《Metabarcoding & Metagenomics》：Stemflow for detecting mammalian environmental DNA: a case study in a zoo
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随着哺乳动物多样性下降，迫切需要有效的生物多样性监测工具。针对这一问题，研究人员通过应用eDNA宏条形码技术（eDNA metabarcoding）分析树干流（stemflow）样本，评估了哺乳动物环境DNA（environmental DNA, eDNA）的
随着哺乳动物多样性下降，迫切需要有效的生物多样性监测工具。针对这一问题，研究人员通过应用eDNA宏条形码技术（eDNA metabarcoding）分析树干流（stemflow）样本，评估了哺乳动物环境DNA（environmental DNA, eDNA）的可检测性。研究人员于2024年6月至2025年1月期间，从日本神户王子动物园的11棵树上采集了6次树干流样本。其中一棵树位于笼内，可直接接触圈养哺乳动物，其余树木位于笼外，无法被圈养哺乳动物直接接触。研究人员使用针对线粒体12S rRNA基因的MiMammal引物扩增从树干流样本中提取的eDNA，随后进行测序。研究人员检测到22种哺乳动物的eDNA，其中14种为动物园物种，8种非动物园物种。能够直接接触目标树的日本松鼠（Sciurus lis）的eDNA在所有六个采样时间点均被检测到。此外，研究人员发现基于eDNA的检测与每棵哺乳动物笼舍到每棵树的距离之间存在显著的负相关关系，并且笼内树与笼外树之间检测到的物种组成存在显著差异。总之，这项开创性分析表明，树干流eDNA宏条形码技术可用于检测和监测哺乳动物。其在自然环境中的应用潜力有待后续研究探索。
论文解读：树干流环境DNA宏条形码技术在哺乳动物监测中的应用
研究背景与意义
哺乳动物因其分类学多样性和广泛的生态作用而被公认为生物多样性保护的旗舰物种。然而，目前约四分之一的哺乳动物物种面临灭绝威胁，迫切需要采取紧急措施并开发全面、准确的监测技术。环境DNA（eDNA）分析作为一种新兴的生物监测方法，通过检测水、土壤或空气等环境介质中存在的遗传物质来识别栖息地内的物种，具有无需专门分类学专业知识、非侵入性和成本效益高等优势。尽管已有研究利用水、土壤、空气及无脊椎动物等基质进行哺乳动物eDNA调查，但针对树木这一潜在基质的研究尚显不足。树干流（stemflow）方法，即收集流经树体表面的雨水以检测附着其上的eDNA，因其简便性和成本效益而在植物监测中显示出潜力，但在哺乳动物检测方面尚未见报道。本研究旨在评估利用树干流eDNA宏条形码技术检测哺乳动物的可行性，为哺乳动物监测提供新的工具。该研究成果已发表于《Metabarcode》。
关键技术方法
研究人员于2024年6月至2025年1月期间，在日本神户王子动物园的11棵树上进行了6次树干流采样。样本经重力过滤后，使用DNeasy Blood and Tissue Kit提取eDNA，并利用DNeasy Power Clean Pro Cleanup Kit去除抑制剂。研究人员采用两步PCR法构建测序文库，使用针对线粒体12S rRNA基因的MiMammal引物混合物（包括通用型MiMammal-U及针对熊和象的特异性引物MiMammal-B和MiMammal-E）进行第一轮PCR扩增。扩增产物经纯化、稀释后进行第二轮PCR添加测序标签。文库构建完成后使用Illumina iSeq100平台进行双端150 bp测序。生物信息学分析使用USEARCH软件处理测序数据，并通过BLAST比对NCBI数据库进行物种注释，同时设置严格的阴性对照污染阈值。统计分析采用广义线性混合模型（GLMM）、置换多元方差分析（PERMANOVA）和非度量多维尺度分析（NMDS）等方法。
研究结果
树干流样本的eDNA宏条形码分析
研究人员共获得6,674,861条原始读数，过滤后保留1,175,322条。研究检测到22种哺乳动物的eDNA，其中14种为动物园圈养物种，8种为非动物园物种。位于日本松鼠笼内的T9树在所有采样时间点均检测到日本松鼠的eDNA。在距离笼舍较近的树上，成功检测到了红袋鼠（Osphranter rufus）、查普曼斑马（Equus quagga chapmani）、兔（Oryctolagus cuniculus）、水豚（Hydrochoerus hydrochaeris）、绵羊（Ovis aries）、美洲驼（Lama glama）和山羊（Capra hircus）等物种。检测到的圈养哺乳动物距离笼舍的最远距离为314米（日本松鼠）。最小有效过滤体积为30 mL。
影响哺乳动物eDNA检测和组成的因素
广义线性混合模型（GLMM）分析显示，在0.02%污染控制阈值下，eDNA检测率与笼舍到树木的距离呈显著负相关（p< 0.05），这一结果在不同污染控制阈值（0.001%至0.1%）的敏感性分析中保持一致。树皮类型（光滑、浅裂、深裂）对检测到的物种数量无显著影响（p> 0.05）。基于Bray–Curtis指数和Jaccard相异性的PERMDISP分析及NMDS排序显示，不同树木间的物种组成存在显著差异（p< 0.05），其中T9树（笼内树）的物种组成与其他树木明显分离，形成了一个独特的聚类群。
讨论与结论
树干流对哺乳动物eDNA的可检测性
研究表明树干流水体中可检测到哺乳动物eDNA，该方法比砍伐树枝或使用滚轮擦拭树表的方法更为简便，且与近期发展的雨洗eDNA方法具有相似的可行性。这证实了该方法在了解野外哺乳动物区系方面的潜力。
eDNA检测的空间格局
除直接接触树木的日本松鼠外，未直接接触树木的圈养物种eDNA也被检测到，推测可能通过空气传播到达树体。笼内树T9在所有采样点均检出日本松鼠eDNA，表明直接接触有助于eDNA附着。12种被检测到的圈养物种中，至少有一次是在距离其笼舍最近的树上被检测到，统计学分析支持了距离与检测率的负相关关系。T9树与其他树木在物种组成上的巨大差异可能归因于直接接触的影响，而其他树木（如T1与T5）间物种组成的差异则反映了周围物种的分布情况。
非动物园物种的检测
研究还检测到8种非动物园物种的eDNA，如黄鼬（Mustela sibirica）、浣熊（Procyon lotor）、果子狸（Paguma larvata）、日本貂（Martes melampus）、梅花鹿（Cervus nippon）、狗（Canis lupus familiaris）、家猫（Felis catus）和家牛（Bos taurus）。这些检测结果可归因于周边野生动物、人类携带或过往饲养记录。
树木形态特征对eDNA回收的影响
树皮类型对检测到的物种数量无显著影响，尽管具深裂树皮的树木（如樟树和枹栎）检测数有减少趋势但未达统计显著性。冠层结构可能影响树干流量，进而影响eDNA收集量。
过滤体积对检测灵敏度的影响
随着过滤体积的增加，哺乳动物eDNA的检测概率也随之增加。虽然最低30 mL的过滤体积即可检测到哺乳动物，但检测概率并非仅由过滤体积决定，确定稳定可靠的过滤体积仍是未来研究的重点。
与其他eDNA采样方法的比较
树干流方法对直接接触树木的树栖哺乳动物具有高可检测性。与水样、土壤样及空气eDNA方法相比，树干流方法与雨洗法同属低劳动强度的树基方法，且不受水源限制，可在有树木和降水的环境中广泛应用。不同eDNA方法各有优劣，未来可通过互补实现全面的哺乳动物区系监测。
局限性与未来展望
该方法受降雨不确定性影响，采样时机和水量可变；哺乳动物接触树木及eDNA通过空气传播的随机性也是挑战；可检测的最大距离尚不明确。未来需在更广泛的调查环境中验证该方法，例如使用动物园外的树木来确定最大可达距离。
结论
研究人员证实树干流eDNA宏条形码技术可有效检测哺乳动物eDNA。该方法对接触树木的哺乳动物尤为高效，且对于非直接接触的物种，距离越近检测率越高。这项开创性数据表明，该方法能够反映调查树木周围的物种组成，有助于改进哺乳动物的树栖监测工作。本研究关于哺乳动物与eDNA采样点距离如何影响检测的发现，将为发展基于eDNA的哺乳动物监测技术提供重要参考。
