铜绿假单胞菌（Pseudomonas sp.）及其混合菌群对B30储罐系统中油水界面生物腐蚀现象的影响

《Next Materials》：Influence of Pseudomonas sp. and mixed culture on biocorrosion phenomena at the oil-water interphase in the B30 storage tank system

　　纳迪亚·伊克里·奥利亚（Nadia Ijkri Aulia）|克里斯蒂安·阿斯兰（Christian Aslan）|比扬·拜哈基（Byan Baihaqi）|哈里·德维安托（Hary Devianto）|阿尔迪扬·哈里马万（Ardiyan Harimawan）
印度尼西亚万隆理工学院工业技术学院化学工程系，万隆40132

**摘要**
生物柴油是一种可再生能源，在印度尼西亚被用作B30柴油混合物。然而，生物柴油存在一个缺点，即可能导致受微生物影响的腐蚀现象，这会引发碳钢储存系统的材料降解和工程故障风险。本研究旨在比较假单胞菌（Pseudomonas sp.）及其混合培养物对B30储存罐系统中生物膜形成、碳钢腐蚀和燃料降解的影响，特别是油水界面处的影响。研究结果表明，假单胞菌及其混合培养物分别使均匀腐蚀速率加快至3.16×10^-2毫米/年和2.15×10^-2毫米/年，高于对照组和先前研究中的油相腐蚀速率。此外，燃料降解导致酸值分别升高至2.06毫克KOH/克和1.42毫克KOH/克，超出了标准限值。在水相中，生物腐蚀现象（微生物生长和腐蚀过程）比在油相中更为显著。金属表面形成了两层结构：生物膜（上层由水、蛋白质、多糖和脂质组成）和腐蚀产物（下层由氧化铁和磷酸铁组成）。这些发现表明，油水界面处的微生物活动在加速腐蚀和燃料降解过程中起着关键作用，其中假单胞菌的影响比混合培养物更为严重。未来的研究应探讨生物腐蚀的控制方法、延长浸泡时间、测量腐蚀坑深度，并利用先进的分析技术来更好地预测和减轻与生物柴油相关的工程故障。

**1. 引言**
能源是全球经济增长的重要驱动力[1]，世界人口的持续增长相应地加剧了能源需求[2]。目前，全球能源生产仍主要依赖化石燃料[3]。然而，这种依赖性带来了重大挑战，包括资源枯竭和负面环境影响[4]。这一问题促使人们开发绿色能源，如生物氢、生物合成气和生物柴油，这些能源燃烧更清洁，具有融入生物基能源系统的巨大潜力[5]。生物柴油（脂肪酸甲酯，FAME）是一种液体燃料，可以与石油柴油混合使用，作为替代柴油[6]。生物柴油因其环保、安全性更高以及十六烷值优于石油柴油等优点而被开发[7]。然而，生物柴油也存在缺点，如更易生物降解、吸水性更强以及由于含氧量较高而极性更强[8][9]。因此，将生物柴油与石油柴油混合会导致储存罐底部积水，形成油水界面[10]，从而促进微生物生长。

微生物可以增强生物降解过程，产生有益或有害的结果。例如，热带假丝酵母（Candida tropicalis）和褐菇（Pleurotus ostreatus）能够降解微塑料[11][12]。相反，有害影响则表现为生物腐蚀[13]和生物劣化[14]。生物腐蚀是石油和天然气行业中造成重大经济损失的现象，占所有腐蚀相关成本的40%，损失高达数亿美元[15][16]。碳钢是一种铁碳合金工程材料，含碳量低于2%，并含有硅、磷和硫等元素[17]。由于其优异的机械性能和成本效益，碳钢常用于工艺设备，包括石油柴油储存罐[18][19]。然而，生物柴油的加入使得原本为石油柴油设计的储存罐不得不改用于储存混合燃料，导致材料不相容[20]。

柴油混合燃料储存罐的底部区域（油水界面）最容易发生生物腐蚀，因为该区域存在水、溶解盐和沉积物[21][22]。水会加速微生物生长，而溶解盐在水中更具溶解性[23][24]。沉积物（如盐和腐蚀产物）会产生厌氧环境，有利于厌氧菌（如硫酸盐还原菌SRB）的生长，这些细菌是石油和天然气行业生物腐蚀的主要原因[25]。柴油混合物中存在多种微生物，但它们的生物腐蚀特性及其影响仍知之甚少。已有研究针对柴油混合物中的无菌培养物进行了探讨，例如芽孢杆菌属（Bacillus sp.）[16][18][19][26][27][28][29][30][31][32]、沙雷氏菌属（Serratia sp.）[15][19][29][31][33]、比索克拉米斯菌属（Byssochlamys sp.）[34][35]、雅罗维亚菌属（Yarrowia sp.）[34][35]、威克勒哈莫梅斯菌属（Wickerhamomyces sp.）[34][35]和帕西洛米斯菌属（Paecilomyces sp.）[36]。相比之下，经常在柴油储存系统中检测到的假单胞菌（Pseudomonas sp.）的研究较少[37][38][39][40]。此外，关于更接近实际条件的混合培养物（如B30液体中的生物膜）的研究也较为有限。因此，本研究选择了假单胞菌的无菌培养物及其从B30液体生物膜中获得的混合培养物，以研究其生物腐蚀特性及其对柴油混合物系统的影响。

大多数关于柴油混合物燃料系统中生物腐蚀的研究主要集中在油相（液态烃区域）的腐蚀现象[18][19][26][27][28][29][30][31][32][41]。阿斯兰（Aslan）等人、拜哈基（Baihaqi）等人以及哈里马万（Harimawan）等人的先前研究报道，B30燃料油相的腐蚀速率为0.004至0.024毫米/年，属于低腐蚀速率范围[13][24][41]。然而，尽管油水界面存在水相和更高的微生物活性，导致生物腐蚀风险更高，但针对该区域的研究仍然有限[22]。因此，本研究重点关注油水界面处的生物腐蚀现象。

本研究旨在识别与B30中存在的假单胞菌及其混合培养物相关的生物腐蚀现象，特别是B30储存罐油水界面处的腐蚀现象。本研究考察的生物腐蚀特性包括生物膜形成、碳钢腐蚀和燃料降解。通过将实际从柴油混合物污泥中分离出的假单胞菌无菌培养物以及从B30燃料碳钢表面形成的生物膜中获得的混合培养物整合到实验中，并进行油水界面腐蚀测试，这种方法在之前的生物腐蚀研究中尚未得到充分探索。

**2. 材料与方法**
2.1. 碳钢试样和反应器的制备
将ST 37碳钢板切割成1厘米×1厘米×0.1厘米的试样。每个试样中心钻孔以安装挂钩。试样表面依次用240至1200目的砂纸打磨，然后用清水和乙醇彻底冲洗，以去除残留物并确保表面清洁。试样在烘箱中脱水后存放在干燥剂中保持干燥，并用70%体积比的乙醇进行灭菌，再放入储存罐中。

反应器系统包括玻璃反应器、玻璃挂钩和亚克力盖。玻璃反应器（体积250毫升）经过高压灭菌以防止污染。玻璃挂钩设计用于悬挂4个试样，亚克力盖则能有效封闭反应器。为减少污染，玻璃挂钩和亚克力盖均用70%体积比的乙醇进行灭菌。

2.2. 实验培养基和接种培养基的制备
实验培养基为Biosolar B30，这是一种来自PT Pertamina的商业柴油混合物产品。Biosolar中的生物柴油主要来源于棕榈油，成分包括棕榈酸甲酯和油酸甲酯。Biosolar的规格[42][43]、生物柴油的规格[6]及组成[44]分别见表S1-S3。实验培养基通过0.45微米孔径的膜过滤器在生物安全柜内的真空条件下过滤灭菌。接种培养基为Bushnell Haas Broth（BHB），其矿物成分包括200毫克/升MgSO4、20毫克/升CaCl2、1000毫克/升KH2PO4、1000毫克/升K2HPO4、1000毫克/升NH4NO3和50毫克/升FeCl3。BHB经过高压灭菌（121°C、1巴、15分钟），然后将灭菌后的Biosolar B30以每0.3升BHB添加1克的比率加入BHB中作为碳源。

2.3. 微生物的制备
本研究使用了两种类型的微生物培养物：混合培养物和无菌培养物。混合培养物来自阿斯兰（Aslan）的研究[24]，由在Biosolar B30中浸泡约两个月的固着相（生物膜）微生物组成。这些微生物从金属表面刮下并稀释在盐水溶液（0.95%重量百分比NaCl）中。无菌培养物为从加油站储存罐中收集的柴油混合物（B30）污泥中分离出的假单胞菌（Pseudomonas sp.）。简要来说，0.5毫升的污泥样本用火焰灭菌的Drigalski刮刀均匀涂抹在高压灭菌的Bushnell-Haas琼脂平板上，随后分离出一个菌落并鉴定为假单胞菌。无菌培养物保存在高压灭菌的营养琼脂斜面上（成分包括1500毫克/升牛肉提取物、1500毫克/升酵母提取物、5000毫克/升蛋白胨、5000毫克/升NaCl和15000毫克/升NaCl）。接种时，将微生物培养物用注射器转移到0.3升无菌BHB中，并在27°C、150转/分钟的摇床中培养，直至微生物浓度达到约10^6 CFU/毫升[45][46]。

2.4. 主要实验
主要实验是将碳钢试样浸入反应器系统中的实验培养基和微生物培养液混合物中。整个实验过程在生物安全柜内无菌操作，以防止空气中的微生物污染。实验中，20毫升微生物培养液与180毫升灭菌后的实验培养基（B30）混合后放入灭菌的玻璃反应器中。灭菌后的碳钢试样固定在灭菌的玻璃挂钩上，置于油水界面处。浸没过程需遵循“溶液体积与试样面积”比例（20–40毫升/平方厘米[47]）。反应器用灭菌的亚克力盖密封，并用蜡进一步固定以保持无菌状态。系统在室温（约25–30°C）和大气压（1个大气压）下保持封闭、静态状态，氧气来源于初始空间和培养基中的溶解氧，无需外部供应、测量或控制。

2.5. 生长定量
通过琼脂平板扩散法测定油相和水相中的固着相和浮游相微生物的生长情况，菌落数量通过总菌落计数确定。用于测定假单胞菌无菌培养物的培养基为Bushnell Haas Agar（BHA），成分包括200毫克/升MgSO4、20毫克/升CaCl2、1000毫克/升KH2PO4、1000毫克/升K2HPO4、1000毫克/升NH4NO3和20000毫克/升琼脂；用于测定混合培养物的培养基为Nutrient Agar（NA），成分包括1500毫克/升牛肉提取物、1500毫克/升酵母提取物、5000毫克/升蛋白胨和15000毫克/升NaCl。培养时间和温度分别为3天和30°C。实验重复进行两次，数据以平均值和标准误差条表示。

2.6. 腐蚀速率
碳钢的腐蚀速率按照ASTM G1–03[48]标准进行测量和计算。腐蚀产物用Clarke试剂溶解，该试剂的组成为每升6 N HCl含有20000毫克Sb2O3和50000毫克SnCl2。在浸没前后分别在第1天、第5天、第9天、第13天和第21天测量试样的重量损失，计算每日均匀腐蚀速率。然后根据第5天、第9天、第13天和第21天的每日腐蚀速率计算平均均匀腐蚀速率（第1天的数据因异常高而排除在外，以免影响平均值和标准误差）。实验重复进行两次，数据以平均值和标准误差条表示。

2.7. 生物膜成分
使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）鉴定生物膜成分。实验中，金属试样干燥后用Shimadzu公司的FTIR Prestige 21仪器在400–4500厘米^-1的范围内进行分析。该分析针对单个样本进行。表面形态
表面形态通过扫描电子显微镜（SEM）在500倍放大倍数下观察，而生物膜和腐蚀产物中的元素组成则使用能量分散X射线光谱（EDX）进行鉴定。为了观察生物膜的形态，使用3%的甲醛溶液固定金属样本上的生物膜。对于腐蚀产物的分析，使用乙醇溶液去除金属表面的生物膜。随后将金属试样脱水，并使用Ion Sputter MC1000覆盖一层薄金以改善视觉质量。然后使用配备EDX探测器的Hitachi SU3500进行SEM分析，以分析元素组成。该分析是在单个样本上进行的。

2.9. 燃料降解的风险
通过总酸值（TAN）来衡量燃料降解的风险，以确定微生物培养前后的酸值。在这种方法中，培养前的燃料和培养后的燃料都按照美国石油化学家协会（AOCS）官方方法Cd 3d-63 [49]进行酸碱滴定处理。该分析进行了两次重复实验，数据以平均值和标准偏差误差条的形式呈现。

2.10. 汽罐损坏的风险
通过基于测量的腐蚀率计算汽罐的预计使用寿命来调查汽罐损坏的风险，腐蚀率是从重量损失测量中获得的。风险识别参考了API 650 [50]以及供应商网站上的相关汽罐规格 [51]。此外，汽罐规格在估计失效时间方面起着关键作用。这些规格基于API 650标准，并转换为国际单位制（SI）。

3. 结果与讨论
3.1. 生长量化
图1展示了微生物的定量生长情况。从第1天到第21天，每4天分析一次微生物的生长情况。根据Nakanishi等人的研究，生物膜在金属表面的生命周期分为三个阶段。第一阶段是浮游细胞附着（粘附）到金属表面。然后是第二阶段，此时会产生胞外物质，形成胞外聚合物（EPS）。在这个阶段，尚未发生腐蚀过程，生物膜内部有大量的氧气，允许好氧细菌生存。微生物在固体表面的生长通常是空间异质的。微生物会迅速繁殖并达到高细胞密度，并在称为微菌落的结构中生长。这些微菌落会产生一种或多种胞外多糖，这些多糖由微生物分泌，从而加速了它们对金属表面的附着。第三阶段是生物膜成熟，允许营养物质和代谢废物的运输、氧气供应以及生物膜内不同亚群细菌之间的通信 [52]。值得注意的是，微生物倾向于以分散或斑块状的方式在表面上定殖，导致表面上的氧气和营养物质分布不均。这种异质性创造了局部的好氧和厌氧微环境，极大地影响了微生物的新陈代谢、生物膜的发展和腐蚀行为 [53]。此外，释放出来的微生物或某些亚群会扩散到新的位置，导致金属表面上的生物膜不均匀 [52]。

下载：下载高分辨率图像（306KB）
下载：下载全尺寸图像
图1. 微生物菌落量化：(a) 铜绿假单胞菌 – 生物膜，(b) 铜绿假单胞菌 – 浮游细胞，(c) 混合培养 – 生物膜，(d) 混合培养 – 浮游细胞。
图1(a)中可以看到铜绿假单胞菌在油相和水相中的生物膜生长。从第1天到第9天，微生物在油相和水相中都发生了附着。从第9天到第13天，观察到成熟阶段，此时水相中的生物膜细胞数量稳定。然而，由于产生了抑制EPS生成的微生物代谢废物，油相中的生物膜数量在第13天减少，这意味着生物膜进入了脱落阶段。从第13天到第21天，油相中的生物膜菌落数量减少，因为细胞不再能够形成生物膜。与此同时，从第13天到第21天，水相中的生物膜菌落数量趋于稳定或不变，直到浸泡时间结束。
根据图1(b)，水相中的浮游细胞数量比油相中的更多。这表明水相适合铜绿假单胞菌的生长。在浮游阶段，从第1天到第17天，油相和水相中的微生物菌落数量都在增加。这与文献中的说法一致，即生物膜比浮游细胞具有更强的生长抵抗力 [54]。
从图1(c)可以看出，油相和水相中生物膜形成的附着阶段发生在第1天到第9天，表现为菌落数量的增加。混合培养的适应阶段发生在第2天到第4天。这表明混合培养中的适应阶段发生在1-9天的范围内。菌落数量的增加是由于微生物与碳钢表面之间的附着键。延长浸泡时间会影响碳钢表面的菌落数量和EPS的数量。接下来是从第9天到第17天的成熟阶段，其特征是菌落数量稳定增加。然而，由于微生物细胞的释放，油相中的生物膜在第13天数量减少，因此EPS无法维持微生物细胞与表面金属之间的结合。然后是从第17天到第21天的脱落阶段，表现为菌落数量的减少。在这个阶段，细胞无法形成生物膜并释放到液体相中，可能是由于产生了微生物代谢废物 [24]。
根据图1(d)，从第1天到第17天，油相和水相中的浮游细胞数量趋于增加。这证明了浮游阶段在生物膜形成中的作用。这与Queiroz等人的研究结果一致，即新形成的生物膜中的微生物数量与浮游阶段中每种微生物的浓度相关 [55]。

3.2. 重量损失和腐蚀率
图2(a)显示了碳钢金属在各种浸泡介质中浸泡后的重量损失。在ANOVA分析之前，使用Minitab验证了数据的正态性和方差，结果显示不同微生物处理之间的重量损失有显著差异（F值（2,27）= 17.50；P值 < 0.05），表明微生物类型在油水界面处的重量损失中起着关键作用。在这项研究中，非生物变异的重量损失低于生物变异，即铜绿假单胞菌和混合培养。这表明微生物加速了腐蚀过程。在这项研究中，油水界面处的非生物变异的重量损失从第1天到第13天显著增加。同时，Aslan等人报告称从第4天开始就检测到油相中的非生物变异的重量损失 [16]。这表明浸泡阶段对腐蚀率有显著影响。油水界面具有更高的导电性，导致更高的腐蚀率。铜绿假单胞菌和混合培养的重量损失从第1天到第17天显著增加。这一增加也得到了图1中生长量化的证实，即在1-17天内也有增加。这是因为铜绿假单胞菌附着在碳钢表面，可以抑制再钝化并在金属上持续形成坑洞 [56]。第21天，由于微生物的脱落，重量略有增加。

下载：下载高分辨率图像（157KB）
下载：下载全尺寸图像
图2. 在非生物和生物变异下的生物腐蚀行为：(a) 重量损失；(b) 均匀腐蚀率。
基于第5天、第9天、第13天和第21天的日腐蚀率，计算了平均均匀腐蚀率，如图2(b)所示。在ANOVA分析之前，使用Minitab验证了数据的正态性和方差，结果显示不同微生物处理之间的平均腐蚀率有显著差异（F值（2,12）= 14.87；P值 < 0.05），表明微生物类型在油水界面处的腐蚀率中起着关键作用。根据图2(b)，铜绿假单胞菌的腐蚀率高于Bushnell Haas对照组和B30生物膜的混合培养，分别为3.16 × 10^-2 mm/年。这表明铜绿假单胞菌可以加剧碳钢的腐蚀。Telegdi等人的研究也支持这一点，他们发现铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性细菌，在生物腐蚀过程中起着关键作用 [57]。这些细菌最初附着在固体表面（即粘附过程），在这种情况下是碳钢金属，然后利用这些先锋菌落作为积累的平台。铜绿假单胞菌产生的好氧粘液可以与金属表面形成的薄膜和腐蚀沉积物结合。此外，铜绿假单胞菌产生大量的EPS，这些EPS将细胞结合并稳定在金属表面，作为关键的生存策略，极大地促进了表面附着和生物膜的稳定 [58]。腐蚀率的增加是由于铜绿假单胞菌的阴极还原作用，它可以产生过氧化氢酶。此外，铜绿假单胞菌还可以通过释放有机酸造成被动损伤，从而导致腐蚀率显著增加 [56]。
B30生物膜的混合培养的腐蚀率为2.15 × 10^-2 mm/年，低于铜绿假单胞菌的腐蚀率。已知混合培养包含革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。这些细菌可以被分类为好氧菌或厌氧菌。根据Cai等人的研究，在混合培养介质中，厌氧区域位于腐蚀产物下方，而好氧区域的氧气浓度相对较高，这加速了腐蚀过程 [59]。这表明浸泡反应器中相对较多的细菌是好氧菌。
Bushnell Haas对照组的腐蚀率显著低于接种微生物的变体，为1.04 × 10^-2 mm/年。这表明微生物在浸泡介质中的存在会增加金属的腐蚀率。Lan等人的理论支持这一点，他们认为细菌活动和细菌代谢物（在这种情况下称为生物腐蚀）会影响腐蚀率 [56]，[60]。在Aslan等人使用B30溶液在油相中进行的无菌条件下进行的实验中，报告的腐蚀率为5.62 × 10^-3 mm/年。这个值低于本研究中获得的腐蚀率，这可能是由于浸泡条件的不同。此外，金属样品仅暴露在油相中，而在本研究中，样品位于油水界面 [24]。水相的存在可以增加现有的腐蚀率，因为金属氧化需要水 [34]。因此，水相的存在可以比单独的油相增加腐蚀率。

3.3. 表面形态
使用SEM识别了浸泡第1天、第9天和第21天时，有无生物膜的金属表面形态，如图3所示。材料表面的表征有助于更好地理解微生物如何在碳钢表面相互作用和定殖。根据图3(a-c, g-i)，从第1天到第21天，两种变体的金属表面都广泛覆盖着一层厚厚的生物膜。总体而言，水相中的生物膜比油相中的生物膜更厚。这是因为微生物主要生活在水相中，这促进了碳钢表面生物膜的生长。根据Miller等人的研究，燃料储存罐中的大量微生物生长和腐蚀现象发生在水相以及水相和油相的界面处[34]。此外，这一现象也与Aslan等人的研究结果一致，他们的研究表明微生物在水相中的生长速度比在油相中更快[61]。

图3. 油水界面处金属表面的形态，放大倍数为500倍：(a) 铜绿假单胞菌（Pseudomonas sp.）– 生物膜 – 第1天；(b) 铜绿假单胞菌 – 生物膜 – 第9天；(c) 铜绿假单胞菌 – 生物膜 – 第21天；(d) 铜绿假单胞菌 – 无生物膜 – 第1天；(e) 铜绿假单胞菌 – 无生物膜 – 第9天；(f) 铜绿假单胞菌 – 无生物膜 – 第21天；(g) 混合培养物 – 生物膜 – 第1天；(h) 混合培养物 – 生物膜 – 第9天；(i) 混合培养物 – 生物膜 – 第21天；(j) 混合培养物 – 无生物膜 – 第1天；(k) 混合培养物 – 无生物膜 – 第9天；(l) 混合培养物 – 无生物膜 – 第21天。从图3(d-f, j-l)可以看出，随着时间的推移，金属表面变得粗糙。然而，水相产生的表面粗糙度高于油相，这表明水的存在会加剧金属表面的均匀腐蚀。第1天的金属表面看起来较为平坦，而第9天和第21天的金属表面已经出现了点蚀现象。通过生物膜的发展，微生物群落逐渐改变了材料的表面形态，并随着时间的推移促进了表面元素的浸出，最终导致点蚀腐蚀[62]。此外，微生物的新陈代谢会产生有机酸，从而加速点蚀过程。Cai等人的研究表明，固着微生物会分泌酸，降低金属表面的pH值，导致严重的点蚀[59]。这也与Aslan等人的研究结果一致，他们的研究表明腐蚀产物更多地形成于水相而非油相[61]。

3.4. 生物膜成分和腐蚀产物
通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析了铜绿假单胞菌（Pseudomonas sp.）和混合培养物产生的生物膜中的化学键，结果如图4所示。在本研究中，FTIR光谱主要用于生物膜的定性表征，特别是识别与生物膜形成相关的官能团和键合特性，而不是量化生物膜的数量。FTIR分析显示，铜绿假单胞菌无菌培养物和混合培养物形成的化学键基本相似，表明它们的化学组成没有显著差异。

图4. 铜绿假单胞菌无菌培养物和混合培养物生物膜中形成的化学键的鉴定。
在3450 cm–1处的宽吸收峰对应于–OH伸缩振动，通常与水和醇类相关[61][63]。水天然存在于微生物细胞和生物膜中，而醇类可能是由微生物代谢过程（包括烃类降解）产生的。在2924至2852 cm–1之间观察到的–CH伸缩带表明存在脂肪烃，这些脂肪烃通常属于油中的脂质成分[13][64][65]。在1744和1375 cm–1处的明显峰对应于–CO伸缩振动，表明存在蛋白质和细菌分泌的胞外聚合物物质（EPS）[41][64]。此外，这一峰也可能反映了羧酸等官能团的存在，羧酸通常在1700 cm–1附近有吸收[24][66][67]。
在1462 cm–1处的吸收峰对应于–CH弯曲振动[68]，而在1244和1196 cm–1处的吸收峰则归因于–NH键，表明存在胺类或蛋白质成分[69][70]。1200至1700 cm–1的光谱区域进一步支持生物膜基质中存在蛋白质化合物[65]。在1171和1016 cm–1处的峰分别表明存在三级、二级和一级–C–O键[18][69][70]，证实EPS富含碳水化合物和蛋白质成分。
在1365 cm–1附近的–CH弯曲振动表明存在烷烃，这可能与金属表面上磷酸铁（Fe3(PO4)2）的形成有关[72]。这一点得到了572 cm–1处特征性磷酸盐（PO43–）峰的支持，该峰在生物和非生物条件下都出现在金属表面[61][73]，表明形成了腐蚀产物。在3410 cm–1附近的–OH弯曲振动归因于Fe3O4和Fe2O3的形成。这一现象还得到了877和680 cm–1处强度的支持，这些强度对应于Fe–O键的伸缩，表明了金属的腐蚀[67][74]。

如上所述，铜绿假单胞菌无菌培养物和混合培养物的结果表明，覆盖有生物膜的碳钢表面通常含有氧化铁、磷酸铁和含有官能团的EPS。这些结果与多项研究一致，这些研究也报告了类似的FTIR光谱特征[24][27][61]。这些发现共同表明，微生物生物膜含有复杂的有机和无机成分，可以影响并加速腐蚀过程。此外，Martino的研究支持了通过识别FTIR光谱中的特定官能团来确定生物膜存在的观点。EPS相关化合物通常出现在2800–3000 cm–1的红外区域（对于脂质）、1500–1800 cm–1（对于蛋白质）以及900–1250 cm–1（对于多糖和核酸）[75]。然而，FTIR在生物腐蚀分析中的一个局限性是无法区分活细胞和死细胞，而且生物膜中的高水分含量可能会干扰光谱结果[57][76]。

使用能量色散X射线光谱（EDX）分析了铜绿假单胞菌无菌培养物和混合培养物生物膜及腐蚀产物的元素组成，结果见表1和表2。碳（C）和氧（O）的存在表明形成了生物膜，而铁（Fe）和氧（O）的组合则表明存在腐蚀产物[26][27]。此外，在样品表面检测到C、O、磷（P）和Fe，特别是O、P和Fe的浓度升高，证实了生物膜和腐蚀产物（如氧化铁Fe2O3和磷酸盐化合物PO43–）的存在[77]。P和C峰的出现可能最初表明通过形成磷酸铁（Fe3(PO4)2）和碳酸铁（FeCO3）抑制了腐蚀[72][78][79][80]。因此，无论是在水相、油相还是所有相中，无论是否有生物膜，碳钢样品都显示出O、P和Fe原子的明显信号。这表明在铜绿假单胞菌无菌培养物和混合培养物中都形成了氧化铁和磷酸铁。此外，在混合培养物中C原子占主导地位，表明形成了碳酸铁。

表1. 铜绿假单胞菌生物膜和腐蚀产物的金属表面EDX分析结果。
| 时间 | 生物膜 | 油相 | 无生物膜 |
|------|------|------|------|
| 第1天 | 23.40 | 33.4 | |
| 第1天 | 57.18 | 7 | |
| 所有相 | 22.42 | 43.2 | |
| 第9天 | 59.18 | 5 | |
| 所有相 | 16.30 | 15.3 | |
| 第9天 | 18.38 | 44.0 | |
| 第21天 | 27.49 | 10.14 | |
| 第21天 | 50.35 | 69 | |
| 第21天 | 81.11 | 80 | |
| 所有相 | 46.25 | 52.6 | |
| 第21天 | 29.13 | 15.7 | |
| 第21天 | 20.49 | 92.2 | |

表2. 混合培养物生物膜和腐蚀产物的金属表面EDX分析结果。
| 时间 | 生物膜 | 混合培养物 | |
|------|------|------|------|
| 第1天 | 14.42 | 29.26 | |
| 无生物膜 | 21.05 | 83 | |
| 所有相 | 24.32 | 82.7 | |
| 第9天 | 63.14 | 60 | |
| 第9天 | 51.23 | 80 | |
| 所有相 | 43.21 | 10.54 | |
| 第21天 | 33.51 | 34.9 | |
| 第21天 | 23.82 | 20.40 | |
| 第21天 | 51.25 | 78 | |

总体而言，水相中的生物膜表面的C/O原子比高于油相。这归因于水相中营养物质更丰富且更容易被微生物吸收。然而，在溶解阶段或初始附着阶段，当生物膜发育较少时，水相中的C/O原子比较低。比较铜绿假单胞菌无菌培养物和混合培养物时，所有相中的C/O原子比在无菌培养物中始终更高，表明无菌培养物形成的生物膜更厚更密集。此外，混合培养物中的P原子含量始终高于铜绿假单胞菌培养物，无论是在有生物膜的还是无生物膜的表面。这种现象也在涉及多种微生物物种的联合培养物中观察到，这些培养物在EDX腐蚀产物中产生了大量的P[13]。这表明混合培养物由多种微生物物种组成，如铜绿假单胞菌（Pseudomonas sp.）、芽孢杆菌（Bacillus sp.）等[61]。实际上，铜绿假单胞菌属的成员已知能产生致密的氧化铁和磷酸铁矿物层[79][81]。

此外，水相中无生物膜表面的Fe/O原子比高于油相。这表明水的存在和营养物质促进了微生物的生长，从而导致碳钢的腐蚀更为严重。在所有相中，铜绿假单胞菌无菌培养物中的Fe/O原子比低于混合培养物，表明铜绿假单胞菌引起的腐蚀更为剧烈。这与无菌培养物中观察到的更高腐蚀率和总酸值（TAN）一致。尽管较低的Fe/O原子比可能表明产生了更多的腐蚀产物，有时这些产物可以形成保护层并减少腐蚀，但在这种情况下，铜绿假单胞菌的存在与氧化铁的还原性溶解有关，这种活动破坏了金属表面的钝化膜，从而促进了点蚀腐蚀的起始和传播[82]。

3.5. 生物腐蚀机制
油水界面处的生物腐蚀机制如图5所示。该示意图分为两类：非生物系统和生物系统。第1阶段代表初始条件，显示非生物系统和生物系统中都存在O2，以及生物系统中微生物定殖和生物膜形成之前的初始环境。在非生物系统的第2阶段，长时间浸泡后，腐蚀由水通过自催化反应水解酯类产生的O2和H+离子梯度引发。这种状态可以持续很长时间，主要产生腐蚀性的H+离子[61][83]。在生物系统中，情况更为复杂，因为微生物细胞开始向金属表面和油水界面迁移，开始附着并在金属基底上形成保护膜。第3阶段标志着成熟生物膜的发展。此时，腐蚀产物变得明显，出现分层的微生物结构，厌氧微生物位于好氧微生物之下。同时，胞外聚合物物质（EPS）的产生加剧。在这一阶段，好氧微生物主要占据油水界面区域。第4阶段涉及生物膜的分离，这是由于代谢废物的积累导致一些微生物细胞从生物膜基质中分散。这种分离使得金属表面的生物膜结构变得越来越不均匀。第5阶段，由于生物膜的异质性和局部电化学环境，点蚀腐蚀开始发生。最后，第6阶段描述了生物膜多样性从好氧向厌氧的转变。随着生物膜在油水界面处变厚和成熟，氧气渗透减少。因此，厌氧微生物变得更加普遍，尤其是在生物膜附近的金属界面和油箱底部氧气最少的区域。厌氧物种的增殖显著加速了均匀腐蚀和局部（点蚀）腐蚀过程[18][21][24][61][84][85][86][87]。

图5. 非生物系统和生物系统中油水界面生物腐蚀机制的示意图[61]。这一提出的机制与好氧菌和厌氧菌的相关性得到了柴油系统中观察到的微生物组成的支持。Aslan等人报告了柴油混合物污泥中的微生物群落，这与本研究中的情况相当，本研究使用了浸入B30中的碳钢上形成的混合生物膜。根据Aslan等人的研究，柴油系统中的混合微生物群落包括好氧菌和厌氧菌。链霉菌（Streptomyces sp.，占比52.65%）和嗜气芽孢杆菌（Bacillus aerophilus，占比46.83%）是主要物种，这反映了储存系统的好氧特性。这些微生物以能够降解碳氢化合物并产生胞外脂肪酶和酯酶而闻名，这些酶有助于燃料的降解。好氧微生物还可以间接创造局部厌氧环境，从而支持厌氧菌的生长。此外，还检测到了假单胞菌（Pseudomonas sp.），它与同时含有氧化铁和还原铁细菌的微生物群落相关，因此在生物腐蚀过程中起着重要作用。还检测到了几种厌氧微生物，包括Dialister sp.（占比0.02%）、Blautia sp.（占比0.02%）和Prevotella sp.（占比0.01%），它们通过酶促途径还原硫酸盐和消耗氢气来促进厌氧腐蚀过程[61]。在B30储存系统中，由于氧气通过管道和储存基础设施从周围环境扩散到生物柴油混合物中，因此维持了好氧条件。重要的是，氧气在基于碳氢化合物的燃料中的溶解度约为70 ppm，远高于其在水中的溶解度（约10 ppm）[89] [90]。这种相对较高的氧气含量使假单胞菌的纯培养物和混合培养物中的微生物能够进行有氧呼吸，其中氧气作为最终电子受体，如方程式（1）所描述的。(1) 有氧呼吸：4 H+(aq) + O2(g) + 4 e– → 2 H2O(l)(2) 生物柴油降解：RCOOCH3(l) + H2O(l) → RCOOH(l) + CH3OH(l)(3) 石油柴油降解：a CxHy(l) + b O2(g) + c H2O(l) → d RCOOH(l)(4) 有机酸降解：a RCOOH(l) + b H2O(l) → c CH1.8O0.5N0.2(s) + d R’COOH(l) + e CO2(g)(5) 有机酸解离：RCOOH(l) → RCOO–(aq) + H+(aq)(6) R’COOH(l) → R’COO–(aq) + H+(aq)(7) 过氧化物降解：H2O2(l) → H2O(l) + ? O2(g)(8) 阳极反应：Fe(s) → Fe2+(aq) + 2 e–(9) 阴极反应：4 H+(aq) + O2(g) + 4 e– → 2 H2O(l)(10) 2 H+(aq) + 2 e– → 2 H2(g)注意：R是一个烷基团生物腐蚀机制，特别是假单胞菌或混合培养物的微生物群落，涉及代谢活动和生物膜生命周期[7] [76]，如图6(a)和(b)所示。从代谢角度来看，所有微生物都具有降解B30（包括生物柴油和石油柴油）的能力，主要通过脂肪酶活性生成酸性代谢物。生物降解过程包括以下关键步骤：(1) 生物柴油成分（特别是FAME）的水解为长链有机酸；(2) 石油柴油成分的氧化为类似的长链酸；(3) 这些酸的β-氧化生成进入三羧酸（TCA）循环的中间体；(4) 通过TCA循环活动形成短链有机酸，如乙酸和乳酸；(5) 直接微生物作用导致额外的酸性副产物的积累；(6) 长链和短链有机酸的解离释放腐蚀性的H+离子[24] [91] [92]。此外，混合培养物中的碳氢化合物降解细菌通常在其代谢过程中产生过氧化物化合物，这通常由芽孢杆菌产生[38] [61]。这些过氧化物有助于将烷基链氧化为醇，然后进一步氧化为羧酸。最终，过氧化物本身在过氧化氢酶的作用下分解为水和氧气[13] [16] [93]。涉及B30降解的微生物代谢过程在方程式（2）–（7）中表示。下载：下载高分辨率图片（545KB）下载：下载全尺寸图片图6. 生物腐蚀机制的示意图：(a) 假单胞菌（Pse）的纯培养物和(b) 混合培养物（SRB：硫酸盐还原菌，SOB：硫氧化菌，APB/F：产酸菌/真菌，SFB：产粘液菌，IOB：铁氧化菌，IRB：铁还原菌）[22] [88]。同时，生物膜的形成周期加剧了腐蚀，特别是在生物膜分散（裂解）阶段。在此阶段，不均匀的生物膜脱落导致金属表面局部暴露于腐蚀性物质，促进了点蚀的发生[13] [41]。生物膜的异质性还创造了厌氧区和好氧区，以及氧气浓度梯度，导致金属表面形成局部阳极和阴极区域。因此，腐蚀过程涉及阳极和阴极反应，即：(1) Fe0的阳极氧化为Fe2+；(2) H+离子的阴极还原为H2。在好氧区，阴极反应还包括O2的还原为H2O。H+离子来源于有机酸的解离，而氧气则来自外部或过氧化物的降解[13] [41] [61]。这些腐蚀机制在方程式（8）至（10）中概述。在厌氧区，特别是混合培养物中的厌氧微生物，如Dialister sp.、Blautia sp.和Prevotella sp. [61]，具有通过脱硫作用降解有机硫化合物（RSH）和还原硫酸盐（SO42–）的代谢能力，从而产生硫化氢（H2S）。H2S的存在会促进硫化物应力开裂（SSC），即原子氢扩散到金属晶格中，重新组合成分子氢（H2），导致金属表面起泡和脆化。此外，这些厌氧菌可能通过氢化酶消耗氢气来促进腐蚀，将H2转化为H+离子，增加局部酸度并促进电化学腐蚀过程。此外，厌氧微生物还能够通过胞外电子转移（EET）机制消耗电子。EET可以通过两种主要途径发生：直接电子转移（DET），即微生物通过外膜结合的细胞色素c或导电菌毛与金属表面接触提取电子；以及介导的电子转移（MET），利用核黄素等电子穿梭蛋白促进短距离的电子传输。这些微生物活动共同增强了局部腐蚀，特别是在储存罐中典型的缺氧条件下。厌氧微生物参与的生物腐蚀机制中的生物化学和电化学反应在（16）、（17）[61] [94] [95] [96] [97] [98] [99]中表示。(11) 有机硫脱硫：a RSH(l) → b H2S(g) + c CH1.8O0.5N0.2(s) + d R’COOH (l)(12) H2S形成：SO42–(aq) + 10 H+(aq) + 8 e– → H2S(g) + 4 H2O(l)(13) H2S腐蚀：Fe(s) + H2S(g) → FeS(s) + 2 H(14) 氢原子向金属的扩散：2 H (扩散到金属) → H2(g) (金属上的气泡)(15) 氢化酶活性：H2(g) → 2 H+(aq) + 2 e–(16) 胞外电子转移：Fe(s) → Fe2+(aq) + 2 e–注意：R是一个烷基团在假单胞菌的纯培养物或混合培养物中，假单胞菌属同时具有铁氧化菌（IOB）和铁还原菌（IRB）的双重功能。此外，假单胞菌属于产粘液菌（SFB）群体，能够在好氧和厌氧环境中生存，并产生密集的胞外粘液层，部分或完全覆盖金属表面[57]。此外，假单胞菌可以利用碳氢化合物作为能源[24] [100]。作为IOB，假单胞菌可以在微好氧或好氧条件下将亚铁离子（Fe2+）氧化为铁离子（Fe3+），从而产生代谢能量。相反，作为IRB，它可以在厌氧呼吸过程中将Fe3+还原为Fe2+，并将其作为最终电子受体。这些氧化还原转化促进了金属表面的局部电化学反应，根据环境条件和生物膜结构，可能会加速或抑制腐蚀。假单胞菌的微生物铁氧化还原循环行为在生物腐蚀背景下尤为重要，因为它可能促进氧化铁的沉积或铁离子的迁移，这两种情况都会改变燃料-水-金属界面的腐蚀动态[22] [61] [77] [88] [101] [102] [103]。与这些过程相关的代谢反应在（17）、（18）、（19）中表示。(17) Fe2+的氧化：Fe2+(aq) → Fe3+(aq) + e–(18) Fe3+的腐蚀：2 Fe3+(aq) + Fe(s) → 3 Fe2+(aq)(19) Fe3+的还原：Fe3+(aq) + e– → Fe2+(aq)氧化铁是主要的腐蚀产物，这与之前在好氧柴油储存环境中的发现一致[41] [104]。在这项研究中，使用EDX和FTIR成功检测到了FeOOH、Fe2O3、Fe3O4、FeCO3和Fe3(PO4)2的存在。此外，Fe(OH)2、Fe(OH)3和FeS可能在生物腐蚀过程中形成，尽管这些特定产物在当前研究中没有直接检测到。根据结果，无论是假单胞菌的纯培养物还是混合培养物通常都产生了均匀的腐蚀产物，主要由铁氧化物和磷酸盐组成，如Fe2O3（赤铁矿）、Fe3O4（磁铁矿）、FeOOH（针铁矿/鳞铁矿）和Fe3(PO4)2（磷酸铁）。这些化合物是石油柴油储存系统中常见的腐蚀产物[93] [104]。腐蚀产物的形成过程在（20）、（21）、（22）、（23）、（24）、（25）、（26）、（27）、（28）中表示。(20) FeOOH形成：Fe(s) + ? O2(g) + ? H2O(l) → FeOOH(s)(21) Fe3O4形成：8 FeOOH(s) + Fe(s) → 3 Fe3O4(s) + 4 H2O(l)(22) Fe(OH)2形成：Fe2+(aq) + 2 H2O(l) → Fe(OH)2(s) + 2 H+(aq)(23) Fe3+形成：Fe2+(aq) → Fe3+(aq) + e–(24) Fe(OH)3形成：Fe3+(aq) + 3 H2O(l) → Fe(OH)3(s) + 3 H+(aq)(25) Fe2O3形成：4 Fe(s) + 3 O2(g) → 2 Fe2O3(s)(26) Fe3(PO4)2形成：3 Fe3+(aq) + 2 PO43– (aq) → Fe3(PO4)2(s)(27) FeCO3形成：Fe3+(aq) + CO32– (aq) → FeCO3(s)(28) FeS形成：Fe(s) + H2S(g) → FeS(s) + H2(g)3.6. 燃料降解风险使用滴定法评估了燃料降解的风险，以确定TAN值，结果如图7所示。在ANOVA分析之前使用Minitab验证了数据的正态性和方差，结果显示不同微生物处理之间的TAN值有显著差异（F值（3,4）= 53.19；P值 < 0.05），表明微生物处理对TAN值有重要影响。最初，B30浸渍前的TAN值为0.59 mg KOH/g，低于印度尼西亚允许的最大值0.6 mg KOH/g[43] [105]，表明燃料符合使用标准。在非生物条件下（1.15 mg KOH/g），观察到TAN增加了0.56 mg KOH/g，这归因于Bushnell-Haas培养基中酯类的水解，产生了脂肪酸和甲醇。该反应是自催化的，因为水解产生的H?离子进一步催化了这一过程[24] [61] [83] [106]。在生物条件下，假单胞菌的纯培养物（2.06 mg KOH/g）表现出最高的TAN值，比初始值（0.59 mg KOH/g）增加了约1.47 mg KOH/g。同样，混合培养物（1.42 mg KOH/g）也增加了0.83 mg KOH/g。这些结果表明假单胞菌对B30的亲和力更强，并且产生的有机酸更多[41]。这一发现与Baihaqi等人的先前研究结果一致，他们报告了由于假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在柴油混合物中的活动导致TAN显著增加[13]。值得注意的是，混合培养物中的TAN值高于Aslan等人和Harimawan等人之前报告的值，表明某些混合微生物群落可能具有更强的碳氢化合物降解能力[24] [41]。下载：下载高分辨率图片（88KB）下载：下载全尺寸图片图7. 非生物和生物变异下燃料降解风险的估计。如非生物变异中所观察到的，生物系统中的TAN增加也可以归因于酯类水解反应的自催化行为[106]。然而，在生物系统中，这一过程由于某些微生物分泌的脂肪酶的存在而进一步加速[107]。脂肪酶常见于各种微生物物种中，包括假单胞菌和混合培养物[108]，它们催化FAME水解为长链脂肪酸和甲醇。这些长链脂肪酸可能通过TCA循环等代谢途径进一步分解为短链有机酸，如乙酸和乳酸。一旦释放到周围介质中，长链和短链有机酸都可以解离产生H?离子，从而增加B30的TAN值。特别是短链酸的pKa值较低，导致解离程度更高，H?离子浓度更高，这在增强腐蚀速率方面起着关键作用[13] [109] [110] [111]。这表明系统中质量损失的主要原因是有机酸的积累，它们通过提高H?离子浓度促进腐蚀[96]。总体而言，生物条件下的TAN值超过了0.6 mg KOH/g的监管限制，使得B30燃料不再适合使用。柴油的降解和酸度的增加增强了燃料的腐蚀性，从而增加了燃料站储罐和车辆部件损坏的风险。此外，TAN值的增加可能导致燃料稳定性和性能的下降。因此，这些发现突显了微生物活动在燃料质量恶化中的重要作用，防止燃料储存系统中的微生物污染非常重要。3.7. 储罐损坏风险可以通过分析不同浸渍介质引起的腐蚀率来预测储罐损坏风险。腐蚀率是使用重量损失法计算的。观察到的腐蚀速率如图2所示，储罐使用寿命的估算在图8中进行了说明。根据图8，腐蚀速率的增加显著影响了储罐的使用寿命。由假单胞菌（Pseudomonas sp.）引起的腐蚀速率高于Bushnell-Haas对照组和混合培养组中的腐蚀速率。因此，暴露于假单胞菌的储罐的预计使用寿命比暴露于对照组和混合培养组的储罐更短。尽管如此，所有测试浸没条件下的预计失效时间都在燃料储罐的典型预期使用寿命范围（10-20年）之内或略高于该范围[24]，[112]。因此，本研究中评估的所有储罐（商业API 650标准）被认为适合储存B30生物柴油。根据Fontana的研究，腐蚀速率低于0.02毫米/年表示具有出色的相对耐腐蚀性，而0.02-0.1毫米/年的腐蚀速率则被归类为优秀[113]。此外，根据美国国家腐蚀工程师协会的标准，0.025-0.12毫米/年的腐蚀速率被归类为中等[114]。本研究获得的腐蚀速率属于这些有利分类，表明碳钢表现出良好的相对耐腐蚀性，适用于B30生物柴油储存系统的使用。

图8. 在非生物和生物变异条件下储罐损坏的风险估算。

在生物条件下观察到的腐蚀速率，无论是假单胞菌的纯培养还是混合培养，都一致高于非生物条件下的腐蚀速率，这突显了微生物在加速腐蚀过程中的重要作用[24]，[102]。然而，需要注意的是，这些速率是基于重量损失测量得出的，该方法最适合量化均匀腐蚀。在本研究中，均匀腐蚀是在21天的浸没期间评估的，在此期间腐蚀速率是不恒定的，这可能是由于生物膜的形成和腐蚀产物的积累造成的扩散障碍[87]。此外，众所周知，微生物会促进局部点蚀腐蚀，这种腐蚀比均匀腐蚀更难预测，并可能导致更严重的局部损伤。因为点蚀腐蚀集中在特定位置，它们可以显著缩短储罐的使用寿命[18]，[32]，[115]。

3.8. 进一步考虑

微生物影响的腐蚀（MIC）导致碳钢的均匀腐蚀速率增加，并且燃料的生物降解也加剧了这一现象，这从酸值超过标准限值得到证明（在假单胞菌和混合培养中都有体现）。此外，两种微生物培养中的微生物生长都可能引发点蚀腐蚀，这一过程在水相中发生得更快。因此，研究B30储存系统的腐蚀控制策略至关重要，特别是通过使用腐蚀抑制剂[88]，[116]或保护涂层[8]，[117]。此外，由于纳米粒子具有独特的物理化学性质，包括高表面积、增强的反应性和抑制微生物生长的毒性，因此它们作为有效的抗菌剂受到了广泛关注[118]，[119]。例如，基于生物聚合物的纳米粒子（如壳聚糖）和基于金属氧化物的纳米粒子（如ZnO）已被广泛报道具有温和的抗菌活性[119]，[120]。这突显了纳米粒子作为生物腐蚀抑制剂的潜力。

本研究使用的最大浸没时间为21天，腐蚀速率值的计算假设腐蚀速率是线性的。实际上，腐蚀速率并不是线性的，并且会随时间变化，这可能是由于金属表面形成了诸如腐蚀产物和生物膜这样的层。这层物质有可能抑制腐蚀，因为它可以阻止氧气向金属表面的扩散。因此，在进一步的研究中，需要增加浸没时间（例如到90天），以获得更准确的数据并反映更真实的情况。

所有变体的预计储罐使用寿命都超过20年，这是储罐的平均设计寿命。这是因为估算仅基于均匀腐蚀速率进行的。实际上，当发生生物腐蚀时，腐蚀不仅表现为均匀腐蚀，还表现为点蚀腐蚀。先前的研究报告称，带有B. licheniformis微生物的B30储罐的点蚀腐蚀速率要高得多，达到1.04毫米/年[18]，[32]。这个值可能导致储罐的使用寿命显著缩短至20年以下，具体范围为2.9-10年[18]，[32]，[112]。这表明研究点蚀腐蚀速率也很重要。因此，需要进一步研究点蚀深度的识别，以测量点蚀腐蚀速率。

尽管本研究采用了固定的初始接种浓度（10^6 CFU/mL）以确保在实验时间内可重复地建立生物膜，但微生物负荷的变化可能会影响腐蚀行为。不同的接种密度可能会影响生物膜的生长速率、密度和形态、有机酸的产生以及营养物质的消耗，从而影响腐蚀动力学和行为[121]，[122]。因此，未来需要研究不同接种负荷对生物柴油混合物系统中微生物密度和腐蚀严重程度的影响。

在这项研究中，生物腐蚀现象是基于TPC分析、重量损失测量、FTIR、SEM和TAN结果来研究的。建议改进分析方法以更好地理解生物腐蚀现象。例如，进一步的研究应该专注于量化B30储罐中微生物形成的生物膜。生物膜定量方法，如结晶紫测定法，将能够准确测量并深入分析生物膜发展与生物腐蚀之间的关系[123]。此外，除了TAN值之外，未来的研究还应分析暴露前后的燃料特性，包括FAME组成和水分含量。此外，还建议结合电化学技术[124]，[125]，[126]，如电化学阻抗谱（EIS）、线性极化电阻（LPR）、开路电位（OCP）和电位动态极化，以提供油水界面腐蚀动力学的时间分辨洞察。尽管生物柴油混合物的低电导率带来了技术挑战，但为界面系统专门设计的改进电化学装置有可能提供更详细的生物腐蚀现象机制评估。这些方法将通过评估由于生物膜形成和微生物活动而产生的电化学行为来补充重量测量。此外，进一步的工作应强调确认厌氧微生物活动在混合培养系统中的潜在作用，并研究严格厌氧系统。尽管本研究没有直接进行与厌氧机制相关的分析，但由于生物膜在油水界面区域的存在，氧梯度可能会创造支持兼性或厌氧过程的局部微环境。未来结合严格厌氧系统和分析方法（如硫酸盐测试、氧化还原电位和H2S[127]，[128]的工作将提供关于生物腐蚀现象中厌氧机制的更清晰见解。使用先进的成像技术（如共聚焦激光扫描显微镜[CLSM] [129]）测量生物膜厚度，并结合生化EPS测定[130]，将能够更准确地评估生物膜的结构特性及其对腐蚀动力学的影响。此外，识别混合培养中的微生物种类及其分布也是必要的。确定主导和功能性物种可以阐明微生物在生物膜形成、成熟和代谢产物产生中的具体作用，这些因素有助于加强表面附着并加速腐蚀过程[22]。

4. 结论

本研究在模拟储罐条件下，调查了假单胞菌和混合培养对B30暴露碳钢在油水界面处的生物腐蚀现象的影响。研究表明，假单胞菌和混合培养分别导致了3.16×10^-2毫米/年和2.15×10^-2毫米/年的显著均匀腐蚀，分别是对照组的三倍和两倍。这种升高的腐蚀速率突显了碳钢储罐使用寿命和结构可靠性的潜在降低。此外，燃料降解表现为酸值的升高，分别为2.06毫克KOH/克和1.42毫克KOH/克，超过了对照组和标准限值，威胁到了燃料质量。微生物生长和腐蚀现象主要发生在水相而不是油相中，表明这一区域对于故障的发生特别关键。金属表面形成了两层，即生物膜（上层）和腐蚀产物（下层）。在生物膜中检测到了水、蛋白质、多糖和脂质，而腐蚀产物则检测到了氧化铁和磷酸铁。

应当注意的是，这项研究是在短期静态暴露条件下进行的。因此，需要在动态和工业储存条件下进一步研究生物腐蚀的长期行为。未来的研究应采用额外的先进技术（电化学方法、生物膜定量、生化测定、微生物多样性分析、厌氧活性量化等），以更好地理解生物腐蚀现象。对于长期研究，重要的是超越传统的实验方法，发展整合微生物学、化学和电化学数据的预测框架来评估腐蚀风险。此外，涉及长时间暴露和混合微生物群落的研究对于更好地模拟实际条件并捕捉局部腐蚀现象（如点蚀的起始和传播）至关重要。从工程角度来看，实施实时监测技术来监测微生物活动、生物膜形成和腐蚀进展对于早期检测和预防性维护至关重要。此外，开发先进的缓解方法，包括腐蚀抑制剂和保护涂层（尤其是纳米材料形式），为提高耐腐蚀性和系统可靠性提供了有希望的途径。总体而言，需要一种多学科的方法，结合实验研究、预测建模和先进的监测技术，以有效预测和缓解与生物柴油相关的系统故障。

**作者贡献声明**

Nadia Ijkri Aulia：撰写——原始草稿、可视化、调查、形式分析、数据管理。
Christian Aslan：撰写——原始草稿、可视化、调查、形式分析、数据管理。
Byan Baihaqi：撰写——原始草稿、可视化、调查。
Hary Devianto：撰写——审阅与编辑、监督、方法论。
Ardiyan Harimawan：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目管理、方法论、资金获取、概念化。

**关于写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明**

在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT来提高手稿的英语语言质量。使用该服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。