《Molecular and Cellular Endocrinology》：Copper regulates the synthesis of steroid hormones through CCS and ATOX1 dependent MEK1-ERK1/2 pathway in follicular granulosa cells of yak (Bos grunniens)
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作者：娄彦兵、杨婷婷、夏成龙、杨世军、邓慧丹、朱彦秋、方静、左志才、郭洪瑞四川农业大学兽医学院，中国四川省成都市611130摘要颗粒细胞（GCs）中的类固醇激素合成对正常的卵泡发育和排卵至关重要。最新研究表明，微量元素铜（Cu）会影响牦牛颗粒细胞（YGCs）的激素分泌；然而，其具
作者：娄彦兵、杨婷婷、夏成龙、杨世军、邓慧丹、朱彦秋、方静、左志才、郭洪瑞
四川农业大学兽医学院，中国四川省成都市611130
摘要
颗粒细胞（GCs）中的类固醇激素合成对正常的卵泡发育和排卵至关重要。最新研究表明，微量元素铜（Cu）会影响牦牛颗粒细胞（YGCs）的激素分泌；然而，其具体机制尚不清楚。在本研究中，我们发现铜通过激活MEK1-ERK1/2信号通路来上调YGCs中的雌二醇（E2）和孕酮（P4）的分泌。我们的研究结果表明，铜的伴侣蛋白ATOX1和CCS对于铜诱导的MEK1-ERK1/2激活及随后的激素分泌至关重要，而依赖于铜的酶LOX则不是必需的。沉默ATOX1或CCS基因会导致MEK1-ERK1/2磷酸化及类固醇生成减少，这突显了它们在该通路中的调节作用。尽管LOX会影响激素分泌，但它并不影响MEK-ERK的磷酸化，表明其作用机制可能与MEK无关。这些发现揭示了铜通过CCS和ATOX1依赖的MEK1–ERK1/2通路调节YGCs中的类固醇激素合成，为理解牦牛与铜相关的生殖障碍提供了新的见解。
引言
铜（Cu）是一种在生物体内广泛存在的必需微量元素，在许多驱动代谢过程的酶的组成和激活中起着关键作用[14]。在女性生殖系统中，铜水平的失调与多种妇科疾病显著相关，宫颈癌、卵巢癌和子宫内膜癌患者的血清铜水平及铜/锌比值均有所升高[14]。然而，铜在女性生殖中的具体作用机制仍不清楚。
牦牛主要生活在寒冷的高原地区，是重要的放牧牲畜。由于高原地区牧草短缺，牦牛因摄入铜不足而容易出现铜缺乏。此外，牦牛瘤胃中铜、钼和硫（Cu-Mo-S）之间的相互作用会导致硫化物和硫代氨基甲酸盐与铜不可逆结合，从而阻碍肠道对铜的吸收，进而引发继发性铜缺乏[4, 5, 18]。有研究表明，中国西部的牦牛存在严重的继发性铜缺乏，受影响的牦牛表现为小细胞低色素性贫血和铜蓝蛋白水平降低[27]。值得注意的是，牦牛在怀孕和哺乳期间的铜缺乏症状最为严重[9, 12]。1982年，研究人员发现铜能刺激下丘脑颗粒释放促黄体生成激素[1, 3]。在雌性哺乳动物中，颗粒细胞（GCs）的生长和发育与卵泡成熟密切相关。GCs的发育过程主要分为两个阶段：增殖阶段：在FSH的刺激下，GCs增殖并在卵母细胞周围形成细胞层；分化阶段：在LH峰值期间，GCs逐渐分化并获得类固醇生成能力[24]。GCs通过分泌雌二醇（E2）和孕酮（P4）等类固醇激素，为卵泡提供必要的能量底物和生长因子，促进卵母细胞成熟和卵泡发育。它们通过调节增殖、分化以及类固醇激素的合成和分泌来调控卵母细胞与卵泡膜细胞之间的相互作用，从而影响卵母细胞成熟和卵泡发育[21]。研究表明，卵泡微环境中的铜离子浓度与颗粒细胞的类固醇生成功能密切相关[29]。我们之前在体外培养的牦牛颗粒细胞培养基中添加不同浓度的矿物质元素时发现，铜能够显著且规律地诱导颗粒细胞的类固醇激素分泌。随后我们研究了不同铜水平下颗粒细胞的激素分泌情况，发现铜可以诱导牦牛卵泡颗粒细胞合成雌二醇和孕酮，而铜缺乏则会抑制颗粒细胞的激素分泌。通过转录组学进一步探讨了铜影响颗粒细胞激素分泌的机制，发现可能与MAPK信号通路有关，但具体机制仍不明确[19, 20]。
尽管已有研究表明丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路参与类固醇生成，但其确切机制仍不清楚[7]。此外，还有报道称铜通过与MEK1/2的直接相互作用来影响MAPK通路[30]。我们之前的研究表明，MAPK通路可能参与了铜对牦牛颗粒细胞类固醇激素合成的影响[19]。因此，本研究采用了实时PCR、Western blotting、转录组分析和基因干预实验来阐明铜对牦牛颗粒细胞类固醇激素合成的影响，重点关注MEK-ERK信号通路及其作用机制。本研究的结果可能为解决牦牛铜缺乏相关的生殖障碍提供新的见解和理论支持。
章节摘录
材料与方法
硫酸铜（CuSO4；CAS编号7758-98-7；纯度99%）购自成都科隆化工有限公司（中国成都）。四硫钼酸盐铵（TTM；CAS编号15060-55-6）购自Sigma Aldrich。苯甲磺酰氟（PMSF；CAS编号ST506）、非去污剂P-40（NP40）裂解缓冲液（产品编号P0013F）、BeyoECL Star（产品编号P0018AM）和比色酸（BCA）蛋白测定试剂盒（产品编号P0012）购自贝奥泰生物技术公司（中国上海）。雌二醇（E2）酶联...
MEK1-ERK1/2通路在铜调节牦牛颗粒细胞激素分泌中的作用
如补充图1A所示，显微镜下观察到牦牛颗粒细胞紧密附着在培养皿上。这些贴壁细胞形态完整，边缘清晰，大小均匀，呈多边形或鱼叉状。通过红色荧光标记确认了颗粒细胞中FSHR蛋白的特异性表达，而DAPI染色显示的蓝色荧光代表细胞核。
讨论
正常的卵泡发育和排卵对生殖至关重要，这一过程由卵泡颗粒细胞分泌的类固醇激素E2和P4调节。最近的研究表明，微量元素铜与这些细胞中的类固醇激素分泌有关[22, 25, 26]。此外，体外添加铜可以增强颗粒细胞的DNA完整性[23]。我们之前的研究表明，牦牛颗粒细胞培养上清液中的E2和P4浓度有所增加...
结论
铜通过依赖于CCS和ATOX1的MEK1-ERK1/2通路调节牦牛颗粒细胞中的类固醇激素合成。然而，LOX影响牦牛颗粒细胞激素分泌的具体机制仍需进一步研究。本研究为治疗牦牛铜缺乏相关的生殖障碍提供了潜在的治疗靶点。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
作者贡献声明：
左志才：项目管理。
娄彦兵：撰写——初稿、方法学、实验设计、数据分析。
郭洪瑞：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金筹集、概念构思。
杨世军：方法学。
邓慧丹：方法学。
杨婷婷：方法学、实验设计、数据分析。
夏成龙：方法学。
朱彦秋：方法学。
方静：项目管理
数据获取
本文中的原始数据包含在文章及其补充材料中。如需更多支持研究结果的原始数据（包括未裁剪的Western blot图像、qPCR Ct值和原始ELISA OD数据），可向相应作者提出合理请求。
本研究得到了国家重点研发项目（2022YFD1601600）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢同事们的技术支持和富有启发性的讨论。
