Diallyl Trisulfide Activates Nrf2 by Promoting S-sulfhydration of Keap1 to Attenuate Acute Hypobaric Hypoxia-Induced Lung Injury 大蒜素三硫醚（DATS）通过促进Keap1的S-巯基化激活Nrf2减轻急性低氧性缺氧诱导的肺损伤

《Phytomedicine》：Diallyl Trisulfide Activates Nrf2 by Promoting S-sulfhydration of Keap1 to Attenuate Acute Hypobaric Hypoxia-Induced Lung Injury

　　

背景：由快速进入高原引发的急性肺损伤（ALI）是高海拔医学中的一项重大临床挑战。其病理进程主要由过度的氧化应激及随后诱导的铁死亡（ferroptosis）所驱动。 目的：本研究旨在探讨大蒜中的天然含硫化合物二烯丙基三硫醚（DATS）在减轻急性低氧性缺氧诱导的急性肺损伤中的治疗潜力。 方法：在体内，研究人员首先利用多种急性缺氧小鼠模型初步探究了DATS的抗缺氧功效，并在急性高海拔缺氧大鼠模型中进一步检测了其针对肺损伤的保护作用。在体外，评估了DATS在氯化钴（CoCl2）诱导的缺氧条件下，以及在铁死亡诱导剂Erastin或线粒体抑制剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理下，对人肺动脉微血管内皮细胞（HPMECs）的细胞保护作用。此外，使用凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1（Nec-1）作为附加对照，证实DATS的抗铁死亡作用是特异性的，并非由其他细胞死亡途径介导。同时，在体内外均使用了Nrf2抑制剂ML385，以确认Nrf2是DATS调控铁死亡和减轻肺损伤的关键介质。最后，通过体外研究阐明了DATS修饰Keap1关键半胱氨酸残基从而导致Nrf2核易位和激活的分子机制。 结果：体内实验表明，DATS显著延长了急性缺氧小鼠的生存时间，改善了暴露于低气压缺氧环境的大鼠异常的血液气体参数，并减轻了组织病理学肺损伤。体外实验显示，DATS显著增强了细胞活力，有效恢复了细胞内氧化应激稳态，并抑制了脂质过氧化和铁积累。从机制上讲，DATS显著增加了H2S和总蛋白巯基化水平，并特异性诱导了Keap1蛋白在半胱氨酸151（Cys151）处的巯基化。这种修饰破坏了Keap1-Nrf2的相互作用，从而稳定了Nrf2蛋白并促进其核易位。随后，核内Nrf2激活了包括GPX4和xCT在内的下游抗氧化基因的表达，恢复了谷胱甘肽稳态，抑制了脂质过氧化和铁积累，最终抵消了铁死亡过程。 结论：DATS通过S-巯基化Keap1、激活Nrf2通路、增强细胞抗氧化防御能力，有效抑制铁死亡，从而保护机体免受急性低气压缺氧诱导的肺损伤。

该论文题为《Diallyl Trisulfide Activates Nrf2 by Promoting S-sulfhydration of Keap1 to Attenuate Acute Hypobaric Hypoxia-Induced Lung Injury》，发表于《Phytomedicine》。此项研究聚焦于急性低气压缺氧诱导的肺损伤（ALI），这是一种在高海拔地区快速上升时常见的严重临床病症，其病理特征主要表现为过度的氧化应激和铁死亡。尽管氧化应激和炎症反应被认为是高原病的主要诱因，但目前针对此类肺损伤仍缺乏特异性的治疗策略。近年来，铁死亡作为一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，在缺氧性肺损伤中的作用日益受到关注，特别是肺微血管内皮细胞的铁死亡被认为是导致血管通透性增加和肺水肿的早期关键事件。核因子E2相关因子2（Nrf2）作为细胞抗氧化反应的主调控因子，其激活状态决定了细胞抵抗铁死亡的能力。与此同时，硫化氢（H₂S）作为第三种内源性气体递质，通过蛋白质巯基化（S-sulfhydration）修饰在维持细胞氧化还原稳态中扮演重要角色。然而，传统的无机H₂S供体由于释放不可控而存在毒性风险。二烯丙基三硫醚（DATS）作为一种源自大蒜的天然有机硫化合物，被认为是一种理想的内源性H₂S缓释供体。本研究旨在阐明DATS是否通过调控H₂S/Keap1/Nrf2信号轴，抑制铁死亡从而减轻急性低氧性肺损伤。

为实现上述目标，研究人员采用了多项关键技术方法。在体内实验中，研究人员构建了多种急性缺氧小鼠模型（包括常压闭室实验和低气压缺氧挑战）以及急性高海拔缺氧大鼠模型，以评估DATS的整体保护效应及改善血气参数的能力。研究人员还使用了Nrf2特异性抑制剂ML385进行干预，以验证Nrf2在DATS保护作用中的必要性。在体外实验中，研究人员培养了人肺动脉微血管内皮细胞（HPMECs），并利用氯化钴（CoCl₂）模拟缺氧环境，同时使用铁死亡诱导剂Erastin和线粒体抑制剂CCCP进行处理。为了排除其他细胞死亡途径的干扰，研究人员还设置了凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1（Nec-1）对照组。此外，通过生化分析检测了H₂S水平、总蛋白巯基化程度以及特定位点（Keap1 Cys151）的巯基化修饰情况。

研究结果显示：

DATS Significantly Enhances Hypoxia Tolerance, Improves Pulmonary Gas Exchange, and Alleviates Hypobaric Hypoxia-Induced Lung Injury

通过对急性缺氧小鼠模型的观察，研究人员发现不同剂量的DATS均能显著延长小鼠的平均生存时间。在急性低气压缺氧挑战中，DATS有效延长了缺氧耐受时间，并改善了大鼠的血液气体参数（如PaO₂、SaO₂）。组织病理学分析进一步证实，DATS减轻了肺泡结构破坏、炎性浸润及肺水肿，表明DATS能有效增强机体对低氧环境的耐受性并减轻肺部损伤。

In vitro cytoprotection and inhibition of ferroptosis

在体外细胞实验中，DATS显著提高了CoCl₂诱导的缺氧HPMECs的细胞活力。机制研究表明，DATS有效逆转了由缺氧或Erastin诱导的细胞内活性氧（ROS）水平升高、脂质过氧化产物丙二醛（MDA）积累以及细胞内铁离子的过载。通过对比实验证实，DATS的保护作用不能被Z-VAD-FMK或Nec-1阻断，但能被铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）阻断，这证实了DATS的作用靶点在于铁死亡而非凋亡或坏死性凋亡。

Mechanism: DATS activates Nrf2 via Keap1 S-sulfhydration

深入的机制探索揭示，DATS处理显著提升了细胞和大鼠体内的H₂S浓度及总蛋白巯基化水平。质谱分析和免疫沉淀实验证明，DATS特异性地诱导了Keap1蛋白在第151位半胱氨酸（Cys151）发生S-巯基化。这种翻译后修饰破坏了Keap1与Nrf2之间的结合，导致Nrf2蛋白稳定性增加并发生核易位。核内的Nrf2进而启动下游靶基因GPX4和xCT的转录，恢复谷胱甘肽（GSH）稳态，从而抑制脂质过氧化和铁积累，最终阻断铁死亡进程。当使用Nrf2抑制剂ML385后，DATS的保护作用被显著削弱，进一步验证了Nrf2在此通路中的核心地位。

在讨论部分，研究人员指出，急性低气压缺氧诱导的高海拔肺损伤发病机制复杂，现有治疗手段有限。本研究首次证明了DATS作为一种天然的H₂S缓释供体，能够通过释放H₂S介导Keap1的巯基化，从而激活Nrf2信号通路。这一发现不仅揭示了植物源有机硫化合物对抗高海拔肺损伤的新机制，也为开发靶向H₂S信号通路的治疗药物提供了实验依据。研究结论部分强调：DATS通过H₂S介导的Keap1 S-巯基化激活Nrf2通路，抑制铁死亡，从而缓解低气压缺氧诱导的肺损伤。这些发现为防治高原肺水肿提供了新的思路和潜在的药物靶点。