苦痘病（Bitter pit, BP）发生机制：转录组与不同组织细胞的分析证据

《Plant Physiology and Biochemistry》：Bitter pit disorder development: Evidence from transcriptomic and cellular analysis in different tissues

　　

苦痘病（Bitter Pit, BP）是一种导致苹果产业显著损失的非生物胁迫生理失调症，其确切发病机制尚未完全阐明。本研究对健康果肉（FH）、病变与健康交界区果肉（FB）、病变果肉（FD）、健康果皮（PH）及病变果皮（PD）进行了转录组分析。结果显示，差异表达基因（DEGs）主要富集于程序性细胞死亡（PCD）、钙信号与运输、细胞壁降解、呼吸作用及氧化还原过程。赤霉素（GA）、茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）、细胞分裂素、生长素、油菜素内酯及乙烯的信号转导通路亦参与其中。其中，生长素信号通路相关DEGs在FD中显著上调。WRKY、MYB、bZIP及NAC转录因子可能在BP形成中起关键调控作用。FD与FB、FD与FH比较组中DEGs的不同倍数变化暗示了BP发育过程中局部与长距离响应的协调。荧光染色、透射电镜（TEM）及DNA梯带结果表明PCD可能发生于BP发育期。响应脱水蛋白-21（RD21）及基因MdCEPI-1、MdCEPI-2在FD和PD中表达较高，而MdDAD1-1与MdDAD-2在FD中显著下调。分别编码细胞色素P450、角鲨烯环化酶及谷胱甘肽S-转移酶的基因被鉴定为BP发育的潜在候选基因，这归因于其在苦味物质生物合成及胁迫相关细胞死亡通路中的已知功能。此外，在果皮与果肉组织中，病变样品均表现出活性氧（ROS）的积累增加。

论文解读：苦痘病发生机制的转录组与细胞学解析

研究背景与意义

苦痘病（Bitter Pit, BP）是苹果生产中的一种严重生理性病害，主要表现为果实萼端附近的表皮凹陷及皮下组织坏死，呈木栓状，极大地降低了果实的商品价值和经济收益。尽管前人研究已建立了BP与钙（Ca）吸收分布、植物激素失衡及细胞壁结构改变之间的联系，但其精确的分子调控网络仍不完整。特别是关于程序性细胞死亡（PCD）是否参与BP进程，以及病灶核心、过渡区与健康组织之间的空间响应协调机制尚不明确。为此，西北农林科技大学的Yali Li、Yuduan Ding等研究人员选取高度易感品种‘蜜脆’（Honeycrisp）为试材，通过多组织（果肉与果皮的健康区、过渡区及病变区）的转录组联合细胞学分析，旨在揭示BP早期发生的分子与细胞事件。该研究成果发表在《Plant Physiology and Biochemistry》期刊上。

关键技术方法概述

研究人员于2020年8月在中国陕西凤翔县果园采集‘蜜脆’苹果，选取具典型BP症状的果实，将组织精细划分为健康果肉（FH）、病变边缘果肉（FB）、病变中心果肉（FD）、健康果皮（PH）及病变果皮（PD）。利用RNA测序技术对各组织进行转录组测序，结合生物信息学分析差异表达基因（DEGs）及其参与的GO功能与KEGG通路。在此基础上，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证PCD相关基因表达；利用伊文思蓝（Evans blue）和DAPI染色观察细胞膜完整性及细胞核形态；通过透射电子显微镜（TEM）观察亚细胞结构变化；测定活性氧（ROS）含量及相关抗氧化酶活性；并通过蛋白提取与电泳检测RD21酶活性及DNA梯带（DNA ladder）。

研究结果

1. 苦痘病苹果不同组织的RNA测序与分析

转录组测序共获得高质量数据，相关性分析与主成分分析（PCA）证实了采样重复性及不同组织间转录组的显著差异。研究发现，随着取样位置向病变区域靠近，DEGs数量逐渐增加，其中FD与FH比较组差异基因最多（6197个）。GO与KEGG富集分析表明，DEGs主要富集于细胞识别、细胞壁、氧化还原酶活性、植物激素信号转导及谷胱甘肽代谢等关键生物学过程与通路。

2. 苦痘病关键代谢过程相关DEGs

聚类分析显示，亚群2中的基因在FD中表达最高，包括细胞色素P450、硫解酶、角鲨烯环化酶及谷胱甘肽S-转移酶等关键基因。研究人员筛选出WRKY、MYB、bZIP和NAC家族的转录因子，发现它们在FD中显著上调，可能与激素响应、细胞壁代谢及氧化还原平衡的调控密切相关。热图分析进一步揭示了钙信号与运输、细胞壁降解、呼吸代谢及氧化还原相关基因在病变组织中的普遍上调趋势。

3. 不同组织中PCD相关基因、RD21活性及DNA梯带

qRT-PCR结果显示，PCD执行基因MdCEPI-1和MdCEPI-2的表达量从健康到病变组织逐渐升高，而防御细胞死亡基因MdDAD1-1和MdDAD-2则显著降低。酶活性测定显示，病变组织中的RD21活性显著高于健康组织。DNA梯带实验证实，病变组织（PD和FD）中存在明显的DNA断裂现象，这是PCD的典型生化特征。

4. PCD可能发生在苦痘病进程中

细胞学观察提供了直接证据。伊文思蓝染色显示FD细胞丧失膜选择性渗透性；DAPI染色显示FD细胞核固缩、密度降低；石蜡切片和透射电镜（TEM）观察发现，FD细胞结构紊乱、液泡塌陷、细胞器肿胀且数量减少，这些形态学特征均符合PCD的特征。

5. 病变组织中活性氧积累增加

生理指标测定表明，病变果肉中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性升高，伴随超氧阴离子（O₂^?–）和丙二醛（MDA）含量的显著增加。在果皮组织中，病变组织的SOD、过氧化氢（H₂O₂）水平也高于健康组织，表明ROS爆发与氧化应激失衡是BP发生的重要生理基础。

讨论与结论总结

讨论部分

研究人员构建了BP发生的分子模型。早期钙信号与激素平衡（尤其是生长素信号）的扰动启动了空间响应，随后由WRKY、MYB等转录因子整合信号并激活下游代谢。细胞壁降解酶（如扩张蛋白EXP、果胶酯酶PE）的上调导致细胞壁解体，呼吸代谢相关基因（如AOX、PFK）的改变影响能量状态与钙运输，而氧化还原系统的失衡则驱动了PCD的执行。研究指出，Auxin相关DEGs的富集最为显著，暗示生长素信号在BP中的核心地位。此外，细胞色素P450等基因的差异表达可能同时关联苦味物质的合成与细胞死亡。

结论部分

该研究通过多组织转录组与细胞学联合分析，系统描述了BP的发育过程。研究鉴定了参与PCD、钙信号与运输（CNGC1, CAM）、细胞壁降解（EXP, PE, PL）、呼吸代谢（AOX2, PFK5, ACLA-1）及氧化还原的关键DEGs。多种激素（GA, JA, SA, ABA, 细胞分裂素, 生长素, 油菜素内酯, 乙烯）信号通路均涉及BP进程。WRKY、MYB、bZIP和NAC转录因子可能发挥调控作用。细胞学证据表明PCD确实发生于BP发育中，表现为MdCEP1-1和MdCEP1-2上调及MdDAD1-1和MdDAD1-2下调，并伴有RD21活性升高与DNA梯带形成。病变组织ROS积累加剧。细胞色素P450、角鲨烯环化酶及谷胱甘肽S-转移酶被确定为潜在的候选基因，未来需进一步验证其功能。