用于人血清白蛋白的亲和配体的设计

《Microchemical Journal》：Design of affinity ligands for human serum albumin

　　

杨辉|张琳

中国天津市天津大学合成生物学与生物制造学院生物化学工程系，合成生物学国家重点实验室（科技部），合成生物学前沿科学中心，系统生物工程重点实验室（教育部），邮编300350

摘要

人血清白蛋白（HSA）在生物制药领域具有巨大的应用潜力。通过基因工程实现HSA的高产表达对其生产非常有前景。然而，这一过程受到复杂下游纯化步骤的限制。本文采用两种策略开发了针对HSA的亲和配体：仿生设计和智能设计。在仿生设计中，结合分子动力学（MD）模拟和分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）分析来研究HSA与纳米抗体Alb1之间的界面，以此为基础构建亲和配体库。在智能设计中，利用我们之前工作中开发的智能设计模型IDProMat进行连续训练直接获得配体候选分子。通过对接实验、MD模拟等方法对候选配体进行筛选，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）、静态吸附实验、动态结合能力测量和亲和层析等技术进行实验验证。最佳配体FKITSGSLSR（来自仿生设计）和DGALTPPSEY（来自智能设计）通过一步亲和层析纯化，分别能够以89.59%和72.96%的回收率从发酵液中有效分离HSA。这些结果证明了两种策略的成功，为配体设计提供了有益的参考。

引言

人血清白蛋白（HSA）是血浆中最丰富的蛋白质，含有585个氨基酸，分子量为66.5 kDa [1]。HSA由三个同源结构域组成：I（5–195）、II（196–383）和III（384–582）[2]。HSA具有多种功能，如运输内源性和外源性物质、维持血浆胶体渗透压以及清除自由基。此外，HSA还表现出类似酶的活性 [3]。这些活性在药物代谢 [4]、有机磷解毒 [5]、良性与恶性乳腺肿瘤的区分 [6] 以及抗氧化防御 [7] 等过程中具有重要应用价值。因此，HSA在临床领域有广泛的应用，例如作为载体蛋白 [8]、疾病生物标志物 [9]、[10] 和生物材料 [11]、[12]，同时也用于治疗烧伤、出血、休克等病症 [13]。

传统的HSA生产方法包括从人血浆中提取，如冷乙醇分级 [14]、盐分级 [15]、聚乙二醇分级 [16] 和亲和沉淀 [17]。这些工业过程主要依赖于人血浆的分离。考虑到血液供应不足和血液来源病原体的安全问题 [18]，在酵母和水稻宿主中大规模生产HSA也是一个有前景的替代方案。然而，下游纯化步骤仍然是一个重大挑战。目前亲和层析被广泛用于蛋白质纯化，其中针对目标蛋白的亲和配体至关重要。根据来源分类，天然的HSA亲和配体包括L-色氨酸、半胱氨酸 [19]、脂肪酸 [8]、细菌肽 [20]，而通过库筛选得到的配体包括纳米抗体 [21]、DARPins [22]、Nanofitins [23]、抗体片段 [24] 和核酸 [25]。合理的配体设计现已得到广泛应用 [26]、[27]、[28]、[29]。将计算建模与实验验证相结合是阐明各种配体与大分子之间分子相互作用的有效策略 [30]、[31]、[32]、[33]。利用这一策略，基于结构信息通过分子对接或分子动力学（MD）模拟设计了HSA亲和配体 [34]、[35]、[36]、[37]、[38]。

人工智能（AI）的快速发展促进了其在蛋白质表面和界面研究中的应用，特别是在处理复杂非线性模式和高速处理大量数据方面 [39]、[40]、[41]、[42]、[43]。在我们之前的工作中，开发了一个用于配体设计的智能模型（Intelligent Design of Protein Matcher，IDProMat）[44]。IDProMat采用序列到序列的框架，包括编码器-解码器模块和多层感知器（MLP）模块。前者建立了蛋白质序列数据与实值张量之间的映射关系，后者模拟了蛋白质复合物界面上的结合相互作用。通过IDProMat成功设计并验证了针对胶原蛋白的肽抑制剂。在本研究中，继续对该模型进行训练，并将其应用于HSA，以提高其对不同目标的通用性。

因此，本研究采用了仿生设计和智能设计两种策略来开发HSA的亲和配体。在仿生设计中，基于MD模拟和MM-PBSA计算分析的结果构建了HSA与Alb1纳米抗体之间的结合界面，从而构建了配体库 [45]。在智能设计中，直接利用IDProMat根据HSA可能的结合域生成配体候选分子。然后通过计算机模拟和实验验证（包括ELISA、静态吸附和亲和层析）对两种方法得到的最佳候选配体进行评估和比较。

节选内容

材料

TFA盐形式的冻干肽购自GL Biochem（中国上海）。HSA购自Biotopped（中国北京）。人血清白蛋白ELISA试剂盒购自COIBO BIO（中国上海）。EAH-Sepharose 4B和Sepharose 4 Fast Flow（Cytiva）购自Zhongyuan Bio（中国北京）。SDS-PAGE凝胶、2×SDS-PAGE快速加载缓冲液、预染蛋白梯度和蛋白快速染色溶液均来自Tsingke（中国北京）。Pichia pastoris

HSA与Mgb^c7HopQ_NbAlb1之间的结合界面

通过MD模拟研究了HSA与Mgb^c7HopQ_NbAlb1之间的结合界面和分子相互作用。如图1所示，最小距离（d_min）约为0.169 nm，波动较小。接触后，质心（d_com）略有下降，随后稳定在约6.9 nm。在整个模拟过程中，Mgb^c7HopQ_NbAlb1和HSA的RMSD值分别为0.53 nm和0.58 nm，R_g值也变化不大。

结论

本研究采用仿生设计和智能设计两种策略开发了HSA的亲和配体。在仿生设计中，通过MD模拟和MM-PBSA分析阐明了HSA-Mgb^c7HopQ_NbAlb1复合物中的分子界面和相互作用。随后基于Mgb^c7HopQ_NbAlb1的关键残基进行了亲和配体的仿生设计。在智能设计中，通过持续训练和模型应用获得了配体候选分子。

CRediT作者贡献声明

杨辉：撰写——初稿、验证、实验研究。张琳：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号2022YFC2104800）的支持。作者感谢姚明东博士在发酵实验中的帮助。