《Nano Today》：Aromaticity-donated preferable prodrug nanoassembly: Deciphering the underlying roles of π-conjugation in self-aggregation and drug activation
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姚晨|王月泉|袁海蒙|王一帆|李欣然|陈琴|张红媛|张申武|罗聪沈阳药科大学武雅创新学院药学系，中国沈阳110016摘要疏水侧链常被用于促进化疗前体药物自组装成无载体纳米药物。然而，由疏水相互作用驱动的组装过程存在前体药物激活和药物释放延迟的困境。在此，我们发现了芳香π共轭在前体
姚晨|王月泉|袁海蒙|王一帆|李欣然|陈琴|张红媛|张申武|罗聪
沈阳药科大学武雅创新学院药学系，中国沈阳110016
摘要
疏水侧链常被用于促进化疗前体药物自组装成无载体纳米药物。然而，由疏水相互作用驱动的组装过程存在前体药物激活和药物释放延迟的困境。在此，我们发现了芳香π共轭在前体药物纳米组装形成和化学键断裂中的重要作用。我们证明，芳香基团通过调节π-π堆叠相互作用、分子刚性和二面角灵活性来微调SN38前体药物的自组装行为。此外，芳香性通过减小HOMO-LUMO能隙和调整分子表面电静力特性，意外地加速了二硫键断裂并改变了前体药物的激活动力学。在五种芳香基团中，具有多个芳香中心和灵活分子框架的蒽作为最佳侧链脱颖而出。与蒽共轭的SN38前体药物在纳米组装性能和药物释放之间实现了良好的平衡，在体内表现出强烈的抗肿瘤效果，且无全身毒性。这些发现为通过协调的分子间π-π相互作用合理设计基于前体药物的纳米药物提供了独特的视角。
引言
尽管出现了多种治疗方式[1]，[2]，化疗仍然是临床实践中癌症治疗的基石[3]，[4]。然而，化疗药物的临床潜力受到肿瘤靶向效率不足和限制剂量的全身毒性的极大限制[5]。SN38是一种强效的拓扑异构酶I抑制剂，但其临床开发受到溶解度有限和严重不良反应的阻碍[6]。为了克服这些障碍，开发并批准了伊立替康（ONIVYDE?）的脂质体制剂，这是SN38的前体药物。然而，其治疗效果取决于两个连续步骤，包括伊立替康从脂质体中的释放及其在体内的代谢转化为SN38[7]。这两个速率限制步骤显著减弱了抗肿瘤反应。此外，伊立替康本身的细胞毒性仅约为SN38的1%，这进一步限制了ONIVYDE?的临床效益。另一种基于SN38的药物Trodelvy?在肿瘤部位的释放效率低且延迟[8]。在血浆稳定性和肿瘤内药物释放之间实现适当的平衡仍然是ADCs面临的主要挑战[9]，[10]。这些情况凸显了需要具有高肿瘤选择性和快速肿瘤内激活能力的药物输送系统[11]。令人失望的是，临床批准的纳米药物与传统制剂相比并未显示出更好的疗效，这主要是由于早期载体中的药物输送效率和药物释放动力学之间的持续不平衡[12]，[13]。白蛋白结合的紫杉醇纳米颗粒（Abraxane?）在静脉注射后迅速不稳定，导致药物与载体分离，药物动力学改善甚微[14]。脂质体多柔比星（Doxil?）显著延长了全身循环时间并促进了多柔比星在肿瘤中的积累，但在远程装载过程中药物结晶导致封装过度稳定，肿瘤部位的释放不足[15]，[16]。许多努力集中在设计具有肿瘤靶向性和刺激响应性的系统上，以协调输送和释放[17]，[18]，[19]，[20]。然而，基于载体的纳米药物的临床转化仍然具有挑战性，因为大多数载体材料难以作为静脉注射辅料开发。此外，大多数功能性纳米药物的复杂制造过程阻碍了大规模生产和工业应用。
由小分子前体药物构建的无载体自组装纳米药物代表了一种有前景的策略，它结合了前体药物化学和纳米技术[21]，[22]，[23]，[24]。小分子前体药物无需载体材料的帮助即可自发聚集形成稳定的纳米结构，从而实现超过50%的超高效药物装载能力[25]，[18]。通过在前体药物中引入肿瘤微环境响应性连接剂（如二硫键），前体药物纳米组装（NAs）可以在肿瘤部位实现选择性药物激活和释放[26]，[27]，[28]。肿瘤特异性前体药物激活和药物释放的协同效应显著降低了全身毒性[29]，[30]，[31]。然而，主要挑战在于如何平衡NA的稳定性和现场快速药物激活，这对于制造、储存和全身输送至关重要[26]。这完全取决于前体药物的合理分子设计，通常包括三个模块：母体药物、响应性连接剂和侧链修饰剂[32]。由于出色的生物相容性和氧化还原敏感性，二硫键被广泛用作连接剂[33]，[34]。此外，约90°的二面角已被确定为促进自组装的关键结构特征[35]，[36]。前体药物的侧链修饰剂在平衡组装稳定性和药物激活动力学方面同样重要[37]。疏水相互作用是构建大多数纳米药物（如脂质体和胶束）的主要驱动力[25]，[31]。已经设计了一系列具有亲脂侧链的疏水前体药物来工程化前体药物组装的纳米药物[35]，[37]。虽然强烈的疏水性显著增强了纳米组装稳定性，但过于亲脂的侧链往往会阻碍前体药物的激活，特别是在涉及水解的情况下[38]，[39]。与疏水相互作用不同，π-π堆叠相互作用也提供了强大的有序力量，有助于前体药物纳米组装，而不会显著改变分子的疏水性[40]，[41]，[42]，[43]，[44]。鉴于此，我们提出引入低疏水性的共轭芳香基团作为侧链是一种可行的策略，通过π-π相互作用促进稳定的前体药物纳米组装，并实现按需药物激活。为了系统验证这一概念，我们选择了一系列代表性的芳香基团，包括苯、萘、Fmoc、蒽和芘，这些基团提供了逐渐增加的π共轭，同时保持相对可比的疏水性。这些结构在平面性、刚性和空间构型上也有所不同，从而可以逐步调节π-π堆叠强度和分子堆积行为。这种设计使我们能够区分π-π相互作用、分子灵活性和空间效应对纳米组装稳定性和前体药物激活的贡献。这种方法有望为无载体自组装纳米药物中长期存在的组装稳定性和药物激活之间的矛盾提供实际解决方案。
为了验证我们的假设，我们合成了一系列具有逐渐增加π共轭的芳香侧链的二硫键连接的SN38前体药物，包括苯、萘、Fmoc、蒽和芘，分别得到Ben-S-S-SN38（BS）、Na-S-S-SN38（NS）、Fmoc-S-S-SN38（FS）、An-S-S-SN38（AS）和Py-S-S-SN38（PS）。尽管它们的疏水性相当，但这些芳香侧链通过调节π-π堆叠强度、分子灵活性和二硫键二面角，深刻影响了SN38前体药物的纳米组装行为、胶体稳定性和体内输送命运。其中，含有蒽基团的AS表现出最有利的自组装特性，在高浓度（1 mg/mL）下形成稳定的NA，并且在PBS（pH 7.4）中无需任何稳定剂即可保持满意的胶体稳定性。分子动力学模拟显示，AS的二面角为88.14°，接近90°，组装自由能为-3401 kcal/mol。这些结构特征赋予了它出色的纳米组装能力。令我们惊讶的是，芳香共轭也极大地影响了前体药物的激活动力学。多重π共轭减小了HOMO-LUMO能隙并调整了分子表面电静力特性，最终促进了AS和PS中的二硫键断裂。在含有5 mM DTT的还原条件下，AS和PS在1小时内释放了超过60%的SN38。相比之下，其他三种前体药物在相同条件下的激活相对较慢。尽管药物释放性能良好，但PS的刚性芘核心不利于稳定的纳米组装，导致稳定性较差。在这些芳香前体药物中，AS在制剂稳定性和药物释放之间实现了微妙的平衡。经过表面PEG化修饰后，AS NA在血液中的循环时间较长，在异种移植和原位结肠肿瘤携带的小鼠模型中表现出显著的抗肿瘤效果和满意的安全性结果（图1）。这项研究首次系统地证明了芳香π共轭同时调节纳米组装和二硫键断裂动力学，为无载体自组装前体药物的合理设计和临床转化提供了关键的化学和结构指导。
章节片段
本项目旨在解决无载体前体NA开发中的关键挑战。如前所述，高度疏水的烷基侧链为小分子前体的自组装提供了强大的驱动力，但会阻碍涉及水解的前体药物激活。我们预期π-π堆叠相互作用可以提供驱动分子组装的力量，而不会延迟前体药物的激活和释放。在此，我们提出使用高度共轭的芳香基团
总之，我们证明了合理设计前体NA的芳香侧链是一种强大的策略，可以同时优化稳定性、药代动力学和肿瘤选择性激活。引入共轭芳香基团显著调节了自组装行为、细胞内药物释放、全身循环，最终影响体内的抗肿瘤效果。在五种前体NA中，p-AS NA表现出最有利的效果
SN38（7-ethyl-10-hydroxycamptothecin）、1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide盐酸盐（EDCI）、4-dimethylaminopyrideine（DMAP）和1-hydroxybenzotriazole（HOBT）从安徽能源化工有限公司购买。1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000（DSPE-PEG2K）从上海A.V.T. Pharmaceutical Co., Ltd.购买。4,4′-Dithiodibutyric acid从上海TCI Development Co., Ltd.购买。DMEM细胞培养基
我们努力确保非人类受试者的性别平衡。我们通过选择细胞系来确保实验样本的多样性。
姚晨：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，方法学，研究，数据分析，概念化。王月泉：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，研究，资金获取，数据分析，概念化。袁海蒙：数据分析，概念化。王一帆：数据分析，概念化。李欣然：数据分析，概念化。陈琴：数据分析，概念化。张红媛：
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
本工作得到了辽宁省博士科学研究启动基金（编号：2025-BS-0749）、国家自然科学基金（编号：82161138029和82504723）、辽宁省自然科学基金（编号：2025-JQ-07）、辽宁省振兴人才计划（编号：XLYC2402040）以及中国-日本联合国际先进药物输送系统研究及转化项目（编号：2024JH2/102100007）的财政支持
