为了增强环境DNA（eDNA）宏条形码技术中的分类学分辨率，研究人员评估了内转录间隔区2（ITS2）区域的效用。为此，研究人员开发了ITS2宏条形码引物，并通过对额外61个物种进行测序以及整合现有序列，构建了针对日本淡水鱼类的ITS2参考数据库。随后，研究人员将ITS2宏条形码的分类分辨率与广泛使用的线粒体12S核糖体RNA（MiFish）标记进行了比较。结果显示，ITS2提供了更高的分辨率，特别是在Oncorhynchus和Rhinogobius属的物种中，这些物种通常难以通过MiFish区分。Oncorhynchus属分辨率的提升突显了ITS2在监测具有经济和生态重要性的鲑科物种方面的潜力。此外，ITS2还能区分一些MiFish无法鉴别的近缘种，强调了其在生物多样性评估中的价值。研究结果表明，ITS2可以作为一种补充手段，与MiFish结合应用于基于eDNA的鱼类生物多样性监测，尤其是在线粒体标记分辨率有限的类群中。未来的研究应进一步探索ITS2在不同淡水生态系统中的适用性，以优化其整合到多标记宏条形码方法中。

《Metabarcoding & Metagenomics》：Collection of ITS2 region reference sequences for freshwater fish in the Japanese archipelago for environmental DNA metabarcoding applications

　　

为了增强环境DNA（eDNA）宏条形码技术中的分类学分辨率，研究人员评估了内转录间隔区2（ITS2）区域的效用。研究人员开发了ITS2宏条形码引物，并通过额外测序61个物种及整合现有序列，构建了针对日本淡水鱼类的ITS2参考数据库。随后，研究人员将ITS2宏条形码的分类分辨率与广泛使用的线粒体12S核糖体RNA（MiFish）标记进行了比较。研究结果表明，ITS2提供了更高的分辨率，特别是在Oncorhynchus和Rhinogobius属的物种中，这些物种通常难以通过MiFish区分。Oncorhynchus属分辨率的提升突显了ITS2在监测具有经济和生态重要性的鲑科物种方面的潜力。此外，ITS2还能区分一些MiFish无法鉴别的近缘种，强调了其在生物多样性评估中的价值。研究人员的发现表明，ITS2可以作为一种补充手段，与MiFish结合应用于基于eDNA的鱼类生物多样性监测，尤其是在线粒体标记分辨率有限的类群中。未来的研究应进一步探索ITS2在不同淡水生态系统的适用性，以优化其整合到多标记宏条形码方法中。

论文解读：基于ITS2区域的环境DNA宏条形码技术在日本淡水鱼类监测中的应用

本研究聚焦于提升环境DNA（eDNA）宏条形码技术在淡水鱼类监测中的分类学分辨率。鉴于淡水生态系统面临的人为干扰与气候变化威胁，快速获取鱼类空间分布信息对于生物多样性保护至关重要。然而，传统调查方法受限于栖息地特异性与操作难度。环境DNA技术作为一种无需直接捕获即可从水样中检测生物DNA的手段，已显示出比传统方法更高的灵敏度，其中eDNA宏条形码技术更能实现对多种类群的同时检测。目前，基于线粒体DNA（mtDNA）的标记（如广泛应用的12S核糖体RNA基因引物MiFish）是主流选择，但其母系遗传特性及在近缘种间有限的鉴别能力构成了瓶颈。相比之下，核DNA（nDNA）中的核糖体DNA（rDNA）虽拷贝数较低，但内转录间隔区（ITS）因多拷贝特性和种间高度变异，显示出作为互补标记的潜力。尽管已有研究表明ITS区域在物种特异性分析中具有高检测灵敏度，但在鱼类分子系统学中的应用仍显不足，且缺乏区域性综合参考数据库。因此，本研究旨在通过设计ITS2引物、构建日本琵琶湖流域淡水鱼类的ITS2参考数据库，并与MiFish标记进行分辨率对比，确立基于核标记的eDNA宏条形码新方法。

在研究方法上，研究人员首先基于GenBank中鱼类5.8S至28S区域的序列数据，手动设计并验证了针对ITS2区域的通用引物（Fish_ITS2_F/R）。随后，研究团队以琵琶湖流域分布的84种淡水鱼类为主要目标，通过实地采集、博物馆标本及合作捐赠等多渠道获取样本，利用DNeasy Blood & Tissue Kit提取基因组DNA。通过两轮PCR扩增及Illumina MiSeq高通量测序（双端300bp），结合DADA2流程进行质量控制与扩增子序列变体（ASV）推断。研究人员通过计算BLAST比对相似度并结合最大似然法（ML）构建系统发育树，依据种间序列相似度阈值（98.5%）定义了四个分类等级（易区分、可区分、难区分、不可区分），并将结果与MiFish标记进行了系统比较。

研究结果部分，研究人员首先成功设计了引物并验证了其扩增效率。在参考序列构建方面，研究团队最终获得了琵琶湖流域63种鱼类（占目标物种的75%）的ITS2参考序列。在核心的分类分辨率评估中：

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  Oncorhynchus属：研究发现O. biwaensis与O. masou ishikawae及O. mykiss相比，其ITS2区域的序列差异显著大于MiFish，被归类为“易区分物种”，这证明了ITS2在监测该经济与生态重要物种方面的优势。
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  Rhinogobius属：R. flumineus同样被判定为“易区分物种”，而Rhinogobius sp. OM与R. biwaensis之间序列相似度极高，被归为“难区分物种”。
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  Cobitis属：C. magnostriata与C. minamorii oumiensis表现出100%的序列一致度，属于“不可区分物种”；而Cobitis sp. BIWAE A型与B型之间则属于“难区分物种”。
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  Carassius属：Carassius sp.与C. buergeri grandoculis序列完全一致，为“不可区分物种”，且C. cuvieri与其他两种间的区分度亦被评为“难区分”。

讨论与结论部分，研究人员深入分析了ITS2在不同类群中表现差异的原因。对于Oncorhynchus biwaensis和Rhinogobius flumineus的高分辨率，归因于其较深的核基因组分化时间。而对于Cobitis和Carassius属中出现的“不可区分”现象，则分别归因于异源四倍体起源导致的序列一致性及种群间持续的基因流。此外，研究还指出了部分类群（如Anguillidae等科）因缺乏参考序列而亟待补充数据。综上所述，该研究成功构建了琵琶湖流域淡水鱼类的ITS2参考数据库，证实了ITS2作为一种有效的eDNA宏条形码标记，特别适用于那些线粒体标记（如MiFish）难以分辨的类群。研究强调，为了全面捕捉生物多样性信息，推荐采用结合ITS2与MiFish的多标记联合策略。未来的工作应致力于在野外环境中验证ITS2的应用效能，并进一步扩充参考数据库以提升分类学分辨率。