《Microchemical Journal》：Aminoalcohol–amino acid dimer functionalised polyfunctional HPLC stationary phase with broad applicability in reversed-phase, hydrophilic interaction and ion-exchange separations
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作者：Hayriye Aral, Mehmet ?olak, Tar?k Aral, Murat Sunkur, Mesut Ba?c?k
土耳其巴特曼大学技术职业学院，精炼与石化技术系，邮编72070
摘要
本文设计并合成了一种新型多功能固定相，该固定相基于氨基醇-氨基酸二
作者：Hayriye Aral, Mehmet ?olak, Tar?k Aral, Murat Sunkur, Mesut Ba?c?k
土耳其巴特曼大学技术职业学院，精炼与石化技术系，邮编72070
摘要
本文设计并合成了一种新型多功能固定相，该固定相基于氨基醇-氨基酸二聚体，能够在同一色谱平台上同时实现反相色谱（RPLC）、亲水相互作用（HILIC）和离子交换（IEC）三种保留机制。合成策略包括将L-缬醇和L-谷氨酰胺甲酯进行酰胺化反应，生成含有两个羟基和两个酰胺基团的二聚体。该配体通过共价方式固定在Kromasil硅胶上，形成亲水-疏水表面：羟基和酰胺基团促进氢键和偶极相互作用，而脂肪族片段则增强疏水保留效果。表面改性通过元素分析、BET比表面积测量和SEM表征得到验证。使用涵盖广泛极性范围的十三类分析物对色谱性能进行了评估，结果表明该柱子具有高效性能，理论板数通常在30,000至60,000 plate m?1之间，在优化条件下可达到75,000 plate m?1。在HILIC模式下，核碱基/核苷酸和水溶性维生素被有效分离；在RPLC模式下，烷基苯、多环芳烃（PAHs）、苏丹染料和除草剂在短时间内得到分离。中等极性化合物（如苯甲酸、苯胺和酚类）也能有效分离，苯甲酸在HILIC和RPLC条件下均得到保留。生物活性物质（如植物生长调节剂、酚酸、磺胺类药物和合成染料）也得到了分离。该柱子与六种参考材料进行了对比测试，包括三种自制混合模式固定相和三种商业混合模式、C18和HILIC柱子，结果表明GluVal-Mix-SP在广泛极性范围内表现出优异的选择性和平衡的保留特性。
引言
现代分析化学要求分离系统能够在单次分析中分离结构多样的化合物。高效液相色谱（HPLC）由于其灵敏度和在制药、环境和生物化学领域的广泛应用而成为核心分析技术[1][2]。HPLC的进步主要得益于固定相设计的改进，固定相决定了分离的选择性和保留行为[3]。常见的模式如反相色谱（RPLC）、亲水相互作用色谱（HILIC）和离子交换色谱（IEC）依赖于不同的相互作用机制，并在特定的极性范围内稳定运行[2][4]。RPLC主要依靠疏水分配作用，而HILIC则通过氢键和界面分配效应优先分离极性化合物[5][6][7]。然而，这些单一模式的方法往往难以处理极性范围广泛或具有多重官能团的混合物[8]。这一局限性推动了混合模式色谱（MMC）的发展，通过在单一固定相中整合疏水、极性和静电相互作用来提高选择性和保留灵活性[9][10][11][12]。
为了解决单一模式系统的局限性，混合模式色谱（MMC）在单一固定相中整合了多种保留机制[13]。这类材料通常通过将多功能配体共价接枝到硅胶或聚合物载体上来实现疏水、亲水、静电和π-π相互作用的协同作用[14][15][16][17]。这种分子设计提高了选择性，有助于分离结构相似的化合物。例如，两亲性聚胺基固定相能够增强形状识别能力，同时抑制硅醇的活性[4]。
传统的固定相通常围绕单一的保留机制设计，这限制了其在较窄极性范围内的选择性。混合模式材料通过在一个表面结构中整合疏水、极性和离子相互作用位点来克服这一限制，最初是通过物理混合或串联耦合实现的，后来逐渐发展为通过共价结合多个功能域[18][19][20][21]。由此产生的设计空间非常广泛，包括咪唑基/羧基功能化固定相和树枝状十八烷基胺修饰的硅胶（RP/IEC）[22][23]、能够同时实现HILIC和强阴离子交换保留的磷酸二酯键合材料[8][24]，以及酰胺连接固定相（功能基团的位置调节氢键和偶极作用[7][9][25][26]。两性离子涂层和离子液体嵌入结构进一步扩展了电荷密度和极性控制能力[27][28][29][30][31][32][33][34]。其他创新形式（如脲基烷基和双接枝表面、基于PEI或富含胺的混合物以及具有pH响应性的电静力特性[35][36]，以及单块或水凝胶系统，这些改进提高了对生物碱、肽和磺胺类药物等复杂混合物的分离能力[37]。
除了材料多样化之外，当前的研究还集中在混合模式固定相的行为机制及其如何预测和调整不同分析物类别的保留行为上。最近的多功能设计结合了疏水、极性和离子交换功能，显示出更好的保留平衡和正交选择性，适用于复杂混合物的分离[7][9][25][38][39][40][41][42]。生物质衍生材料、双阳离子离子液体接枝硅胶和双功能配体系统进一步展示了如何通过定向化学调整RPLC/HILIC/IEC行为，从而提高从小分子到生物大分子的分离选择性[43][44][45][46][47][48]。重要的是，通过QSRR建模和模拟，人们对这些机制有了更深入的理解，将保留行为与疏水性、电荷分布、氢键和酸碱性（logP/logD、pKa）等参数联系起来[49][50][51]。这些见解推动了混合模式RP/HILIC/IEC平台在高分辨率肽和药物分离中的应用，其中选择性和回收率都至关重要[52]。
在我们之前基于二乙醇胺（DEA-Mix-SP）[53][54]和三羟甲基氨基甲烷（THMA-Mix-SP）[54][55]开发的混合模式固定相的基础上（这两种固定相均表现出较弱的阴离子交换性能），以及基于N-乙酰半胱氨酸的弱阳离子交换固定相[56]，我们观察到了互补但不一致的保留行为。DEA和THMA材料更倾向于分离高极性化合物，而半胱氨酸衍生固定相则对非极性分析物有更强的亲和力，这表明需要更精确调节亲水-疏水平衡。为了解决这一问题，我们通过将L-缬醇和L-谷氨酰胺甲酯（GluVal）制备氨基醇-氨基酸二聚体，并将其共价固定在环氧功能化的硅胶上来合理设计了新的固定相GluVal-Mix-SP。GluVal化合物在此首次报道，并在无溶剂条件下以95%的产率合成。GluVal-Mix-SP的结构包含两个羟基和两个酰胺基团，使得极性、疏水和弱离子交换相互作用能够协同发挥作用。该材料通过表面积分析、SEM和元素分析进行了表征，并在十三类分析物上进行了评估：九种核碱基/核苷酸、八种水溶性维生素、六种烷基苯、四种多环芳烃（PAHs）、六种苏丹染料、八种除草剂、五种磺胺类药物、九种苯甲酸、八种苯胺、十种酚类、十二种植物生长调节剂（PGRs）、八种酚酸和八种合成水溶性染料。与之前的固定相相比，GluVal-Mix-SP在更广泛的极性范围内表现出更强的保留能力和更一致的性能。
部分摘录
化学试剂
色谱用硅胶载体（Kromasil 5–100 SIL；平均粒径5 μm，平均孔径100 ?，比表面积324 m2 g?1）由Nouryon（瑞典）提供。HPLC级溶剂（乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）和2-丙醇（IPA）购自Merck。所有合成步骤中均使用无水乙醇（Sigma-Aldrich）。使用前，甲苯需在无水CaCl?上干燥24小时。
设计与合成
GluVal-Mix-SP的开发是我们之前报道的基于二乙醇胺（DEA-Mix-SP）[53][54]、三羟甲基氨基甲烷（THMA-Mix-SP）[54]和N-乙酰半胱氨酸（NAC-Mix-SP）[56]系列的改进延续。这些材料为多功能色谱表面提供了坚实的基础，展示了互补的亲水和疏水相互作用特性。本研究旨在...
结论
本研究成功合成了一种新型氨基醇-氨基酸二聚体配体，该配体通过简单、高产且成本效益高的方法制备，并将其固定在Kromasil硅胶上，制备出了GluVal-Mix-SP固定相。该混合模式柱子在涵盖广泛化学范围的十三类分析物上进行了系统评估。在HILIC条件下，高极性化合物（包括核碱基/核苷酸）...
CRediT作者贡献声明
Hayriye Aral：方法学研究、数据分析、概念化。Mehmet ?olak：数据分析、数据管理、初稿撰写与修订、项目管理、资金申请、数据分析、概念化。Tar?k Aral：撰写与编辑、项目协调、资金申请、数据分析、概念化。Murat Sunkur：数据分析。Mesut Ba?c?k：数据分析。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了土耳其科学技术研究委员会（TüB?TAK）的支持，项目编号为223Z036。感谢TüB?TAK对本项目的支持。
