除了组织结构，各向异性还表现在功能特性上，包括定向力学行为、运输和传导性。这些特性可以通过定向力学测试、基于示踪剂的传输分析或电测量来评估。定量描述符如排列指数、取向分布、定向模量比和渗透系数提供了一个框架，用于客观比较天然组织和工程组织中的各向异性特征。基于此，各向异性组织可分为几种类别：纤维状（Fibrous）、管状（Tubular）、层状（Layered）、梯度状（Gradient）和蜂窝状或多孔状（Honeycomb/Porous）。
b. 纤维状组织
纤维状各向异性组织包含所有由纤维状结构组成的组织，这些结构排列有序，共享相似的取向。这种排列赋予组织在优先方向上的特性，并直接贡献于其力学功能。纤维材料遍布全身，存在于细胞外基质和基底膜中，主要由交联的丝状蛋白网络组成，分为胶原蛋白、网状纤维或弹性纤维。当所有这些纤维在细胞外基质中对齐时，会形成具有更高抗应力能力的纤维状各向异性组织。这在皮肤中可见，密集的胶原纤维网络沿Langer线（自然取向模式）排列，导致皮肤的杨氏模量（Young's modulus）在平行方向比垂直方向高十倍。这种纤维排列对于承受单轴载荷的组织特别有意义，如连接肌肉与骨骼的肌腱和稳定关节的韧带。它们共享相似的结构，主要由平行的胶原纤维组成，导致其平行方向的杨氏模量比横向高两个数量级。
排列不仅优化力传递，还增强骨骼肌组织的力生成。与肌腱和韧带不同，骨骼肌组织的各向异性主要来自致密的肌肉细胞（肌纤维），所有肌纤维均沿肌肉收缩方向排列。这种各向异性源于早期的肌发生过程。在生皮肌节层之后，通过一系列转录因子的作用，单核肌肉前体细胞分化为成肌细胞，伸长并对齐，这是骨骼肌纤维状各向异性的第一个起源机制。这种排列使得单核成肌细胞能够融合成多核肌管。这一发育过程导致骨骼肌组织在每个尺度上均由高度排列的纤维状结构组成。在器官层面，骨骼肌具有细长的结构，通常具有高长宽比。每块肌肉两端连接肌腱，将肌肉产生的力量传递给骨骼。骨骼肌细胞不仅具有最高的长宽比之一，也是人体内最大的细胞，其中心充满了数以千计沿细胞同一方向排列的肌原纤维。肌原纤维的特征在于条纹模式，代表了连续的肌节（Sarcomeres），即细胞的收缩单位。这些结构由肌球蛋白和肌动蛋白的重叠细丝组成，其相对滑动产生收缩。这种分子滑动跨越多个组织层次传递，导致沿单一轴的协调收缩。
除骨骼肌外，心肌和平滑肌也显示出一些类似纤维的特征。虽然它们的细胞较小，但仍展示出优先的排列和伸长方向，以及收缩细丝的主要取向。在这两种情况下，它们形成了具有特定纤维状各向异性的细胞层，不同层取向的结合导致了层状各向异性，平滑肌细胞也是如此。
此外，神经元表现出排列的纤维状几何形状，轴突通常延伸数厘米。这些轴突可以共享相同的路径，形成各向异性的纤维状组织。虽然这自然增强了纤维方向的力学性能，但此处排列的主要目的是优化和协调信息传递。
c. 管状组织
继纤维状几何结构之后，身体中下一个最突出的各向异性结构是管状结构，因为许多血管和导管以各种形状和尺寸贯穿身体。最典型的管状组织是血管。从3厘米宽的主动脉到小于10微米宽的毛细血管，血管系统呈现出广泛的管状几何形状。血液流速在运动时可达每秒几米，这些组织必须承受范围在10至100达因/平方厘米（dyne/cm2）的剪切应力。排列在血管内腔的内皮细胞旨在承受此类应力而不渗漏，有时甚至增加血管直径以恢复到平均15达因/平方厘米的剪切应力。除了排列内皮细胞外，纵向的流动和剪切应力还有助于细胞在管的径向方向上建立顶端-基底极性，这使得血液与周围组织之间能够进行选择性物质交换。
淋巴系统包括类似的管状血管。虽然其尺寸与血管相似，但其流速仅为每秒几毫米，导致剪切应力低10倍。上皮组织构成了另一大类各向异性管状组织，通常连接身体与外界。例如，乳汁在乳房中通过2毫米宽的输乳管运输，而肾单位在60微米的通道中过滤和排出尿液。在消化道中，食物通过各种中空器官被逐步移动和转化。除了这种运动和上皮细胞的顶-底极性外，肠道的另一个各向异性特征是隐窝和绒毛结构的径向取向，增加了营养交换的表面积。隐窝和绒毛源于周围平滑肌层压缩下的上皮机械驱动屈曲不稳定性。在此形态发生之后，包裹消化道的平滑肌施加压力，通过蠕动波驱动肠内容物。平滑肌还在其他中空器官中调节定向运动，如呼吸道、子宫和整个脉管系统。
机械力还负责神经沟弯曲和屈曲成神经管，这是胚胎发生过程中中枢神经系统出现的空心管状结构。该管在脊髓形状中持续存在，神经元围绕中央管平行排列，用于营养和废物交换。总之，管状组织对 lumen 形成、径向-轴向组织和动态机械刺激提出了综合要求，这代表了各向异性组织工程策略的关键设计约束。
d. 多孔组织
虽然管状组织以单一定向 lumen 为特征，但其他组织则以各向异性孔隙网络为特征，赋予它们蜂窝状结构和独特的力学性能。骨小梁部分充满了此类孔隙，范围从10微米到1毫米，并沿骨主要受力方向取向。这使得骨重量显著减轻（孔隙率超过75%），同时通过增加的弹性和刚度以及抗循环疲劳性来保持结构完整性。由于海绵状结构，冲击吸收是小梁骨的主要力学功能，这也受孔隙各向异性的影响。事实上，股骨头已被证明在内外侧轴上吸收更多能量。渗透率也被证明在孔隙主要方向上更高，这促进了各向异性营养扩散，并可能促进该方向的血管化和整体细胞迁移。这些特征表明，工程化多孔各向异性组织需要同时控制孔隙取向、尺寸和互连性，以将力学支持与传输特性结合起来。
除了骨组织，肺是体内最著名的孔隙组织之一。虽然肺泡通常被假定为各向同性，但越来越多的证据表明其形态和行为具有各向异性。事实上，小鼠肺泡的平均间距在沿肺纵轴测量时始终最高，并且在扩张时更为明显。这与肺泡气体扩散的优先方向相结合，突出了肺的多孔各向异性旨在有利于空气在呼吸道中的往复运动。
e. 层状组织
体内的某些材料由不同的层组成，无论是交替的还是成分不同的，堆叠在一起。这种组织引入了堆叠轴与各个单层之间的方向差异，导致层状各向异性。角膜是典型的层状材料例子，具有六个明确定义的连续层，具有完全不同的成分和功能。上皮层最薄，显示最低的粘附力以履行屏障功能，而内皮层则是另一端的单细胞层。500微米厚的基质确保角膜的结构完整性。这种堆叠导致各向异性压缩刚度，其值是平面内刚度的四倍。
除了纤维状各向异性，皮肤也由三个主要层构成。表皮充满细胞（主要是角质形成细胞）并充当屏障。中间层为真皮，是一种深达几毫米的结缔组织，主要由胶原纤维网络组成，细胞密度低，而最深层为皮下组织，以脂肪细胞及血管和神经成分为特征。同样，大脑皮层由六层组成，从主要由水平轴突和树突组成的外分子层到具有广泛细胞类型和形状的内多形层，皮层的这种层状架构优化了信息处理。并非所有层状组织都显示层间成分差异，有些可能仅由重复基序构成。皮质骨由一系列致密的同心层组成，形成外部保护鞘，弹性模量约为20吉帕斯卡（GPa）。由于这种堆叠结构，纵向的弹性也是横向平面的两倍。此外，为了保护骨骼免受扭转，矿化胶原纤维的取向会逐层偏移。椎间盘外区的纤维环也观察到了这种层取向偏移，它由15至25个同心板层组成，每个板层由平行胶原纤维构成，从而产生各向异性的力学性能。然而，从一个层到另一个层，纤维方向改变60°，提高了对抗多轴应力的能力。
平滑肌和心肌利用细胞层之间的取向变化来诱导复杂应力。平滑肌在管状结构周围形成两层正交层：内层细胞遵循周向，而外层细胞沿管的轴线对齐，以产生蠕动波。在心脏组织中，心肌细胞的取向从心内膜到心外膜逐渐从+60°偏移到-60°。这种扭曲结构确保了均匀的压力分布，尽管心肌细胞仅收缩约15%，但仍能有效喷射出心脏内60%至70%的血液。由于层的逐渐旋转，心脏组织是层状和各向异性梯度之间过渡情况的例证。
f. 梯度组织
虽然梯度各向异性与层状结构有相似之处，但它不是离散的层，而是表征参数（如细胞取向或微观特征几何形状）沿一个方向连续变化的结枃。在某些情况下，梯度各向异性可以与另一种类型的各向异性相结合，如心脏所示。这也适用于皮肤，除了层状组织外，还可以观察到胶原纤维取向的梯度，特别是在真皮中。靠近皮肤表面的纤维平行运行，但随着深度的增加逐渐变得不那么排列。这种排列可能增强了更易受外部应力影响的表层的力学性能。
胶原取向的逐渐变化也可以在关节软骨中观察到。纤维在表层平行于表面运行，并逐渐旋转直到在更深层变为垂直。这也导致弹性性能的梯度。垂直于表面的杨氏模量从表层到深层逐渐增加10到50倍，而平行模量则遵循相反的趋势。其他特征可导致力学性能的梯度，如松质骨中的孔径和密度，随着距皮质骨距离的增加而逐渐增加。梯度也可在经历动态变化和重塑的组织中观察到，如疤痕和纤维化组织基质中的刚度梯度。除了病理情况外，力学和化学梯度的耦合在胚胎发生期间至关重要，因为它们引导空间特异性的形态发生线索。这些例子表明，工程化梯度各向异性需要对连续变化的属性进行精确的空间控制，这仍然比离散图案化策略更具挑战性。
3. 复现天然各向异性的主要组织工程技术
工程化各向异性组织依赖于广泛的策略，这些策略不仅在技术实施上有所不同，而且更根本地在于产生各向异性的机制上有所不同。为了提供更清晰和一致的框架，这些方法可以根据其主要作用模式大致分为四类。首先，材料驱动策略依赖于生物材料的内在特性或架构（如表面图案化或排列的纤维支架）来引导细胞组织。其次，基于组装的方法通过预形成的生物构建块（包括细胞片、球体或微组织）的空间组织产生各向异性。第三，基于制造的技术（如模塑、微流控或生物打印）在施工过程中通过控制架构、流动或沉积路径强加各向异性。最后，力介导策略利用外部施加的物理线索（如机械、电或流体刺激）诱导发育中组织内的定向组织。总之，这些策略为各向异性组织工程提供了概念和技术基础，同时也推动了替代方法（如磁驱动）的发展，以解决其一些局限性。
a. 材料驱动策略：从2D基底到3D各向异性网格
材料驱动方法是工程化各向异性组织最早和最广泛使用的策略之一，因为它们依赖于基底和支架的内在特性或架构来工程化具有各向异性特性的构建体。第一批各向异性组织工程方法始于2D基底，并建立了细胞排列的一些基本概念。在这些系统中，各向异性主要由材料特性和表面特征引导，提供细胞解读和遵循的局部线索。基底形貌的影响最早由Harrison在1912年观察到，他发现鸡胚细胞沿蜘蛛网丝显示出显著的运动和对齐。这种现象后来被Weiss命名为“接触引导”（Contact guidance）。20世纪90年代微加工技术（特别是光刻和软光刻）的进步使得进一步研究这一机制成为可能，首先是创建带有微凹槽的基底。早期研究表明，虽然平行微凹槽可以促进细胞排列，但这取决于凹槽的几何形状。当脊宽小于4微米时，成纤维细胞才会排列。进一步的技术进步使得能够工程化宽度不超过50纳米的纳米凹槽。然而，当凹槽小于80纳米时，成纤维细胞不再受引导，这表明接触引导在特定范围内起作用。对微凹槽的反应也具有细胞依赖性：与成纤维细胞不同，许旺细胞在微凹槽宽度从10微米增加到20微米或深度从0.5微米增加到1.5微米时，其排列加倍。更复杂的几何形状甚至可以指导特定机制，例如具有液滴形状凹槽的基底诱导内皮细胞的单向迁移，并在植入大鼠时有利于血管化。微凹槽甚至可以控制成肌细胞的分化，因为改善的排列已被证明会增加多种成肌标志物。
基底的各向异性也可以通过图案化粘附分子来诱导，例如使用微接触印刷。在这种情况下，用基质蛋白（如纤连蛋白）覆盖的聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章压在基底上。简单地改变表面化学以在基底上创建各向异性图案，而不影响微观几何形状，仍然具有类似的效果，并且可以诱导人主动脉血管平滑肌细胞的排列。这里，各向异性是由生化图案而非形貌驱动的，说明多种材料线索可以独立引导定向组织。这种技术甚至可以用于多重涂层。例如，这使得创建排列的神经元网络成为可能，其中胞体主要在多聚赖氨酸涂层上，而轴突停留在层粘连蛋白图案上。此外，可以利用具有低蛋白结合能力（如聚乙二醇PEG）的分子的各向异性图案来实现细胞排斥的相反效果。光刻还可以生成类似的化学图案平行线，以利于或反对细胞粘附。例如，它们被用来创建细胞片，其中超过90%的肌管位于±10°取向范围内。
虽然2D系统显示出很大的多样性，甚至利用定向网格或脱细胞草来排列细胞，提供对细胞排列的精确和可重复的控制，但它们本质上受限于其平面性质。将这些策略扩展到3D构建体通常需要堆叠或转移排列的层，这会引入额外的复杂性并限制可扩展性。因此，尽管这些方法对于研究各向异性的基本机制和生成薄组织非常有效，但它们不太适合复现天然组织的全部结构和功能复杂性。
为了克服这些限制，材料驱动策略已扩展到3D纤维支架，特别是通过纺丝技术。静电纺丝是创建各向异性支架的理想方法，尤其是纤维状各向异性。聚合物溶液在带电的注射器和收集器之间被电场拉伸成细纤维，干燥并积累在收集器上。静电纺丝现在可以从生物相容性聚合物（天然的、合成的或半合成的）中生成类似于天然组织中发现的纳米级纤维。电纺纤维的几何形状可以通过聚合物性质、电场或纺丝距离等参数进行控制。排列纤维最常见的方法是在旋转的芯棒上收集它们，高速诱导纤维排列，而低速导致无排列。纤维也可以根据收集器和电极的形状或收集器上的突起进行排列。细胞接种后，这些平行纤维（通常直径约为1微米）引起的接触引导线索将导致类似的细胞排列。在这里，各向异性被直接编码在支架架构内，提供了一种稳健且可扩展的手段来引导细胞组织。如表1所示，这种技术在工程化具有纤维排列的组织方面特别有效，无论细胞是肌腱细胞、心肌细胞、平滑肌细胞还是神经元。
