由适配体调控的Cas13a-Csm6级联反应实现了对前列腺特异性抗原的超灵敏检测，且无需扩增过程

《Microchemical Journal》：Aptamer-regulated Cas13a–Csm6 cascade enables ultrasensitive amplification-free detection of prostate-specific antigen

　　

Juncheng Yao|Lu Chen|Qi Yang|Yutao Li|Zhisong Xue|Ying Xiang|Hui Chen|Ke Dou|Fan Yang

四川人民医院辅助生殖中心，电子科技大学，成都610041，中国四川

摘要

前列腺特异性抗原（PSA）是前列腺癌诊断和监测的关键生物标志物，但现有的检测方法在实现高灵敏度和操作简便性方面存在挑战。本文介绍了一种基于Cas13a–Csm6级联生物传感平台，用于超灵敏度和特异性地检测PSA。该系统使用一种PSA特异性适配体，该适配体既作为分子识别元件，又作为Cas13a的单链DNA激活剂。在没有目标蛋白的情况下，Cas13a被激活并切割Csm6激活剂前体，产生短链线性寡腺苷酸激活剂，进而触发Csm6，产生强烈的荧光信号。在存在PSA的情况下，适配体结合会抑制Cas13a的激活，导致荧光输出减弱。在优化条件下，该级联平台的检测限达到1.04 pg/mL，显著低于仅使用Cas13a的系统（57.6 pg/mL），从而提高了低水平 quantification 和分析的稳健性。该检测方法表现出高选择性、强的抗干扰能力、在稀释血清样本中的可靠检测效果，以及在18天内的稳定性能。此外，通过简单替换PSA适配体为VEGF适配体，该平台可成功重新编程用于VEGF检测，展示了其模块化和适应性。这种Cas13a–Csm6级联系统为蛋白质生物标志物的检测提供了一种敏感、稳健且易于重新配置的策略，并具有未来临床诊断应用的潜力。

引言

前列腺癌是全球男性中第二常见的恶性肿瘤，也是导致癌症相关死亡的第五大原因[1][2]，对男性健康构成严重威胁。前列腺特异性抗原（PSA）是一种由前列腺上皮细胞分泌的34 kDa丝氨酸蛋白酶[3]，在健康男性的血清中含量极低，但在良性前列腺增生（BPH）[4]、前列腺炎[5]或前列腺癌[6]患者中显著升高。临床实践中，血清PSA浓度超过4.0 ng/mL被认为是异常升高的，提示可能存在前列腺异常；而PSA水平超过10.0 ng/mL则强烈提示恶性病变，需要立即进行诊断评估[7][8]。此外，监测PSA的动态变化提供了重要的预后信息[9]。临床研究表明，PSA年增长速率（PSAV）超过0.75 ng/mL与恶性进展和前列腺癌特异性死亡率显著增加相关[10]。作为前列腺癌诊断和预后的核心生物标志物，PSA在早期筛查、术后监测和复发预测中发挥着关键作用。尽管临床决策通常基于ng/mL级别的PSA浓度，但提高分析灵敏度对于解析微妙的浓度变化、支持稀释或体积有限样本的测量以及在复杂生物基质中保持可靠的定量仍然具有价值[11]。

尽管PSA检测在临床诊断中被广泛应用，但传统的免疫测定方法（如ELISA和CLIA）受到复杂程序、抗体不稳定性和对低浓度PSA灵敏度不足的限制[12][13][14]。尽管已经开发了多种先进的PSA检测策略，但大多数方法在灵敏度和简便性之间仍存在平衡问题。最近的研究报道了基于电化学发光（ECL）和光电化学（PEC）的高灵敏度PSA生物传感器，例如Ru(bpy)₃²⁺功能化的MOF基双信号ECL/PEC免疫传感器、基于共振能量转移的“开启-关闭-开启”PEC适配体传感器，以及基于纳米级异质结的放射计量PEC免疫测定，这些方法都实现了优异的分析灵敏度[15][16][17]，但依赖于复杂的纳米材料工程和光活性界面。同时，Zhao等人开发了一种基于SERS的磁性免疫传感器，通过多层信号放大实现了0.87 pg/mL的超低检测限[18]；Yue等人开发了一种基于α-Fe?O?/Fe?O?@Au纳米复合体和磁诱导自组装的无标记电化学生物传感器，检测限达到0.78 pg/mL[19]；Xia等人则报道了一种能够同时检测活性PSA和总PSA的磁辅助电化学免疫传感器，检测限分别为0.3 pM和2 pM[20]。然而，这些方法依赖于复杂的纳米材料合成、多步骤组装、磁分离和特殊仪器，限制了它们在快速或即时检测PSA方面的实用性[21][22]。

鉴于这些限制，研究人员转向了CRISPR–Cas系统，这类系统结合了高特异性、可编程性和酶介导的放大功能，用于敏感的生物标志物检测[23][24]。其中，基于Cas12a的生物传感器由于其强大的转切割活性和易于编程性，已被广泛用于PSA检测[25]。例如，Long等人开发了一种金属–有机框架（MOF）–DNA生物条形码放大的Cas12a检测方法，实现了0.03 pg/mL的检测限[26]。尽管这些基于Cas12a的方法灵敏度很高，但通常需要核酸放大、MOF辅助的生物条形码标记和抗体依赖的目标转化，这使工作流程复杂化，不利于即时检测的应用。相比之下，Fan等人提出了一种一步法、无需放大的Cas12a–适配体荧光检测方法，实现了快速直接的PSA检测[27]。然而，这种方法的检测限相对较高（0.16 ng/mL），表明灵敏度有限。因此，开发一种更为简单且高度灵敏的基于CRISPR的系统以直接检测PSA是非常有必要的。

最近的研究表明，LbuCas13a可以直接识别并响应单链DNA（ssDNA）目标。研究表明，LbuCas13a具有独立的DNA激活转切割活性，对ssDNA的单碱基特异性比对RNA高约19倍[28]。这些发现扩展了Cas13a的底物范围，揭示了其作为可编程ssDNA识别模块的潜力。在此基础上，Luo等人开发了一种基于Lambda外切酶的LbuCas13a检测平台，用于SNP基因分型[29]，证实了其强DNA激活的旁路切割活性。

与此同时，属于III-A型的CRISPR相关RNase Csm6在循环寡核苷酸激活下作为信号放大器发挥作用，通过切割RNA报告分子[30]。Liu等人证明，Cas13与Csm6的结合可以实现串联核酸酶级联[31]，从而实现快速的超灵敏度RNA检测。在最近的研究中，Xu等人利用Cas13a–Csm6串联探针在无需预扩增的情况下检测发酵中的活微生物[32]，灵敏度提高了16倍，并在30分钟内完成了分析。总体而言，这些研究表明，将ssDNA响应的Cas13a与Csm6介导的级联放大相结合，为高灵敏度、无需放大的生物传感提供了一条有前景的策略。

受这些进展的启发，我们设计了一种基于Cas13a–Csm6的级联平台，用于超灵敏度和特异性地检测PSA。在本研究中，使用Savory等人在SELEX/post-SELEX优化研究中首次报道的PSA特异性适配体（5′-TTTTTAATTAAAGCTCGCCATCAAATAGCTTT-3′），它具有双重功能：作为分子识别元件选择性地结合PSA，并作为单链DNA激活剂在未结合时触发Cas13a的酶活性。激活后，Cas13a切割Csm6激活剂前体（F-A?U?），生成具有2′,3′-环状磷酸基团的线性四腺苷酸分子（A?＞P），这些分子作为二级信使激活Csm6，从而诱导荧光RNA报告分子的二次转切割。在存在PSA的情况下，适配体与目标结合并抑制Cas13a的激活，导致荧光输出减弱。在本研究中使用的检测流程中，PSA首先在37°C下与适配体预孵育30分钟；在这种实验条件下，这种预结合足以有效抑制适配体介导的Cas13a激活。总体而言，这种结合适配体介导的分子识别与双酶放大技术的策略有望实现完全酶促且无需放大的PSA检测。为了检验这一设计，比较研究了仅使用Cas13a和Cas13a–Csm6级联格式的分析性能。这里的较高分析灵敏度并非旨在重新定义当前的临床PSA临界值，而是为了在低浓度情况下提高定量能力，并在样本稀释或基质诱导的信号减弱情况下保持检测性能。

摘录

材料

EiCsm6蛋白、LbuCas13a蛋白及相应的1× Cas13a–Csm6缓冲液均从EZassay Biotechnology Ltd.获得。前列腺特异性抗原标准品（来自人精液）从Sigma-Aldrich购买。本研究中使用的所有寡核苷酸和RNA底物，包括PSA适配体、crRNA、Csm6激活剂前体及poly-C荧光RNA报告分子，均由Sangon Biotech（上海，中国）合成并纯化，其序列列于表S1中。

用于PSA检测的Cas13a–Csm6级联荧光测定

Cas13a–Csm6平台用于PSA检测的工作原理

Cas13a–Csm6平台用于PSA检测，基于适配体调节的Cas13a激活和随后的级联信号放大，其中每个组分在将目标识别转化为可测量输出的过程中发挥着重要作用（图1）。在该平台上，PSA适配体作为分子识别元件，特异性结合PSA；同时作为单链DNA激活剂，在未结合时激活Cas13a的酶活性。在没有PSA的情况下，适配体...

结论

开发了一种基于Cas13a–Csm6级联生物传感平台的超灵敏度和特异性PSA检测方法。该系统结合了适配体介导的分子识别和双酶信号放大，实现了完全酶促且无需放大的检测过程。在此设计中，PSA特异性适配体既作为识别元件，又作为Cas13a的单链DNA激活剂，使目标响应的信号生成成为可能。

CRediT作者贡献声明

Juncheng Yao：撰写——原始草稿、方法学、实验研究、正式分析、概念化。Lu Chen：撰写——原始草稿、方法学、实验研究、正式分析。Qi Yang：方法学、正式分析。Yutao Li：实验研究、正式分析。Zhisong Xue：验证、资源准备、正式分析。Ying Xiang：资源准备、正式分析。Hui Chen：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理。Ke Dou：撰写——审稿与编辑、项目管理。

利益声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了四川省科学技术厅重点研发计划（项目编号：23ZDYF1464）的支持。