用于再生治疗的整合循环工程：心脏组织工程中的动态灌注设计与代谢成熟

《Regenerative Therapy》：Integrative circulatory engineering for regenerative therapy: Dynamic perfusion design and metabolic maturation in cardiac tissue engineering

　　Jun Homma | Hidekazu Sekine
东京女子医科大学高级生物医学工程与科学研究所，日本东京，162-8666

**摘要**
成人心肌将极高的代谢需求与精细调节的冠状微血管系统相结合。通过密集的毛细血管网络、短扩散距离以及对线粒体氧化磷酸化的依赖，心脏能够持续输出高功率的工作。相比之下，目前的心脏组织工程平台（包括无支架的心肌构建体）虽然实现了强劲的收缩能力和基本的药物反应性，但仍受到类似胎儿心肌细胞代谢方式和血管整合不完全的限制。随着多能干细胞衍生的心肌细胞通过代谢成熟策略（如从糖酵解切换到脂肪酸氧化）向更接近成人的表型发展，其氧气消耗量急剧增加，这暴露了扩散限制培养和血管设计不足的局限性。本综述提出了一种综合性的循环工程框架，在该框架中，代谢成熟、血管结构和灌注是共同设计的，而不是孤立优化的。无支架的心肌组织被认为是一个特别合适的平台，因为它能够实现细胞间的紧密接触、自组织的微血管网络以及细胞外基质的动态重塑。我们探讨了如何通过细胞类型组成、旁分泌相互作用、基质力学和空间模式来协调代谢需求与血管供应。

灌注生物反应器被视为工程化循环系统中的活跃组成部分，能够提供可控的氧气输送、内皮网络的剪切条件、动态的基质供应以及可调的机械负荷。这一概念被扩展到体外循环单元，将心肌模块与血管床结合，在更先进的实现中，还可以与其他代谢器官结合。最后，文章讨论了转化应用、疾病建模机会、质量控制以及计算设计。这些要素共同勾勒出了一条通往具有再生治疗所需结构和功能复杂性的心肌组织的路径。

**1. 代谢成熟与血管设计的整合**
成人心脏既是代谢需求最高的器官，也是血管限制最严重的器官之一。在静息状态下，心肌细胞主要依赖线粒体氧化磷酸化，其中脂肪酸β-氧化也起着重要作用，并且必须维持数十亿次心跳的连续力量生成[1]。这一需求由密集且高度组织化的冠状微血管系统支持，毛细血管距离每个心肌细胞仅数十微米，并且血流和氧气供应以及基质供给都受到精细调节[2,3]。因此，任何旨在用于再生治疗的功能性心肌组织工程都必须从一开始就同时解决代谢特化与血管整合的问题[3]。

传统上，心脏组织工程将这些挑战视为彼此独立的方面——一方面是细胞存活和收缩功能，另一方面是血管化和灌注。在含有相对较多糖酵解细胞的薄层组织中，这种分离是可以接受的。但随着构建体厚度增加以及多能干细胞衍生的心肌细胞向更接近成人的表型发展，考虑氧气需求、基质利用、线粒体重塑以及毛细血管级别的运输距离、内皮细胞表型和灌注动态变得越来越重要[2,[4],[5],[6]。这种认识促使人们转向一个更综合的框架，在该框架中，代谢成熟和血管设计从构建体开发的最早阶段就开始协调进行。

**1.1 当前心肌组织构建体的局限性**
在过去二十年里，已经开发出了多种构建体，包括基于水凝胶的贴片、去细胞化基质再填充、微制造支架、类器官以及无支架的细胞聚集体或片层[7,8]。许多系统能够实现同步收缩、可重复的钙离子瞬变和基本的药物反应性，有些甚至已经进入临床前评估阶段，作为心外膜贴片或可注射基质使用。然而，它们仍存在几个共同的局限性，使其无法与天然成人心肌相媲美。首先，心肌细胞通常保留着类似胎儿的表型，具有无序的肌节结构、较小的细胞尺寸、不成熟的电生理特性，以及以糖酵解和乳酸利用为主的代谢特征[9]。不成熟的胎儿或多能干细胞衍生的心肌细胞相对较小且呈圆形或纺锤形，而成熟的成人心室心肌细胞呈杆状，直径约为10-25微米，长度约为100微米[10,11]。随着心肌细胞在胎儿期和出生后的成熟，扩散距离也会相应增加[10]。与此同时，心脏的血管化过程从最初依赖扩散的支持逐渐发展为扩展和重塑的冠状血管网络，以支持不断增长的心肌壁[12]。因此，从胎儿期到成年期，冠状血管系统显著扩展以支持心肌的生长，尽管在出生后生长过程中，心肌细胞肥大的速度可能超过毛细血管密度的增加[13,14]。通过延长培养时间、电刺激、机械负荷、激素信号，以及适当设计的二维培养环境（包括细胞外基质组成、生理基质硬度和细胞形状或几何结构），结构和电生理特性可以得到改善[4,[15],[16],[17],[18],[19],[20]；然而，代谢重塑往往滞后。

其次，在大多数厚型构建体中，血管化仍然不理想。仅靠扩散作用，可存活的厚度限制在几百微米以内；超过这个范围，就会发生缺氧和坏死[6,21,22]（如图1所示，当心脏细胞片层超过四层时）。与内皮细胞的共培养、预血管化的支架、微流控通道以及与宿主血管的连接可以改善灌注，但很少能再现天然心肌的毛细血管密度、层次结构和流动分布。灌注不良的区域会损害细胞的存活和功能。

**2. 代谢成熟作为设计驱动力**
现在认识到代谢状态是一种可主动编程的特性，而不仅仅是成熟的被动指标。通过调节基质可用性、营养组成、内分泌信号和培养时间，可以促使多能干细胞衍生的心肌细胞从依赖糖酵解的表型向线粒体含量增加、氧化磷酸化和脂肪酸β-氧化的表型转变。Tohyama及其同事开发的代谢选择和成熟策略利用了多能干细胞和心肌细胞在乳酸代谢上的不同依赖性，实现了乳酸为基础的纯化和随后的氧化成熟[9,24,25]。在这些基于Tohyama的方案中，通过乳酸选择、限制葡萄糖供应、添加长链脂肪酸，以及与甲状腺激素、糖皮质激素和胰岛素的组合，证明了代谢成熟可以加速并部分标准化。使用定义明确的代谢培养基和/或多模式成熟信号（例如电机械训练和先进的培养系统），其他平台也报告了类似的成熟改进[4,26,27]。这些方法使得心肌细胞的收缩力、动作电位形态和钙处理能力得到改善，其转录组和蛋白质组特征也更接近成人心肌。这些变化还增加了氧气消耗，并改变了氧化还原稳态，使得富含线粒体、能够进行脂肪酸氧化的心肌细胞对氧气和基质剥夺更加敏感。因此，代谢成熟加剧了工程组织中氧气输送和废物清除的挑战，将一个细胞优化问题转化为组织和系统层面的设计问题。

**1.3 在代谢需求高的组织中的血管设计**
血管设计包括创建在结构、功能和适应性上与心肌需求相匹配的可灌注网络。这包括具有适当间距和连接性的毛细血管结构、供血的动脉和引流的静脉、合适的流体阻力和生理相关的剪切应力模式[28],[29],[30],[31]。在薄层或不成熟的组织中，简单的平行通道或稀疏的类毛细血管结构可能足够，但随着厚度和代谢需求的增加，扩散距离缩短，灌注血管的密度必须接近成人水平。

考虑内皮细胞成熟的一个有用框架是，内皮细胞并不会收敛于单一的“成熟”状态，而是会获得特定器官的表型[32,33]。在不同器官中，毛细血管内皮细胞的表型从大脑中的紧密屏障形成型到肾小球中的高度孔隙化过滤型不等[32,33]。相比之下，心脏中的微血管内皮主要是连续且无孔隙的，专门用于在具有极端氧化需求和持续机械活动的组织中进行快速但受调控的交换[32,34]。因此，心脏内皮成熟不应被视为最大化不渗透性或过滤能力，而应理解为获得一种结合了连接完整性、剪切应力响应性稳态和有效支持相邻心肌细胞的表型[32,34]。心脏内皮细胞主动调节一氧化氮的释放、血管生成和旁分泌信号传导，以及代谢物和营养物质的跨内皮运输，从而影响心肌细胞的存活、收缩性能和代谢状态[34,35]。对于工程化的心肌组织而言，这一点非常重要：内皮成熟不应仅通过血管样网络或可灌注腔的出现来评判，还应看内皮细胞是否获得了支持心脏功能的特性，如稳定的屏障特性、生理流动响应性和内皮-心肌细胞间的代谢耦合[32,34]。从这个角度来看，灌注调节不仅是一种传输策略，也是建立更类似冠状血管内皮表型的指导因素[32,34]。在特定器官的框架内，冠状内皮表型成为血管性能的关键决定因素。在冠状微血管中，内皮细胞调节血管张力、屏障功能和基质运输，并通过一氧化氮等介质动态响应剪切应力[3]。内皮代谢主要以糖酵解为主，支持增殖和屏障完整性，同时为心肌细胞保存氧气。在工程化组织中，内皮细胞必须通过适当的剪切力和微环境信号来调整，以适应类似的功能角色。不稳定的、渗漏的或炎症性的血管可能尽管结构上看似完整，但无法提供足够的灌注。

**1.4 无支架心肌组织作为整合平台**
无支架的心肌组织工程——通过细胞片层堆叠、自组装球体或生物打印聚集体——利用细胞及其自身的细胞外基质作为主要结构元素[7,8,36,37]。这种方法可以促进细胞间和细胞与基质间的更紧密相互作用，改善电耦合，支持自发的微结构排列，并允许随时间自然重塑。在典型的细胞片层平台上，温度响应性培养表面可以在温度降低时使融合的单层细胞无酶地分离，从而保留天然的细胞间连接和内源性沉积的细胞外基质（图2）。这种保留不仅具有技术意义，而且是无支架心肌工程的基础：完整的细胞间连接和基质连续性使得无需人工支架即可实现分层堆叠，保持电生理一致性，并为微血管的自组织和连接创造有利环境。从这个意义上说，温度响应性收获直接支持组织结构、代谢成熟和血管发展的综合设计。

**结论**
这些元素共同勾勒出了一条通往具有再生治疗所需结构和功能复杂性的心肌组织的路径。因此，这些方法可以被视为互补而非竞争性的途径：微流控血管化微组织和球状体在机制分析和筛选方面非常有效，而基于细胞片的无支架组织则特别适合构建用于再生和循环单元应用的较厚的心肌模块。对于血管化而言，无支架结构允许内皮细胞和壁细胞自我组织成网络，这些网络可以与宿主血管或工程化通道连接。没有密集的合成支架可能降低内皮细胞植入和重塑的障碍，并使微血管与应力场和代谢梯度对齐。预血管化片层或球状体的分层或模块化组装可以产生更厚但仍可渗透的板层。

在代谢方面，无支架结构能够动态响应灌注和底物变化。随着心肌细胞的成熟和线粒体含量的增加，局部氧气消耗会形成影响血管生成信号和血管重塑的梯度。这种代谢与血管生长之间的相互作用在刚性图案化的支架中较难实现，但在细胞能够重新组织的系统中则更容易出现。然而，这种可塑性也给重复性带来了挑战，因此需要灌注生物反应器、机械加载方案和适时成熟的协议来引导自我组织达到理想状态。

1.5. 综合循环工程的概念
这些考虑激发了一个更广泛的概念框架——综合循环工程，它将工程化心肌视为一个设计好的循环系统的一部分，在这个系统中，灌注、氧合、底物输送和废物清除都是明确指定并主动控制的。在这个循环系统中，心肌细胞的代谢成熟和血管网络的发展是共同设计的，动态灌注用于同步需求和供应的变化。核心的设计问题是：什么样的心肌细胞代谢状态、血管结构和灌注动力学的组合能够产生一个能够与宿主循环系统整合的自维持、适应性强的心肌单元？

1.6. 综述的范围
在这个概念框架下，第2-4章探讨了如何结合代谢成熟策略和血管设计原则来推进无支架心肌组织工程。第2章关注细胞和结构设计输入（细胞组成、旁分泌相互作用、ECM结构/力学以及空间模式），这些因素为代谢需求-供应平衡设定了边界条件。第3章聚焦于灌注生物反应器作为控制氧合、剪切条件、底物输送和传感/反馈的实现手段。第4章则将这些元素综合成协调代谢成熟与血管结构和时间空间中灌注的原则。我们从细胞代谢和氧气动态开始，经过微血管结构和灌注生物反应器设计，最终到体外循环单元和转化应用。灌注被视为一个动态的设计变量，而不是静态的培养条件，代谢和血管因素被视为相互依赖的。基于无支架平台，并受到生理学和系统级思维的指导，综合循环工程为这一努力提供了一个统一的框架。

2. 代谢-血管整合的细胞和结构基础
本章定义了控制工程化心肌中代谢需求与血管供应之间耦合的细胞和结构设计输入。我们关注影响扩散距离、血管生成能力和微环境背景的组织构建变量——细胞类型组成、旁分泌相互作用、ECM结构/力学以及空间模式，这些因素决定了灌注策略（第3章）和成熟-血管整合原则（第4章）的运作环境。尽管这些边界条件适用于所有无支架组织、水凝胶基EHTs、生物打印构造和器官芯片系统，但它们的实际影响取决于每个平台上灌注接入和微血管组织的实现方式。这些输入共同为工程化心肌中的需求-供应匹配设定了边界条件。

2.1. 细胞组成作为耦合的设计变量
工程化心肌的代谢和血管表型反映了多种细胞类型的集合，而不仅仅是心肌细胞本身。天然心脏组织包含内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞、驻留免疫细胞和特化的传导细胞。重新构成至少一部分这种多样性对于捕捉代谢和血管系统的相互依赖性成熟至关重要。心肌细胞的来源和分化方案会影响基线代谢状态、线粒体含量和应激反应性。某些方案产生的细胞会快速上调氧化磷酸化；而其他方案则会在较长时间内保持糖酵解优势。这些初始条件决定了在不超出氧气输送能力的情况下，代谢成熟可以多快地推进。

来自多能干细胞、器官特异性前体细胞或原代分离细胞的内皮细胞在血管生成潜力、屏障行为和代谢特征上存在差异。类似冠状动脉的内皮细胞可能更好地形成稳定的、抗剪切的微血管并支持心肌细胞功能，但可能需要特定的信号来维持其身份。壁细胞调节血管稳定性和反应性，而成纤维细胞则调控细胞外基质沉积、力学和旁分泌信号。因此，这些群体的相对比例和成熟状态应被视为积极的设计参数，因为它们强烈影响扩散途径、血管生成能力和代谢交叉喂养。

2.2. 旁分泌和代谢相互作用
代谢成熟和血管发育通过旁分泌通讯紧密相连。经历工作负荷增加或短暂缺氧的心肌细胞会上调促血管生成因子（如VEGF和血管生成素），从而刺激内皮细胞增殖和网络重塑。随着灌注的改善，氧气和底物输送会反馈到心肌细胞代谢中，促进进一步的线粒体生物发生并转向脂肪酸氧化（FAO）。非心肌细胞也参与这一过程。心脏成纤维细胞分泌影响血管生成和代谢基因表达的细胞外基质蛋白和细胞因子。根据激活状态，成纤维细胞可以通过促进适当的基质硬度和对齐来支持代谢成熟，或者驱动不适应性的重塑，使组织变硬并限制扩散。内皮细胞产生的血管生成因子调节心肌细胞的生长、存活和代谢，并通过转运蛋白和脂肪酶调节脂肪酸和其他底物的跨内皮运输。培养时间线（何时引入内皮细胞和壁细胞、促血管生成信号维持的时间）对这种相互作用如何塑造代谢-血管整合有重要影响。

2.3. 基质结构和力学
即使在无支架系统中，由心脏细胞和基质细胞产生的细胞外基质（ECM）也是代谢成熟和血管模式的主要决定因素。胶原蛋白、纤维连接蛋白和层粘连蛋白的组成、排列和交联方式调节细胞形状、牵引力和机械转导信号。Tani及其同事的最新研究表明，工程化心脏组织中的心脏来源胶原蛋白可以增强肌节组织和线粒体成熟，突显了基质来源的重要性。在具有生理硬度和各向异性的基质上培养的心肌细胞表现出更好的肌节组织、传导和线粒体功能。在三维组织中，自组织成具有适当张力的层状结构的构造比各向同性的机械无序聚集体支持更接近成体的能量代谢。对于微血管形成，ECM的密度和交联必须允许内皮细胞增殖和管腔形成，同时提供足够的机械支持以实现稳定的灌注。周期性拉伸和收缩进一步耦合了代谢和血管发育。当无支架结构自发跳动或在起搏下运动时，区域应力场指导血管方向并重新分配代谢需求。促进同步、生理性收缩的培养条件（不过度拉伸）为塑造线粒体成熟和毛细血管模式提供了另一个手段。

2.4. 控制代谢景观的空间模式
心肌细胞、内皮细胞和基质细胞的空间排列决定了氧气和代谢物的消耗和分布。综合设计可以利用有意的空间模式，而不是试图消除异质性。策略包括将富含心肌细胞的层与血管化的基质层堆叠起来，创建重复的层状单元，在这些单元中，灌注路径相对于高代谢需求区域有规律地定位。与纯几何模式的打印或支架构造相比，逐层组装允许调整需求（富含心肌细胞的层）和供应（血管化的中间层）之间的空间关系，同时保持各向异性的传导和收缩；堆叠层方法和相关的模块化融合或血管化微组织实现就是这种设计逻辑的例子。具有预定义组成的球状体或微组织可以融合成更大的构造，其中一些聚集体作为“灌注枢纽”，优先支持微血管分支。细胞组成或成熟状态的梯度可以进一步使氧化成熟与局部灌注能力对齐——例如，将更多糖酵解的、未成熟的心肌细胞放置在初始灌注受限的区域，将更多氧化的、成熟的细胞放置在靠近灌注入口的位置，然后随着网络的完善和灌注的改善而促进远端成熟。

2.5. 定量评估和设计工作流程
需要定量指标来评估代谢-血管的对齐情况。在代谢层面，可以使用氧敏感探针、NADH/FAD自荧光和基因编码传感器来绘制区域氧张力、线粒体膜电位、ATP/ADP比率和底物利用率。结合钙瞬变和应变等功能读数，这些图谱揭示了代谢状态与工作负荷之间的关联。对于血管部分，使用共聚焦显微镜、光片显微镜、光学相干断层扫描血管造影或微CT成像网络拓扑、血管直径、灌注分数和剪切替代物可以提供结构背景。整合这些数据集可以揭示高代谢需求但灌注稀少的区域，或者血管化良好但心肌细胞持续进行糖酵解的区域，突出显示需要调整细胞组成、成熟或灌注策略的错位。设计工作流程可以从自上而下进行，指定目标表型（例如，具有接近成人氧化能力的板层和定义的毛细血管间距），然后推断细胞组成和灌注的约束；或者从下而上进行，首先映射可用群体的内在自我组织，然后通过适度干预来引导它。实际上，这两种方法将结合使用，无支架组织为这种相互作用提供了特别肥沃的土壤。

3. 灌注生物反应器和代谢-血管环境的控制
只有当代谢成熟和血管结构嵌入到适当设计的灌注环境中时，才能充分发挥其潜力。静态培养可以支持薄组织和相对不成熟的、以糖酵解为主的心肌细胞，但随着构造变厚和氧化代谢的增加，静态培养就变得不足了。因此，灌注生物反应器不仅作为培养辅助工具，还作为定义对流传输、内皮条件和组织环境动态控制的主动设计工具。在无支架心肌工程中，灌注设计是协调代谢轨迹和血管重塑在空间和时间上的主要手段。图3提供了工程化心脏组织中使用的代表性灌注策略的比较概述，包括间隙灌注、管腔灌注、血管网络灌注和表面供液灌注。本章在此基础上讨论了灌注几何形状、流动模式、氧和底物输送以及传感控制如何共同塑造代谢-血管微环境，并决定工程化心脏组织能否从扩散限制的生存状态发展到强大的氧化功能。

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图3. 工程化心脏组织中的代表性灌注策略。常用的灌注配置示意图，这些配置定义了工程化心脏组织中的氧和营养输送环境。(A) 间隙灌注，培养基通过对流方式通过组织基质或多孔结构输送到细胞周围。(B) 管腔灌注，流体通过内皮化通道输送，建立定义的血管管腔并为内皮细胞提供剪切条件。(C) 血管网络灌注，流体通过自组织或工程化的微血管网络（包括在微流控/器官芯片平台中的实现）输送，以支持在密集组织中的交换，并在定义的血流动力学条件下调节内皮。(D) 表面供液灌注，培养基沿组织表面流动，主要通过扩散从周围介质输送到构造中。这些配置代表了在工程化心脏组织中建立输送路径的互补工程策略，这里展示了灌注几何形状、血管界面和流动路径如何影响氧输送和代谢需求。

3.1. 从扩散限制培养到代表性灌注配置
如第1章所述，静态培养从根本上受到扩散的限制，随着心肌细胞代谢成熟和氧气需求的增加，这些限制变得越来越严格。灌注生物反应器通过引入通过或围绕构造的对流传输来解决这一限制。如图3所总结的，代表性配置包括通过组织基质或多孔支持的间隙灌注、通过内皮化通道的管腔灌注、通过血管化网络的灌注，以及表面供液培养，在这种培养中，尽管介质沿组织边界流动，但传输仍然主要以扩散为主。这些配置创造了不同的氧和底物环境，使内皮细胞暴露于不同的剪切环境中，并对组织设计施加不同的结构约束。因此，选择灌注几何形状时应考虑预期的成熟代谢状态，而不仅仅是初始的低需求状态。

3.2. 流动模式、剪切应力和内皮表型
除了传输本身，灌注还定义了内皮细胞所经历的机械微环境。剪切应力是内皮表型和代谢的中心调节因素，因此是无支架心脏组织中的关键设计变量。在天然冠状动脉血管中，层流和脉动剪切促进抗炎、产生一氧化氮、具有屏障功能的表型，这种表型仍然支持相邻心肌细胞的代谢。相反，受到干扰或长期低剪切有利于炎症激活、屏障破坏和不适应的内皮状态。这些考虑因素在图3所示的各种代表性灌注策略中的应用有所不同。例如，管腔和血管网络灌注能够更直接地控制内皮剪切力的暴露，而间质和表面供氧方法则通过局部传输场和边界条件间接影响内皮状态。在工程组织中，生理上适当的剪切力应能稳定内皮单层，促进连接完整性，并维持与氧化心肌细胞支持相适应的内皮状态。

3.3. 在代谢活跃的组织中的氧合和底物输送
随着心肌细胞向更氧化的表型转变，氧气的输送和底物的可用性变得越来越紧密相关。氧气供应不仅取决于入口处的氧分压和流速，还取决于可用的交换表面以及局部组织的消耗。同时，灌注系统通过控制葡萄糖、乳酸、脂肪酸、酮体、氨基酸和内分泌因子的输送来定义化学环境。图3中的代表性配置在氧气和底物的输送方式上存在根本差异：间质灌注通过多孔环境增强对流交换，管腔灌注将输送与特定的内皮化通道耦合，血管网络灌注通过分支的微血管路径分配流量，而表面供氧灌注主要依赖于外部流动介质的扩散。从设计角度来看，氧合和底物组成应与灌注结构同步调整：对于早期存活和网络形成，以扩散为主的条件可能就足够了；而随着向脂肪酸氧化和成人样工作负荷的进展，则需要增加氧气输送并更精确地调节介质组成。因此，氧合策略不是与代谢成熟分离的，而是其主要的促成条件之一。

可控的短暂性缺氧可以用作血管生成或代谢的信号，但必须谨慎控制以避免不可逆的损伤。基于血红蛋白的氧气载体或全氟碳乳液可以增加组织的存活厚度，但会引入粘度和潜在的内皮相互作用等额外变量，这些都需要管理。

3.4. 工作负荷的控制和同步的成熟信号
灌注生物反应器不仅仅是输送培养基；它们还建立了心肌细胞成熟的更广泛的物理化学环境。机械负荷，无论是由管腔内压力、外部拉伸、起搏还是后负荷元素引起的，都会直接改变ATP需求和氧气消耗，因此灌注必须相应地进行调整。同样，底物组成的分阶段变化和内分泌信号可以推动构建体沿着不同的代谢轨迹发展。这些考虑强调了将灌注视为动态变量而非固定设置的重要性。实际上，当氧气输送、底物组成和工作负荷以协调的方式增加时，成熟过程可以得到最佳支持，从而最小化需求与可用血管支持之间的不匹配。在图3所示的各种代表性策略中，核心设计挑战不仅仅是维持流动，而是使灌注模式和控制逻辑与组织不断变化的代谢和血管状态相匹配。

3.5. 基于传感的反馈控制
由于成熟和血管重塑是非线性和异质的过程，固定的灌注设置在整个培养过程中很少是最优的。现代灌注系统越来越多地结合了氧分压、pH值、葡萄糖、乳酸、压力和流速的测量，以及报告组织功能的光学或电生理读数。这些数据为反馈控制提供了基础，使得可以根据构建体的演变状态调整流速、压力、底物组成和机械刺激。尽管图3总结了灌注策略的结构类别而非控制架构，但每种配置原则上都可以与基于传感的调节相结合。最简单的层面是保持出口处的氧气或压力在预定义的范围内；更高级的策略使用集成监测来预测代谢需求的变化并预先调整培养环境。长期目标是建立一个自我调节的循环环境，以支持工程心脏组织从类似胎儿的糖酵解代谢过渡到稳定的氧化性能。

4. 将代谢成熟与血管设计整合
本章整合了将代谢成熟与血管架构和灌注联系起来的解决方案导向的整合原则。我们围绕时间（何时相对于血管容量推进氧化成熟）、空间（如何设计氧/底物分布）和反馈（如何通过传感信息调整灌注和培养基以保持供需一致）来组织讨论。通过将成熟和血管化视为一个耦合的设计问题，本章建立在第2章的设计输入和第3章的实施手段之上。重要的是，整合性循环工程旨在作为一个组织框架，而不仅仅是一种单一的制造方法。相同的耦合原则可以使用无支架组织、基于水凝胶的EHTs或微流控灌注平台来实现，前提是成熟、血管架构和灌注是共同设计并通过可测量的反馈联系起来的。关键要素包括：
- **时间协同设计**：氧化能力的增加与足够的微血管密度和灌注能力的建立同时发生，或在其之后不久。
- **空间控制**：设计和调控氧和底物梯度，以塑造心肌细胞表型和血管重塑。
- **内皮-心肌细胞耦合**：将内皮细胞视为活跃的代谢调节器和旁分泌伙伴，调整剪切力和底物暴露以促进稳定、支持性的表型。
- **反馈与适应**：实时测量氧气、代谢物和功能性能，以指导灌注、机械负荷和培养基组成的调整。

4.1. 代谢成熟作为灌注需求的驱动因素
促进hPSC衍生心肌细胞代谢成熟的方案通常结合了底物操作、长链脂肪酸的提供和内分泌信号的施加[4,58]。这些措施将代谢从类似胎儿的糖酵解状态重新编程为氧化磷酸化和脂肪酸氧化（FAO），伴随着线粒体生物发生的增加、肌节组织和电生理成熟的提高。因此，氧气消耗和氧化负担也随之增加。在未成熟的构建体中，适度的氧气需求可以通过表面扩散或稀疏的血管通道来满足。随着氧化能力的增加，氧气消耗接近成人心肌的水平，这需要微血管间距达到数十微米，并需要连续的对流供应[2,5]。因此，加速代谢成熟的策略必须与血管架构共同设计；否则，最先进的区域可能会因缺氧而选择性地丧失。

4.2. 成熟过程中的氧分布
在厚片或聚集体中的氧分布受反应-扩散-对流过程的控制，消耗量强烈依赖于发育阶段。在分化早期，低线粒体含量导致梯度较浅；FAO和氧化磷酸化的上调会加剧梯度并缩短扩散距离[4,5,27]。经典模型表明，即使消耗量的适度增加也会显著减少允许的扩散距离。对于通过细胞片层堆叠或凝聚产生的无支架构建体来说，这意味着一旦目标是类似成人的代谢，能够支持的层数就受到严格限制。动态灌注可以随时间重塑氧分布，通过调整流速、培养基氧分压和氧气载体来维持成熟过程中的生理特征。可以使用温和的、受控的梯度作为模式化信号，但这需要与网络几何结构和代谢阶段精确协调。

4.3. 底物切换和空间营养控制
代谢成熟还依赖于能量底物的时间和空间输送。胎儿和早期新生儿的心肌细胞偏好葡萄糖和乳酸；成人细胞主要依赖FAO，但仍保持代谢灵活性[59]。受Tohyama启发的方案利用葡萄糖缺乏、乳酸丰富的培养基，随后采用促进FAO的配方[9,24,25]。同时，我们为工程心肌组织优化了脂肪酸配方，证明定制的脂质组成可以提高基于细胞片层的构建体的收缩力，从而将代谢编程与改善的泵性能联系起来[60]。在灌注构建体中，底物操作具有空间维度。沿流动路径和厚度不可避免地会产生梯度。如果经过精心设计，入口区域可以富含脂肪酸和氧气，以促进高度氧化的心肌细胞，而下游区域则经历较低的氧气或不同的底物比例，从而模拟体内的分区。安全实现这一点需要仔细控制流动、通道架构和培养基配方，以避免在灌注不足的区域出现脂毒性或能量衰竭。

4.4. 内皮支持和心血管代谢耦合
内皮细胞积极塑造心脏代谢。在成人心脏中，内皮代谢调节屏障功能、一氧化氮的生物利用度、血管生成反应性和底物运输[61],[62],[63]。内皮细胞消耗的氧气相对较少，但通过糖酵解、乳酸产生和调节FA运输来影响微环境。在工程组织中，具有代谢能力的内皮网络可以稳定血管并调节心肌细胞的成熟。剪切应力调节内皮表型和代谢，促进一氧化氮的产生、抗炎信号以及在某些情况下增强脂肪酸氧化[61],[64],[65],[66]。这些变化通过旁分泌因子和调节底物输送来影响心肌细胞。因此，工程网络中的流动模式应选择接近生理冠状动脉剪切力，以促进类似成人的内皮表型和有益的代谢耦合。

4.5. 耦合的重塑和设计原则
在体内，代谢需求和血管供应通过血管生成、血管运动控制和结构重塑相互耦合。缺氧和代谢压力触发VEGF和其他信号；剪切力驱动动脉生成和修剪[67],[68],[69]。在工程组织中，只有当灌注条件允许适应时，类似的反馈才能出现。具有传感和控制的灌注系统可以有目的地利用这些反馈。氧气提取或乳酸产生的增加可以触发流量的增加或有针对性的血管生成刺激；缺氧的迹象可以促使灌注的重新分配或底物供应的调整。无支架构建体不受刚性支架的限制，非常适合这种适应性方案。整合这些考虑因素提出了几个设计原则。代谢状态应被视为一个可编程变量，与血管结构和灌注共同设计。氧和底物的输送不仅是为了避免坏死，也是为了提供生理相关的梯度。内皮和壁细胞的表型必须通过剪切力和底物暴露来调整，以支持稳定、支持性的网络。生物反应器应实现多参数传感和闭环适应，以匹配不断增长的代谢需求与血管容量。需要定量基准——氧气消耗、FAO/葡萄糖氧化比率、线粒体含量、毛细血管间距、灌注分数、剪切剖面和内皮一氧化氮产生——来操作和比较不同的设计[56,70]。

5. 体外循环单元、转化整合和设计优化
当心肌构建体嵌入到更高层次的循环环境中时，代谢成熟和血管设计的融合达到了最充分的表现。在这个规模上，无支架的心肌模块、可灌注的血管床、可控的血流动力学和可编程的代谢输入被结合成体外循环单元，这些单元近似于体内心脏的关键组织特征。这些系统促进了高级成熟，为转化应用提供了桥梁，并暴露了一个受益于计算和控制理论工具的复杂设计空间。

5.1. 从组织模块到体外循环单元
传统的心脏组织工程通常产生单一的功能模块——一个可收缩的补丁、一片堆叠或一个血管化的球体——在静态培养基中或在简单灌注下培养。相比之下，体外循环单元被构想为一个封闭或半封闭的循环，其中一个或多个心肌模块与工程血管网络、顺应性元件和泵结合，生成生理启发的压力-流量关系[71,72]。图4A展示了一个概念性示例，其中基于心脏类器官的模块与可灌注的血管床集成；图4B展示了一个分层框架，将基于细胞片层的心肌组织与逐渐复杂的体外循环单元和多器官循环平台连接起来。在这个架构中，灌注液组成、氧合和流动波形是明确的设计变量。早期阶段可以采用低后负荷、中等流量和适合相对糖酵解细胞的底物；后期阶段逐渐增加血流动力学负荷、氧含量和脂肪酸的可用性，与血管成熟同步进行。内皮网络通过脉冲剪切力进行调节，引导它们向抗炎、产生一氧化氮的表型发展[71,73]。心肌模块和血管隔室形成一个耦合系统，其中代谢状态的变化改变氧气提取和灌注液组成，进而影响血管张力和微血管流动，反馈到心肌的工作负荷。

5.2. 血流动力学负荷作为代谢成熟的调节器
成人心脏在显著且变化的血流动力学负荷下运行。前负荷、后负荷和心率调节机械工作，从而调节能量需求和底物利用[74,75]。工程心肌可以利用这种关系，将血流动力学负荷视为可控制的成熟输入，而不仅仅是一个应力源。体外循环单元允许通过泵、阻力元件和顺应性腔室的组合来施加定义的压力-体积条件。通过调节这些组成部分，可以设定目标每搏输出量、舒张末期压力和收缩负荷。逐步增加后负荷和起搏频率，并同时引入富含脂肪酸的含氧灌注液，可以促使心肌细胞向类似成人的兴奋-收缩-代谢耦合状态发展。血管容量必须保持同步：随着工作负荷和氧气消耗的增加，毛细血管密度、灌注比例和剪切力参数必须保持在生理范围内。因此，负荷调节既是一种成熟化工具，也是一种功能测试，用于评估代谢和血管系统的整合是否充分[74,76]。

5.3 多器官耦合与全身代谢背景
在体内，心肌代谢与肝脏、脂肪组织、骨骼肌和肾脏的功能紧密相连。循环中的葡萄糖、脂肪酸、脂蛋白、酮体和氨基酸的水平反映了全身的代谢状态，并显著影响心脏对底物的选择[77,78]。为了捕捉这一背景，可以将循环系统扩展为多器官平台，将心肌模块与类似肝脏和脂肪的组织连接起来。最近关于具有可吻合血管的可灌注内分泌组织的研究为多器官循环系统中的这种特定器官模块提供了模板[79]。在这样的系统中，共享的循环系统向所有模块输送底物和激素，而特定器官的微循环结构和局部控制元件则调节压力和流量。例如，肝脏模块可以调节葡萄糖的输出和脂质处理；脂肪模块可以根据激素信号调节脂肪酸的释放。这样，心肌模块就能体验到健康或疾病状态下的全身性底物模式。因此，代谢成熟化成为一个多器官设计问题，通过调整特定器官的功能和灌注液成分，可以模拟胰岛素抵抗、肥胖或生酮适应等疾病状态[72,80,81]。

5.4 转化应用、宿主整合与预处理
将代谢和血管系统整合的构建物转化为再生疗法时，需要仔细考虑植入场景和宿主环境。早期应用可能涉及相对较小且具有代谢能力的贴片，旨在支持梗死边缘区域并防止不良重塑，而后期策略可能针对跨越心室壁的构建物进行心室重建[82,83]。每种场景对毛细血管密度、灌注路径、机械韧性和代谢灵活性有不同的要求。体外循环单元可以作为预处理平台，通过调整灌注压力和波形来模拟预期植入部位的生理条件，使内皮细胞和壁细胞适应这些条件。例如，灌注压力和波形可以调整以模拟宿主的代谢状态（正常血糖、糖尿病、肥胖等），从而使细胞在移植前适应环境[73,75]。植入前的压力测试（如模拟缺血-再灌注、急性后负荷增加或突然的底物变化）可以用来评估移植物的耐受性。能够在这些挑战下维持功能和结构完整性的构建物更有可能在手术过程中存活。此外，还需要考虑宿主与移植物的代谢耦合：高度依赖脂肪酸氧化的移植物植入灌注不足或代谢受损的心肌时可能会经历能量失衡，而相对不成熟的、以糖酵解为主的移植物则可能被高度氧化的环境所压倒。根据具体的植入场景定制体外成熟化和最终预处理，可以最小化这些不匹配，促进逐渐向宿主表型靠拢。

5.5 疾病建模与精准医疗
同样的整合原理可以用来构建高保真的疾病模型。许多心肌病都表现为底物利用、线粒体功能和微血管完整性的联合紊乱，如糖尿病性心肌病、压力负荷性肥大和线粒体疾病[72,84]。来自患者特异性诱导多能干细胞的无支架心肌模块可以在循环系统中成熟，这些系统的条件旨在重现与疾病相关的代谢和血流动力学状态。例如，糖尿病性心肌病可以通过让构建物暴露于高血糖、富含脂质的灌注液、改变的激素水平和轻微的微血管稀疏环境中来建模。这样可以研究诸如舒张功能障碍、代谢灵活性下降和微血管功能障碍等表型。血管设计还使得微血管病理学建模成为可能；携带疾病相关变异的内皮细胞可以包裹灌注网络，下游的心肌细胞会因此受到异常血管反应或屏障特性的影响。这些平台非常适合精准医疗：患者特异性的构建物可以暴露于不同的代谢剂、血管扩张剂或组合治疗方案中，综合读数（如收缩性能、心律失常倾向、代谢通量和微血管行为）可以生成多维的响应特征。这些工作建立在Tohyama及其同事开发的工程心脏组织和类器官模型基础上，用于疾病建模和药物发现。

5.6 计算设计、优化与标准化
整合循环工程的设计空间是高维的，涵盖细胞组成、代谢协议、血管拓扑、灌注参数和负荷条件。通过经验探索这一空间效率较低。多尺度计算模型可以将细胞代谢、组织水平的扩散-灌注和网络级别的血流动力学联系起来，通过预测特定参数组合如何影响氧气分布、底物利用和功能输出来指导设计[76,85]。需要来自特征明确的构建物的数据（如氧气消耗、代谢物通量、毛细血管密度、流动图和功能表现）来校准和验证这些模型。优化框架（包括进化算法和基于机器学习的替代模型）可以寻找同时满足多个目标的设计，例如在最大化收缩输出的同时最小化缺氧比例和心律失常风险。通过计算机模拟得出的候选“操作点”可以通过实验实现并不断改进。同时，标准化也是必不可少的。例如，针对基于灌注的成熟化过程的参考协议（如“早期糖酵解”、“中期混合”、“晚期脂肪酸氧化主导”阶段）可以规定流量、氧合和底物的典型范围。包含详细灌注参数、毛细血管指标和代谢基准的报告指南将有助于跨研究比较和荟萃分析。随着时间的推移，可能会出现一系列经过验证的设计模板，适用于再生贴片、儿科移植物或特定疾病模型。

5.7 在整合循环框架内的展望
将无支架心肌构建物嵌入体外循环单元，并将其与多器官系统和计算设计工具结合，完成了整合循环工程的概念框架。代谢成熟不再仅仅是细胞内部的优化过程，血管化也不再是简单的结构附加；两者都成为动态调节的循环系统的一部分，以支持、测试和准备组织发挥其预期作用。未来的进展将依赖于传感、控制和建模的更紧密整合[71,72]。实时成像技术（如线粒体功能和微血管流动的成像）、基因编码的代谢报告器和自适应控制算法可以将灌注系统转变为自我优化的环境，引导构建物完成复杂的成熟过程。随着这些技术的成熟，整合循环工程不仅可以提供更精确的心脏模型和更稳健的移植物，还可以提供一个框架，帮助理解代谢、血管系统和血流动力学如何共同定义心脏健康和疾病，以及如何重新设计它们以用于再生治疗。

关于手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者使用了ChatGPT（OpenAI，美国加利福尼亚州旧金山）来辅助编辑和优化英文语言（如措辞、语法和清晰度）。使用该工具后，作者仔细审查并编辑了所有内容，并对发表文章的内容负全责。