试验设计与安全性方案修订。A和B部分，试验方案…… 开放获取

《Cancer Research Communications》：Trial design and protocol amendment for safety. A and B, Trial schema o... Open Access

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摘要



目的：这项随机化的I/II期临床试验（NCT03617328）旨在测试系统性CD27激动剂抗体（varlilumab）与黑色素瘤疫苗联合使用是否安全，并能增强疫苗的免疫原性。



患者与方法：确诊为高风险黑色素瘤的成年人被随机分配接受针对CD4+ T细胞的共享抗原疫苗（6种黑色素瘤辅助肽；6MHP），同时分别接受或不接受系统性varlilumab治疗，疗程为11周。在第25周给予最后一次疫苗以评估记忆反应。



结果：共有33名参与者在两个中心接受了治疗。在招募了17名参与者后，由于单独使用疫苗出现了剂量限制毒性（DLT），需要修订方案以减少局部毒性。总体而言，A组和B组的DLT发生率分别为6%（1/17）和31%（5/16）。20名（61%）参与者在体外检测出CD4+ T细胞反应。在A组中有2名（2/14，14%）参与者持续表现出反应，在B组中有1名（1/16，6%）参与者持续表现出反应。在A组中有2名（2/13，15%）参与者检测出记忆反应，在B组中有4名（4/16，25%）参与者检测出记忆反应。在A组中，循环中的CD4+ T细胞数量显著减少。A组和B组的4年无病生存率分别为20% [95%置信区间（CI），6%–67% 和 69%（95% CI，49%–96%）。



结论：联合治疗未观察到协同毒性。无论是否使用varlilumab，免疫原性的持久性相似。varlilumab导致的循环CD4+ T细胞减少可能削弱了疫苗诱导肿瘤特异性CD4+ T细胞的效果。记忆反应的诱导支持进一步研究，以优化共享抗原疫苗与其他免疫疗法的联合使用。



意义：6MHP疫苗与varlilumab的联合治疗是安全的，但并未提高CD4+ T细胞的反应率。varlilumab导致循环CD4+ T细胞减少，而未使用varlilumab时临床结果有所改善。本研究证明了共享抗原疫苗能够诱导记忆反应；然而，CD27激动作用并未增强反应的持久性。



引言



免疫检查点抑制剂（ICI）通过阻断T细胞上的检查点分子来促进肿瘤控制，从而重新建立激活信号。相比之下，关于促进T细胞激活和存活以支持抗肿瘤反应的共刺激分子（包括CD27）的研究较少。在临床前模型中，CD27激动作用降低了CD8+ T细胞的PD-1表达（1），并与抗PD-1抗体联合使用增强了T细胞激活（2）。此外，CD27激动作用增加了循环中的CD4+和CD8+ T细胞数量，并增强了IFNγ的产生（3），并促进了CD4+效应T细胞对自身抗原的反应（4）。在早期的临床试验中，一种激动剂抗CD27抗体（varlilumab，Celldex Therapeutics）是安全的，减少了循环中的调节性T细胞（Treg），并倾向于增加具有效应记忆表型的循环CD4+ T细胞的比例，并且无论是单独使用还是与抗PD-1疗法联合使用都显示出临床活性（5, 6）。CD27激动作用与癌症疫苗的联合使用在临床前模型中显示出潜力（7, 8）；然而，在人类中的研究仍然有限。在一项针对胶质瘤患者的初步研究中，系统性varlilumab与针对CD8+和CD4+ T细胞的肿瘤相关抗原疫苗联合使用是安全的，并诱导了效应记忆T细胞反应（9）。早期癌症疫苗主要针对CD8+ T细胞，但现在认识到CD4+ T细胞在抗肿瘤免疫中也起着重要作用（10）。我们报告了一种由六种肿瘤相关II类MHC限制抗原（6种黑色素瘤辅助肽；6MHP）组成的疫苗具有免疫原性，并且无论是单独使用（11, 12）、与抗PD-1疗法联合使用（13），还是与也针对CD8+ T细胞的疫苗联合使用（14–16）都具有临床活性。在一些先前的试验中，我们发现对6MHP有外周免疫反应的患者比没有免疫反应的患者临床结果更好（12, 14）。然而，许多患者的循环T细胞反应是短暂的。因此，需要了解癌症疫苗是否能诱导T细胞记忆，以及针对T细胞上的共刺激分子是否能够增强免疫反应的持久性。鉴于CD27激动作用在T细胞记忆生成中的作用（17），我们研究了CD27共刺激对6MHP引起的CD4+ T细胞反应持久性和6MHP记忆回忆反应的影响。我们报告了一项开放标签、随机化的I/II期临床试验（NCT03617328）的结果，该试验旨在测试6MHP单独使用或与系统性varlilumab联合使用的安全性和免疫原性。我们假设CD27激动作用与辅助肽疫苗联合使用是安全的，这种治疗组合将增强外周CD4+ T细胞的持久性并减少Tregs，并且疫苗将诱导记忆T细胞反应。



患者与方法



该试验得到了弗吉尼亚大学主要机构审查委员会（IRB）的批准（HSR-IRB# 20085），并在第二个参与机构（弗吉尼亚联邦大学）接受了方案及其所有修订案的认可。该试验已在Clinicaltrials.gov上注册（NCT03617328），并获得了FDA的批准（IND# 10825）。所有参与者在参与前都签署了书面知情同意书。试验遵循良好的临床实践伦理原则和适用的美国法规。



患者



至少18岁的患者有资格在两个学术中心参加试验，前提是他们患有新诊断或复发的美国癌症联合委员会（AJCC，第八版）IIB至IV期黑色素瘤，这些黑色素瘤起源于皮肤、黏膜、眼睛或未知原发部位，并且在过去的6个月内临床上无疾病迹象。如果通过DecisionDx或DecisionDx-UM（Castle Biosciences）的基因表达分析被认为是高风险的，那么患有IIA期皮肤或眼部黑色素瘤的患者也有资格参加。排除标准包括在注册前12周内使用ICI，或在注册前4周内使用化疗、放疗、靶向治疗或免疫调节药物。完整的资格标准见方案（补充文件S1）。



研究设计



参与者被1:1随机分配接受一系列6MHP疫苗加varlilumab（A组）或仅接受6MHP（B组）。随机化过程中未使用分层因素。疫苗由六种合成肽（每种200 μg；参考文献11）和0.9 mg的Toll样受体3激动剂poly-ICLC（Hiltonol，Oncovir）混合制备，并用不完全弗氏佐剂（IFA；Montanide ISA-51，Seppic, Inc.）乳化。原始研究设计（图1A）进行了修订（图1B），以减少局部剂量限制毒性（DLT）。按照原始方案入组的参与者共接受了七次疫苗注射，包括前三次每周一次的初次剂量，随后在第11周前进行三次加强剂量，最后在第25周进行一次加强剂量。按照修订后的方案入组的参与者共接受了五次疫苗注射，包括前三次每周一次的初次剂量，然后在第5周和第25周各进行一次加强剂量。两种方案中的最后一次加强剂量均不包含poly-ICLC。所有疫苗均在同一皮肤部位注射，采用半皮下/半皮内注射（原始方案）或仅皮下注射（修订方案）。A组的参与者从疫苗开始（第0周）到第11周每5至6周接受三次3 mg/kg的varlilumab静脉注射。按照原始方案，在第3周和第12周采集外周血样进行免疫分析；按照修订后的方案，仅在第3周采集样本。图1。查看大图。下载幻灯片。



试验设计与安全性方案修订。A和B，方案修订前后的研究干预措施（A）和（B）超过DLT阈值后的情况。除第25周外，所有时间点的疫苗佐剂中均包含poly-ICLC，用虚线箭头表示。在接种疫苗和/或varlumab治疗前采集血液样本。C，CONSORT流程图。ID，皮内；IV，静脉；SQ，皮下。



主要终点



主要终点是疫苗的安全性，以及确定系统性varlumab添加到疫苗方案中是否能够提高外周CD4+ T细胞反应的持久性。次要终点包括评估记忆CD4+ T细胞反应、不同治疗组中循环Tregs的变化以及疫苗部位微环境（VSME）中Tregs的变化。探索性终点包括评估对疫苗的IgG抗体反应和评估临床结果。疫苗部位活检的分析将另行报告。



安全性评估



在每次研究访问时，根据参与者的毒性日记、参与者访谈以及研究临床医生的临床实验室测试结果来评估不良事件（AE）。AE使用国家癌症研究所不良事件通用术语标准v5.0进行评估。被认为与治疗明确相关、可能相关或有可能相关的AE被视为治疗相关AE（TRAE）。DLT定义为符合以下标准的TRAE：≥2级的眼部毒性（夜盲、视神经乳头水肿或视网膜病变，或视力下降超过5天，闪光或飞蚊症），≥2级的伴有呼吸急促的症状性肺炎超过5天，≥2级的过敏/自身免疫反应，或任何≥3级的毒性，包括免疫相关AE。以下高级别（≥3级）AE被排除在DLT标准之外：由于局部抗肿瘤反应引起的≤7天的3级炎症，直径≤2厘米的溃疡性3级注射部位反应，伴有坏死、红斑≤20厘米、硬化/肿胀≤20厘米的3级疫苗并发症，不代表过敏/过敏性反应的3级或4级输液反应且可以安全地重新开始输液以继续治疗，3级或4级淋巴细胞减少但在最后一次varlumab给药后28天内改善至≤3级或减少至基线水平的20%，持续≤7天的3级中性粒细胞减少或4级中性粒细胞减少，以及无论是否接受治疗在48小时内缓解至≤1级的3级恶心、呕吐或腹泻。试验的停止规则是根据方案中描述的疫苗或varlumab单独使用时预期的DLT率设计的（补充文件1）。



T细胞反应的评估



通过体外IFNγ ELISpot测定法评估外周血单核细胞（PBMC）对6MHP的反应（18）。简要来说，可冷冻保存的PBMC解冻后，以每个孔200,000个活细胞的数量接种，并用六种肽（每种肽10 μg/mL）进行四次脉冲处理。阴性对照为无肽和来自HIV gag蛋白的无关短肽和长肽（每种10 μg/mL）。阳性对照为病毒肽混合物（CEF肽池2 μg/mL）和佛波尔肉豆蔻酸酯-伊诺霉素及植物血凝素。使用自动平板读取器（Bioreader；Biosys）读取平板结果。通过流式细胞术计算每100,000个CD4+ T细胞中的CD3+CD4+细胞比例来计算响应细胞的数量。通过计算两名正常供体对CEF肽池的反应的Interassay系数（CV）来评估检测的一致性。对于高响应者，CV为18%（平均240个斑点/100,000个细胞）；对于低响应者，CV为32%（平均16个斑点/100,000个细胞）。在每个时间点，使用以下定义评估IFNγ ELISpot测定中的T细胞反应（是/否）：Nvax = 对疫苗肽有反应的T细胞数量，Nneg = 对最大阴性对照有反应的T细胞数量，Rvax = Nvax/Nneg。阳性反应（Rsp）需要满足以下所有条件：(i) Nvax超过Nneg至少20/100,000个CD4+ T细胞（0.02%），(ii) (Nvax ? 1 SD) > (Nneg + 1 SD)，以及(iii) 疫苗接种后的Rvax是接种前的Rvax的至少5倍。连续的免疫反应测量表示为倍数增加，需要满足所有反应条件（i–iii），并用Rvax表示。将最大阴性对照值设为0.2个斑点/100,000个CD4+ T细胞，以避免在计算倍数增加时出现除以零的情况。将<1的折叠增加值设定为1，以表示无反应，并防止调整后的折叠增加值超过接种前比率<1，同时不影响反应的判定。定义了不同的反应类型，以提供一个分析框架，用于评估多次血液采样中的免疫原性，并重点关注功能性回忆反应，以表征T细胞记忆。持久性反应（dRsp）要求在12周内的两个连续时间点都有反应。持续性反应（pRsp）要求有dRsp以及在18周和/或25周有反应。记忆反应（mRsp）定义为在12周有反应，并且在25周接种加强剂后26周的反应至少是接种前25周任何反应性的两倍。对于pRsp和mRsp终点，由于DLTs或疾病复发而停止治疗的参与者，如果没有可评估的样本，则被视为反应失败。

当可冷冻保存的PBMCs解冻用于ELISpot检测时，还通过流式细胞术评估了200,000个细胞，以评估随时间变化的循环T细胞群体，如前所述（18）。简而言之，使用Live/Dead Aqua活力标记物（Thermo Fisher Scientific #L34965）以1:600的比例在4°C下处理30分钟，以区分活细胞和死细胞。用于表面染色的抗体包括：CD3 V450（BD Biosciences #560365；RRID: AB_1645570）、CD8 PerCP（BioLegend #301030；RRID: AB_893421）、CD4 FITC（BD Biosciences #555346；RRID: AB_395751）、CD25 PE（Thermo Fisher Scientific #12-0257-42；RRID: AB_2043825）、CD127 R718（BD Biosciences #566967；RRID: AB_2869977）、CD14 PE/Dazzle（BioLegend #302270；RRID: AB_2832581）和CD19 Spark NIR 685（BioLegend #302270；RRID: AB_2832581）。所有抗体都在染色条件下进行了滴定，以获得最佳浓度，表面染色在4°C下进行45分钟。使用eBioScience FoxP3 Fix/Perm Kit（Thermo Fisher Scientific #00-5523-00）在表面染色后对FoxP3和Ki67进行染色。细胞在4°C下固定30分钟，然后用随附的缓冲液渗透，然后洗涤并染色FoxP3 APC（Thermo Fisher Scientific #17-4776-42；RRID: AB_1603280）和Ki67 BV750（BioLegend #350536；RRID: AB_2910400），随后在4°C下孵育45分钟。细胞在Aurora Borealis 5激光流式细胞仪（Cytek）上采集，数据用FCS Express（De Novo Software）进行分析。Tregs被定义为CD3+CD4+CD25hiCD127lo/?FoxP3+（补充图S1）。

对6MHP池的IgG抗体反应通过ELISA进行评估，如前所述（18）。简而言之，疫苗肽在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释，并在4°C下过夜孵育。HIV gag肽用作阴性对照。然后将平板用含有0.1% Tween 20的磷酸盐缓冲盐水（TPBS）洗涤，并用5%脱脂干牛奶在TPBS中封闭，在室温下孵育2小时。参与者的血清在含有2%正常山羊血清的TPBS检测缓冲液中以四倍稀释系列制备，从1:100开始，在4°C下过夜孵育。两名健康捐赠者的血清用作阴性对照，两名先前参加6MHP疫苗试验（NCT02425306；IRB #17680）的参与者，其已知对6MHP有IgG抗体反应的血清用作阳性对照。然后用TPBS洗涤平板，在加入二次抗体（山羊抗人IgG AP结合物，Southern Biotech；RRID: AB_2795643）后在室温下孵育1小时。然后用TPBS洗涤平板，并加入AttoPhos底物（Promega，Fisher Scientific），在黑暗中室温下孵育30分钟，之后用3N NaOH停止反应。荧光在Molecular Devices SpectraMax Gemini EM板读数器上获取（激发450 nm，发射580 nm）。IgG滴度估计为产生荧光强度是阴性对照（健康捐赠者）血清的10倍的血清稀释度的倒数，如前所述（19）。阳性反应要求最低滴度为100，并且至少比阴性对照肽的滴度和任何基线反应性高四倍（18）。滴度小于1的设定为1，以便于数据可视化，而不影响反应的判定。

参与者被跟踪观察临床结果，临床随访和监测成像的频率由治疗肿瘤科医生根据标准护理决定。总生存期（OS）从入组日期到任何原因导致的死亡日期；存活的参与者在最后一次已知存活日期被删失。无疾病生存期（DFS）从入组日期到首次疾病复发日期，包括新原发灶或任何原因导致的死亡；没有复发的存活参与者在最后一次已知疾病状态日期被删失。

目标样本量为30名参与者，能够评估主要免疫终点。报告了免疫反应率的点估计值，使用Miettinen–Nurminen评分方法和sasLM包（v0.10.5）在R（v4.5.0；RRID: SCR_001905）中计算两组之间的率差异及其90%置信区间（CI）。如果varlilumab在pRsp率上的改善范围在28%到31%之间，则支持进一步研究。使用SAS（v9.4；RRID: SCR_008567）中的重复测量建模评估循环Tregs的变化，基于对数转换数据的异质自回归1协方差矩阵，并使用F检验来评估指定的比较，P < 0.05被认为具有统计学意义。使用Microsoft Excel中的FORECAST函数估计IgG滴度。使用Kaplan–Meier方法评估意向治疗人群的临床结果。使用survival（v3.8-3）和ggsurvfit（v1.1.0）包在R（v4.5.0；RRID: SCR_001905）中进行生存分析和Kaplan–Meier曲线的生成。

在2019年9月至2023年4月期间，共有37名患者接受了筛选，其中33名被随机分配到A组或B组：A组17名，B组16名。所有患者都至少接受了一剂疫苗和一剂varlilumab（如果适用）（图1C）。20名（61%）完成了整个方案的治疗。所有参与者都可以评估安全性，30名可以评估主要免疫终点（pRsp）。各组的基线特征是平衡的（表1）。18名（55%）为男性，中位年龄（范围）为65岁（31–82岁）。7名（21%）之前接受了系统治疗（所有都是ICIs，其中一名还接受了BRAF/MEK抑制治疗）。研究代表性表格见补充表S1。表1. 按治疗组分的参与者基线特征。

在A组（N = 17）和B组（N = 16）中，共有33名参与者。年龄中位数为68岁（范围39–77岁）、64岁（范围31–82岁）、65岁（范围31–82岁）。男性比例分别为9名（53%）和9名（56%）。机构分布如下：弗吉尼亚大学13名（76%）、弗吉尼亚联邦大学12名（75%）、25名（76%）、弗吉尼亚联邦大学4名（24%）、4名（25%）、8名（24%）。原发部位分布如下：皮肤12名（71%）、11名（69%）、23名（70%）、黏膜2名（12%）、0名（0%）、2名（6%）、眼部3名（18%）、4名（25%）、7名（21%）、未知0名（0%）、1名（6%）、1名（3%）。AJCC分期分布如下：IIA期1名（6%）、IIB期4名（24%）、IV期1名（6%）、IIIA期1名（6%）、IIIB期2名（12%）、III期2名（12%）、IIIC期2名（12%）、IV期1名（6%）、4名（25%）、5名（15%）、眼部IIIB期1名（6%）、1名（6%）、IIIA期2名（12%）、3名（19%）、5名（15%）、黏膜IIIB期2名（12%）、0名（0%）、2名（6%）。入组时复发疾病的比例分别为3名（18%）、5名（31%）、8名（24%）。ECOG性能状态分布如下：0名、12名（71%）、12名（75%）、24名（73%）、1名（5%）、5名（29%）、4名（25%）、9名（27%）。之前接受过系统治疗的比例分别为3名（18%）、4名（25%）、7名（21%）。

在A组（N = 17）和B组（N = 16）中，共有33名参与者。年龄中位数为68岁（范围39–77岁）、64岁（范围31–82岁）、65岁（范围31–82岁）。男性比例分别为9名（53%）和9名（56%）。机构分布如下：弗吉尼亚大学13名（76%）、弗吉尼亚联邦大学12名（75%）、25名（76%）、弗吉尼亚联邦大学4名（24%）、4名（25%）、8名（24%）。原发部位分布如下：皮肤12名（71%）、11名（69%）、23名（70%）、黏膜2名（12%）、0名（0%）、2名（6%）、眼部3名（18%）、4名（25%）、7名（21%）、未知0名（0%）、1名（6%）、1名（3%）。AJCC分期分布如下：IIA期1名（6%）、IIB期4名（24%）、IV期1名（6%）、IIIA期1名（6%）、IIIB期2名（12%）、III期2名（12%）、IIIC期2名（12%）、III期2名（12%）、IV期1名（6%）、4名（25%）、5名（15%）、眼部IIIB期1名（6%）、1名（6%）、IIIA期2名（12%）、3名（19%）、5名（15%）、黏膜IIIB期2名（12%）、0名（0%）、2名（6%）。入组时复发疾病的比例分别为3名（18%）、5名（31%）、8名（24%）。ECOG性能状态分布如下：0名、12名（71%）、12名（75%）、24名（73%）、1名（5%）、5名（29%）、4名（25%）、9名（27%）。之前接受过系统治疗的比例分别为3名（18%）、4名（25%）、7名（21%）。

在A组（N = 17）和B组（N = 16）中，共有33名参与者。年龄中位数为68岁（范围39–77岁）、64岁（范围31–82岁）、65岁（范围31–82岁）。男性比例分别为9名（53%）和9名（56%）。机构分布如下：弗吉尼亚大学13名（76%）、弗吉尼亚联邦大学12名（75%）、25名（76%）、弗吉尼亚联邦大学4名（24%）、4名（25%）、8名（24%）。原发部位分布如下：皮肤12名（71%）、11名（69%）、23名（70%）、黏膜2名（12%）、0名（0%）、2名（6%）、眼部3名（18%）、4名（25%）、7名（21%）、未知0名（0%）、1名（6%）、1名（3%）。AJCC分期分布如下：IIA期1名（6%）、IIB期4名（24%）、IV期1名（6%）、IIIA期1名（6%）、IIIB期2名（12%）、III期2名（12%）、IIIC期2名（12%）、III期2名（12%）、IV期1名（6%）、4名（25%）、5名（15%）、眼部IIIB期1名（6%）、1名（6%）、IIIA期2名（12%）、3名（19%）、5名（15%）、黏膜IIIB期2名（12%）、0名（0%）、2名（6%）。入组时复发疾病的比例分别为3名（18%）、5名（31%）、8名（24%）。ECOG性能状态分布如下：0名、12名（71%）、12名（75%）、24名（73%）、1名（5%）、5名（29%）、4名（25%）、9名（27%）。之前接受过系统治疗的比例分别为3名（18%）、4名（25%）、7名（21%）。

在A组（N = 17）和B组（N = 16）中，共有33名参与者。年龄中位数为68岁（范围39–77岁）、64岁（范围31–82岁）、65岁（范围31–82岁）。男性比例分别为9名（53%）和9名（56%）。机构分布如下：弗吉尼亚大学13名（76%）、弗吉尼亚联邦大学12名（75%）、25名（76%）、弗吉尼亚联邦大学4名（24%）、4名（25%）、8名（24%）。原发部位分布如下：皮肤12名（71%）、11名（69%）、23名（70%）、黏膜2名（12%）、0名（0%）、2名（6%）、眼部3名（18%）、4名（25%）、7名（21%）、未知0名（0%）、1名（6%）、1名（3%）。AJCC分期分布如下：IIA期1名（6%）、IIB期4名（24%）、IV期1名（6%）、IIIA期1名（6%）、IIIB期2名（12%）、III期2名（12%）、IIIC期2名（12%）、III期2名（12%）、IV期1名（6%）、4名（25%）、5名（15%）、眼部IIIB期1名（6%）、1名（6%）、IIIA期2名（12%）、3名（19%）、5名（15%）、黏膜IIIB期2名（12%）、0名（0%）、2名（6%）。入组时复发疾病的比例分别为3名（18%）、5名（31%）、8名（24%）。ECOG性能状态分布如下：0名、12名（71%）、12名（75%）、24名（73%）、1名（5%）、5名（29%）、4名（25%）、9名（27%）。之前接受过系统治疗的比例分别为3名（18%）、4名（25%）、7名（21%）。

在A组（N = 17）和B组（N = 16）中，共有33名参与者。年龄中位数为68岁（范围39–77岁）、64岁（范围31–82岁）、65岁（范围31–82岁）。男性比例分别为9名（53%）和9名（56%）。机构分布如下：弗吉尼亚大学13名（76%）、弗吉尼亚联邦大学12名（75%）、25名（76%）、弗吉尼亚联邦大学4名（24%）、4名（25%）、8名（24%）。原发部位分布如下：皮肤12名（71%）、11名（69%）、23名（70%）、黏膜2名（12%）、0名（0%）、2名（6%）、眼部3名（18%）、4名（25%）、7名（21%）、未知0名（0%）、1名（6%）、1名（3%）。AJCC分期分布如下：IIA期1名（6%）、IIB期4名（24%）、IV期1名（6%）、IIIA期1名（6%）、IIIB期2名（12%）、III**人口统计**
协议定义的评估指标：
- 可评估的评估指标
- 可评估的评估指标
- 可评估的评估指标
- 可评估的评估指标
- 可评估的评估指标
- 可评估的评估指标
- 可评估的评估指标
- 可评估的评估指标
- A组：10/17（59%）；3/17（18%）；2/14（14%）；4/13（31%）；2/13（15%）；4/9（44%）；5/9（56%）
- B组：10/16（63%）；4/16（25%）；1/16（6%）；4/12（33%）；4/16（25%）；4/10（40%）；5/10（50%）
- 总计：20/33（61%）；7/33（21%）；3/30a（10%）；8/25（32%）；6/29b（21%）；8/19（42%）；10/19（53%）
- A组与B组的差异（90%置信区间）：
- ?4%（?31%至+24%）
- ?7%（?32%至+17%）
+8%（?12%至+31%）
?2%（?33%至+28%）
?10%（?34%至+17%）
+4%（?32%至+40%）
+6%（?31%至+41%）

**注：**
- 有33名参与者因在第18周或第25周没有样本而无法评估pRsp。在30名可评估的参与者中，有5人因DLTs（n=4）或复发（n=1）而被视为反应失败，尽管在第18周或第25周没有采样。
- 有2名参与者在后期出现DLTs，但在第18周或第25周有可评估的样本用于pRsp的评估。
- 在30名可评估pRsp的参与者中，有1人因缺少第25周的样本而被排除在mRsp的评估之外，但该参与者在第26周有阳性反应，因此无法评估其反应是否增加了两倍。

**图2：**
- T细胞反应：
- A组和B组的T细胞对6MHP的反应通过PBMC的ex vivo IFNγ ELISpot检测进行评估，适用于在第25周之前至少有一次反应的参与者（A组n=9，B组n=10）。A组中有1名参与者（ID 1322）仅在第26周有反应，因此未显示在图中。每条实线代表一名参与者，通过唯一的标识符编号表示。
- 要被视为有反应，需要背景水平的五倍增加，并且CD4+ T细胞的数量至少为10^5个细胞中的20个，同时标准差不能重叠。
- 背景水平的轻微增加但不符合反应标准的，显示为1倍增加（无反应）。
- 记忆反应评估：
- 适用于在第25周和第26周有可评估样本的参与者（A组n=9，B组n=9）。B组中有1名参与者（ID 1330）缺少第25周的样本，并且在第26周没有反应，因此被排除在记忆反应的评估之外。
- 协议定义的记忆反应（mRsp）在第26周用实心三角形标记表示；另一种记忆反应的定义（alt）在第26周用实心菱形标记表示。
- 在第25周接种加强疫苗后，如果T细胞在第26周有所扩增，但未达到mRsp或mRsp（alt）的标准，则用实心正方形标记表示。

**注：**
- 在30名可评估pRsp的参与者中，有29名也可评估mRsp。根据协议定义，有6名（21%）表现出mRsp（A组与B组的差异为?10%，90%置信区间为?34%至+17%；见表3；图2C和D）。
- 鉴于协议定义的标准可能无法可靠地反映所有参与者的反应范围，我们还探讨了其他定义方法。
- 在对第26周有可评估样本且第25周样本齐全的19名参与者进行事后分析时，有8名（42%）在第26周之前至少有一次反应，并且反应强度至少是第25周的两倍，这与记忆反应一致（见表3中的另一种记忆反应定义；图2C和D）。
- 有10名（53%）在第26周的反应强度是第25周的两倍，无论之前是否有反应，这与加强疫苗接种后的细胞扩增一致（见表3；图2C和D）。
- 总体而言，各组的CD4+ T细胞反应率通过IFNγ ELISpot检测相似（见表3）。免疫反应率按协议修正后的结果在补充表S7中总结。

**先前研究显示，**
- 系统性varlilumab可以减少循环中的Tregs（5, 6）。为此，通过流式细胞术从基线到第26周对PBMC进行了评估。
- 排除了低活力样本（<70%）。共有11名参与者因无基线样本（n=2）或低活力（n=9）而被完全排除；因此，A组和B组分别有10名和12名参与者可进行评估。
- 我们发现，与B组相比，A组的循环Tregs和总CD4+ T细胞随时间显著减少；两组之间循环Tregs占CD4+ T细胞的百分比没有显著差异（见图3A–C；补充表S8–S10）。
- 在最后一次加强疫苗接种后（第25周至第26周），B组的循环CD4+ T细胞显著增加，而循环Tregs占CD4+ T细胞的百分比显著减少（见图3B和C；补充表S9和S10）。

**IgG抗体反应：**
- 在先前的研究中，我们发现使用IFA基配方（包括含有局部粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的佐剂配方）以及局部poly-ICLC（无论是否联合全身性metronomic环磷酰胺）接种后，对6MHP产生了强烈的IgG抗体反应（12, 18）。
- 在本研究中，所有有可评估血清样本的参与者（n=31；见补充图S2）都检测到了对6MHP的IgG反应。
- 两组参与者的抗体滴度通常在第12周增加，然后在最后一个可评估的时间点（第25周）保持在1,000以上。

**临床结果：**
- 中位临床随访时间为3.4年。截至2025年5月，16名（48%）参与者出现黑色素瘤复发。
- A组和B组的4年无病生存率（95%置信区间）分别为20%（6%–67%）和69%（49%–96%；见图4A）。
- A组有4名（12%）参与者死于晚期黑色素瘤。
- A组和B组的4年总生存率（95%置信区间）分别为70%（49%–100%）和100%（见图4B）。

**图5：**
- 每名参与者的免疫结果和临床进程总结。在24名患有皮肤黑色素瘤或原发部位不明的疾病的患者中（见图5A），13名（54%）至少有一次CD4+ T细胞反应。
- 共有11名（46%）患者复发，其中A组有6名，复发中位时间为15.8个月（范围：4.7–46个月）；B组有5名，复发中位时间为19.6个月（范围：4.8–23.2个月）。
- 在9名患有眼部或黏膜黑色素瘤的患者中（见图5B），7名（78%）至少有一次CD4+ T细胞反应。
- 共有5名（56%）患者复发，其中A组有4名，复发中位时间为12个月（范围：1.3–25.1个月）；B组有1名，复发中位时间为51.7个月。
- 其中3名死于晚期黑色素瘤，全部来自A组，包括两名黏膜黑色素瘤患者和一名IIB期眼部黑色素瘤患者。

**讨论：**
- 我们报告了含或不含系统性varlilumab的黑色素瘤辅助肽疫苗的安全性、免疫学和临床结果。这种组合耐受性良好且安全，但并未增强免疫反应。
- 无论是否添加varlilumab，疫苗均能以相似的速率诱导记忆反应。
- 然而，添加varlilumab与循环CD4+ T细胞的显著持续减少相关，且CD4+ T细胞中Treg的比例没有显著下降，临床结果也不如单独使用疫苗时好。
- 由于疫苗本身的局部毒性，观察到了一个意外的安全信号。
- TRAE的类型与之前使用6MHP疫苗的试验中报告的类型一致（11, 13, 14, 16），包括使用poly-ICLC的试验（18），但本试验中观察到注射部位严重反应的频率更高。
- 尽管之前的6MHP试验也使用了半皮内/半皮下给药方式，但大多数试验要么将疫苗分为两个不同肢体的剂量进行初次免疫（11, 16），要么在初次和加强免疫时在不同肢体部位给予全剂量（13, 18）；因此，本试验中所有疫苗和poly-ICLC在同一部位给予全剂量可能导致更大的局部毒性。
- 协议的修正成功减轻了局部毒性。在本试验中，6MHP疫苗的安全性特征与之前的试验相比存在差异，这也表明在未来的试验中可以考虑使用分剂量注射的方法。在其他治疗相关不良事件（TRAEs）中，接受varlilumab治疗的患者中淋巴细胞减少的情况更为常见（5, 6, 9）。在疫苗联合全身性varlilumab治疗的情况下，没有观察到新的毒性模式。总体而言，6MHP疫苗在体外诱导的外周CD4+ T细胞反应率为61%，这与之前的6MHP试验结果一致（11, 14, 16, 18）。与我们的假设相反，添加全身性varlilumab并未改善T细胞反应的持久性，因为两组之间的dRsp、pRsp和mRsp率没有显著差异。在总结修改方案前后的数据时，总体结论保持不变。CD27信号通路通过IL2依赖性途径支持效应CD8+ T细胞在非淋巴组织中的存活（20）。临床前模型显示，CD27激动剂在CD4+ T细胞辅助下可以增强疫苗效果，同时也能独立于CD4+ T细胞的辅助促进CD8+ T细胞的效应和记忆分化（7）。6MHP疫苗仅包含已知的CD4+ T细胞表位，这些表位的反应可能更依赖于OX40共刺激而非CD27（21）。因此，如果疫苗中也包含CD8+ T细胞的表位，预计使用varlilumab可能会提高CD8+ T细胞的反应率；然而，在一项针对胶质瘤患者的小型研究中并未观察到这一现象（9）。在该研究中，接受varlilumab加疫苗联合治疗的患者在手术切除时循环中的CD8+和CD4+ T细胞数量显著增加，并且具有效应记忆表型，但未测试抗原再挑战后的扩增情况（9）。因此，我们的研究通过专门评估加强接种后的记忆反应，为免疫原性的研究增添了新的维度。尽管我们的数据不支持添加varlilumab能够增强CD4+ T细胞的记忆反应，但总体上42%的参与者在加强接种后表现出疫苗诱导的T细胞记忆和T细胞扩增。此外，所有参与者对6MHP疫苗都产生了持久的IgG反应，这表明B细胞的激活依赖于抗原特异性CD4+ T细胞。这些发现共同支持了癌症疫苗在增强实体瘤免疫治疗方面的潜力。我们发现，与仅接受疫苗的参与者相比，接受varlilumab的参与者随着时间的推移，循环中的Tregs和CD4+ T细胞数量显著减少（5, 6）。然而，接受varlilumab的参与者在Tregs占CD4+ T细胞的比例上并未随时间减少。这些发现，加上免疫反应数据，不表明添加varlilumab会改善CD4+ T细胞的分布。仅接受疫苗的参与者循环中的Tregs绝对数量随时间没有显著变化，Tregs占CD4+ T细胞的百分比也保持稳定，除了在加强接种后有所下降（9）。这些结果表明，辅助肽疫苗不会诱导Treg的扩增，尽管还需要进一步研究。虽然本研究没有能力按组别比较临床结果，但在无病生存期（DFS）和总生存期（OS）方面存在显著差异。参与者在原发疾病部位和阶段的异质性限制了对这些结果的解释。然而，接受varlilumab的参与者4年DFS率为20%（95% CI, 6%–67%），低于预期。对于仅接受疫苗的参与者，4年DFS率为69%（95% CI, 49%–96%），与我们之前使用6MHP作为辅助治疗的试验结果相当（14, 18）。两组之间的DFS差异表明，varlilumab导致的CD4+ T细胞减少可能降低了疫苗的效果，尽管Tregs的绝对数量有所减少。仅接受疫苗的参与者4年OS率为100%，这是一个令人鼓舞的结果。在B组中，6名疾病复发的参与者中有5名患有皮肤疾病，并随后接受了免疫检查点抑制剂（ICI）治疗。因此，在ICI治疗前使用辅助肽疫苗诱导肿瘤特异性CD4+ T细胞可能具有益处。6MHP中的肽来源于黑色素细胞分化蛋白（MDP），包括gp100、酪氨酸酶和Melan-A/MART-1，以及癌症睾丸抗原（CTA），特别是MAGE蛋白家族。这些共有抗原在皮肤和非皮肤黑色素瘤中都有表达。因此，参与者的入选标准不限于皮肤原发性疾病，特别是考虑到针对眼部疾病的可用辅助疗法有限。所有患者在入组时都没有临床或影像学上的疾病证据。因此，我们不认为原发疾病部位会影响参与者对疫苗产生外周免疫反应的能力。皮肤黑色素瘤中MDP和CTA的表达随疾病阶段而异，转移性病变中MDP的表达减少而CTA的表达增加（22–24）。然而，先前的研究表明，来自眼部原发性的黑色素瘤转移灶比来自皮肤原发性的转移灶具有更高的MDP表达（25, 26）。因此，黑色素瘤转移灶中共享抗原的表达差异可能会影响6MHP疫苗的临床效果，而这与疫苗诱导的外周免疫反应无关。此外，该试验招募了处于高复发风险的已确诊黑色素瘤患者，包括IIB至IIC期以及通过基因表达分析被认为是高风险的IIA期皮肤和眼部黑色素瘤患者。在该试验开始时，抗PD-1疗法尚未被批准用于IIB至IIC期皮肤黑色素瘤，因此当时不会作为标准治疗提供给患者。尽管如此，这种最近批准的免疫疗法适应症支持将早期高复发风险患者纳入黑色素瘤疫苗试验的合理性。该试验排除了在登记后12周内接受过ICI治疗的转移性患者。本研究的目的不支持在治疗方案中同时加入ICI治疗。排除近期ICI治疗的部分原因是为了在没有ICI治疗潜在干扰的情况下评估6MHP与varlilumab的安全性。此外，临床前模型表明，癌症疫苗与ICI联合治疗的最佳时机是在ICI治疗之前给予疫苗或同时给予（27, 28）。ICI治疗开始后进行疫苗治疗可能会因为ICI引起的早期免疫变化而减弱疫苗的效果。因此，由于ICI治疗不是可以在研究期间适当安排的，所以将其作为排除标准。本研究有几个局限性。该试验旨在评估安全性并初步估计不同组别的免疫原性差异；因此，样本量较小，限制了组间免疫反应率的正式比较以及按原发疾病部位或阶段进行临床结果的分析。尽管该试验的一个新颖部分是评估功能性回忆反应以表征T细胞记忆，但我们没有进行流式细胞术或其他单细胞水平分析来表征这些循环T细胞的表型，除了评估主要T细胞亚群随时间的变化，特别关注Treg亚群。虽然我们预计在时间点较晚时具有T细胞反应的患者会对抗原再挑战产生功能性回忆反应，但采样异质性或实验变异性可能会影响这些结果。因此，未来试验设计的一个考虑因素是包括单细胞评估，以表征循环T细胞亚群及其与功能性检测的一致性。尽管如此，我们从这个试验中获得的综合发现并不支持varlilumab在黑色素瘤辅助肽疫苗中的治疗潜力。此外，为了减少疫苗的局部毒性而对方案进行的修改限制了我们对VSME（疫苗诱导的记忆效应）的规划分析。然而，本试验中获得的疫苗样本对于未来工作比较基于IFA的疫苗与其他局部疫苗佐剂组合的VSME仍然具有价值。总之，全身性varlilumab与黑色素瘤辅助肽疫苗联合使用是安全的，但并未增强持久的免疫原性，并且与仅使用疫苗相比，在高风险的黑色素瘤患者中临床结果较差。记忆反应的诱导支持进一步研究，以优化与其他免疫疗法结合的共有抗原癌症疫苗。关键数据在本文中报告，并将在ClinicalTrials.gov上维护。如需，可从相应作者处获取去标识化的参与者数据。作者披露信息：G.R. Petroni在研究期间接受了Celldex的资助；E. Gaughan在研究期间接受了Immunocore、Regeneron和Merck Sharpe and Dohme的资助；K.A. Chianese-Bullock在研究期间接受了Celldex的资助和非财务支持；T.N.J. Bullock在研究期间接受了Celldex的非财务支持；C.L. Slingluff Jr在研究期间接受了Celldex的资助和非财务支持，同时还接受了Epitopea、Polynoma和CureVax的资助，以及Merck的非财务支持，此外还获得了Theraclion的非财务支持；C.L. Slingluff Jr还拥有一些待批准、已发布和许可的疫苗肽相关专利。其他作者没有披露任何利益关系。作者贡献：E.K. Ninmer负责正式分析、数据可视化、初稿撰写、审阅和编辑；G.R. Petroni负责正式分析、方法学设计、审阅和编辑；E. Gaughan负责研究、撰写、审阅和编辑；A.S. Poklepovic负责研究、撰写、审阅和编辑；V. Kaur负责研究、撰写、审阅和编辑；K. Haden负责研究、撰写、审阅和编辑；K.A. Chianese-Bullock负责数据整理、方法学设计、撰写、审阅和编辑；K.T. Smith负责研究、撰写、审阅和编辑；P. Wright负责研究、撰写、审阅和编辑；J.L. Bryant负责研究、撰写、审阅和编辑；D. Brighton负责正式分析、撰写、审阅和编辑；J.A. Engel负责数据可视化、撰写、审阅和编辑；T.N.J. Bullock负责概念构思、监督、资金筹集、方法学设计、撰写、审阅和编辑；C.L. Slingluff Jr负责概念构思、数据整理、正式分析、监督、资金筹集、方法学设计、初稿撰写、项目管理和撰写、审阅和编辑。本研究的部分资金由Celldex提供，用于支持临床试验成本；Alice和Bill Goodwin通过慈善捐赠支持了弗吉尼亚大学综合癌症中心的临床试验成本以及肽合成和分装工作（C.L. Slingluff Jr）。美国国立卫生研究院通过P30 CA044579拨款支持了临床研究办公室、生物库、组织研究设施、生物统计学核心和分子免疫学及转化科学核心。E.K. Ninmer获得了弗吉尼亚大学Rebecca Harris奖学金的支持。这是一个由研究者发起的试验，主要研究者（C.L. Slingluff Jr）是资助者-研究者。Celldex免费提供了varlilumab，并为弗吉尼亚大学提供了部分临床试验成本支持。Celldex提供了varlilumab的剂量指导，并审查和批准了手稿，但他们在研究实施、数据收集、管理和解释、手稿准备及提交发表决定方面没有发挥作用。其他资助者在研究设计、数据收集和管理、分析及解释、手稿准备和审阅、发表决定方面没有发挥作用。我们感谢Celldex免费提供用于本试验的varlilumab。我们感谢以下人士对本次试验的贡献：Donna Deacon和Marya Dunlap-Brown在ELISpot检测方面的协助，Walter C. Olson Jr在流式细胞术方面的协助，Feifan Xu在初步数据分析方面的协助。感谢Mauldin在分子免疫学与转化科学核心团队工作上的监督，以及Gina Duda、Thuy Le和临床研究协调员们为这项试验提供的数据收集支持。我们还要感谢弗吉尼亚大学分子免疫学与转化科学核心设施（CCSG资助编号：P30CA044579-26）和人类治疗中心cGMP设施（RRID：SCR_025475）的贡献，同时也要感谢弗吉尼亚大学医学院临床研究多站点项目管理团队的支持。这项试验的初步结果以海报形式在癌症免疫治疗学会第39届年会上展示，并以摘要形式发表。请注意：本文的补充数据可在《Cancer Research Communications Online》网站上获取（链接：https://aacrjournals.org/cancerrescommun/）。