在磁导航控制下具有催化活性的多模块纳米机器人系统

《Advanced Functional Materials》：Multiplex Modular Nanorobotic Systems with Catalytic Activity under Magnetic Navigation

　　摘要

纳米和微机器人技术正在迅速发展，成为在纳米尺度上进行可控和多功能操作的强大平台。然而，设计出集推进控制、实时跟踪、定位和生化活性于一体的多功能纳米机器人仍然是纳米机器人学中的一个核心挑战。在这里，我们报告了一种模块化策略，用于构建由磁性Janus纳米粒子作为推进模块和装载有荧光染料或酶的聚合物体扩展模块组成的多重纳米机器人系统。互补DNA配对驱动可编程的自组织，确保模块的精确组装和功能的正交分离。由此产生的纳米机器人展示了精确的磁导航、光学跟踪、酶催化和细胞表面对接能力。我们的可编程模块能够结合基于酶活性的治疗功能以及磁引导，并且关键的是，可以在多个酶循环中重复使用。这种策略为设计可编程和可重构格式的集成多种功能的适应性纳米机器人系统提供了蓝图。

1 引言

微机器人和纳米机器人技术的最新进展催生了一代新的可编程系统，这些系统能够在复杂环境中导航并执行局部任务，如高空间精度的传感、催化或治疗[1-5]。特别是磁性微机器人和纳米机器人，由于它们的无线驱动、组织穿透能力和精确的时空控制，越来越受到关注，使它们适用于生物医学和软材料应用[4-10]。磁场梯度和旋转场是此类系统中用于控制导航的最广泛使用的驱动模式之一[8]。同时，DNA纳米技术和分隔化的纳米系统为构建具有功能多样性和响应性的纳米机器开辟了新途径[11-13]。它们展示了复杂的驱动方案[14-16]或支持级联反应[17]，但在生理条件下的外部可控性仍然有限。为了实现多功能性，模块化架构是必不可少的[18-20]。需要将推进、传感和功能域分开，以实现有效的控制和更大的设计灵活性。在这方面，已经报道了微机器人系统，其中专门的磁驱动单元与单独的功能单元物理耦合，从而能够独立优化操作和功能，同时减少交叉干扰[21, 22]。尽管在模块化微机器人方面取得了进展，但依赖于化学推进系统或自扩散运动的设计[3, 23-29]通常缺乏方向控制或操作可重复性。重要的是，进一步缩小微机器人的尺寸提供了显著的优势，包括在分子水平上更有效的相互作用、利用纳米尺度物理现象（例如，布朗运动实现移动性和高表面积与体积比）以及降低制造材料需求[4, 30-33]。然而，纳米系统的极小尺寸也带来了重大挑战，特别是在集成多个功能模块、实现可靠的运动控制和管理制造复杂性方面。因此，大多数纳米机器人都是具有有限功能的单模块系统[34]。另一种策略基于微尺度和纳米尺度上的异质群集系统[35-39]，这些系统结合了分布在不同简单单模块机器人上的多种功能。局部功能结果取决于种群组成、局部密度以及特定实验环境下群集组织的稳定性。然而，环境条件的变化可能会影响它们的组织及其效果，这仍然限制了它们在更复杂场景中的应用。因此，将多种功能集成到单一构造中对于扩展纳米机器人的应用至关重要。我们在这里通过使用互补DNA来自组织多重模块化纳米机器人来弥合这一差距，这些机器人集成了磁操纵、局部酶活性、可控跟踪和对接生物细胞的功能（图1）。纳米机器人由两个核心模块组成：（i）基于磁性Janus纳米粒子的磁推进模块（MPM）和（ii）包含装载有酶的聚合物体的扩展模块（ExtM）作为功能实体（图1a）。这种通过可编程自组织实现的架构，在单一构造层面定义了一个双模块纳米机器人，促进了功能的分离，确保了敏感载荷的结构稳健性和生化稳定性。Janus纳米粒子作为支架，一个叶片携带磁性纳米粒子以实现引导运动，另一个叶片用单链DNA（ssDNA）功能化，通过互补碱基配对介导来自携带生化载荷或荧光标记的聚合物体的ExtMs的精确组装。Janus设计提供了独特的优势，即空间上分离不兼容的功能，从而减少相互干扰[40]，并通过保持DNA界面与磁域的空间分离来降低非特异性吸附和杂交风险。在分子水平上系统地优化了模块，从而产生了复杂度逐渐增加的纳米机器人：（i）具有MPM和荧光ExtM的基本纳米机器人，用于同时进行磁引导和光学跟踪；（ii）具有酶活性对接HeLa细胞的治疗纳米机器人，作为生物应用的原型；以及（iii）用于重复化合物生产的可磁回收的催化纳米机器人。与异质群集系统不同，我们的纳米机器人将操纵控制和功能模块集成在单一物理构造中。这种集成确保了它们的空间共定位，并保持了与周围环境基本独立的明确内部架构。关键的是，我们的制造方案允许在ExtM内定位高活性的酶，并且更重要的是，允许完全回收和重复使用这种载荷。这种磁可控纳米机器人的灵活性、可编程性和模块化特性代表了其在多种应用中的独特优势，包括先进治疗、催化或同时生物传感。

2 结果与讨论

2.1 纳米机器人模块的设计与制造

纳米机器人的可编程自组织基于Janus纳米粒子的各向异性结构，这使得每个叶片可以选择性地进行功能化[17, 41]。通过种子乳液聚合和相分离合成了Janus纳米粒子，其中一个叶片用叠氮基团功能化，而 tert-丁基酯基团的受控水解在相对的叶片上产生了羧酸功能（图1b,c和2a,b；图S1）。为了最终实现磁控制，用于引导、分离和积累纳米机器人，我们首先通过将磁性纳米粒子连接到Janus纳米粒子的一个叶片上开发了一个“磁推进模块”（MPM）。空间分离确保了磁组件与化学和酶组件的分离。通过沉淀法合成的胺功能化Fe3O4纳米粒子（NH2-Fe3O4；直径10纳米，图2c；图S2）使用EDC/NHS（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid/N-hydroxysuccinimide）化学方法与相应叶片上的羧酸基团耦合。它们叶片特异性的连接产生了带有磁性纳米粒子的Janus形状（MJNPs），通过TEM和SEM的结合进行了可视化（图1b,c和2a,d,e；图S3和S4以及表S1）。此外，能量色散X射线光谱显示了MJNPs的空间定义的正交功能化，仅揭示了定位在一个叶片上的铁信号（图2f）。此外，使用超导量子干涉装置（SQUID）表征了MJNPs的磁行为，并结合动态光散射（DLS）测定的粒子浓度估计了每个粒子的平均磁矩（图2g）。

2.2 模块的自我组织成磁控纳米机器人

我们首先使用互补DNA开发了一个“基本纳米机器人”，通过互补DNA编程MPM与Atto488-Pol-b扩展模块（Atto488-ExtM）的自组织（图3d）。Atto488-ExtM用于同时评估基本纳米机器人的完整性和追踪其运动。自组织条件在时间、Atto488-Pol-b表面的ssDNA密度以及聚合物体（MPMs）与MPMs之间的比例方面进行了系统优化，最终实现了92%的纳米机器人组装效率（详见支持信息中的方法部分）。在MPMs与Atto488-Pol-b的比例为1:5时，如TEM图（图3e）所示，附着在MPMs非磁性叶片上的ExtM通常由四个Atto488-Pol组成。这种独特的结构是由于Atto488-Pol-b的大小（200纳米）所施加的空间限制，这本质上决定了Atto488-ExtM的组成。组装好的纳米机器人的TEM概览见图S7。

2.3 具有磁导向运动的基本纳米机器人

为了探索基本纳米机器人和MJNPs的磁响应和控制能力，我们开发了一种实验装置，该装置可以施加定向磁场并实时追踪粒子的运动（图4a）。该系统使用两个电磁线圈以亥姆霍兹排列方式生成均匀磁场，并在一个线圈中添加了一个圆柱形钢芯，以获得4.3 T m?1的梯度场（详见“磁控制和空间定位”实验部分及图S8）。利用这一装置，我们测试了基本纳米机器人上的磁性物质是否足以实现磁操控。尽管NH2-Fe3O4仅附着在纳米机器人的一个叶片上，但这一有限的磁性体积足以在外部磁场下实现有效运动（图4b；视频S1）。图4：在图查看器中打开

磁场诱导的基本纳米机器人的运动。(a) 用于生成粒子定向运动磁场的装置示意图。(b) 荧光显微镜图像显示了携带Atto488染料的基本纳米机器人发出的荧光（亮白色斑点）；绿色线条是叠加的数字轨迹，用于说明在磁场存在下的平移（见视频S1）。记录的荧光轨迹显示了在磁场存在下，携带Atto488染料的基本纳米机器人在聚合物体隔室内的平移（见视频S1）。(c) 从粒子追踪分析中获得的基本纳米机器人的速度分布。平均速度的分布（3.5 ± 1.0 μm s?1）和分布宽度与场诱导的瞬态聚集现象一致。轨迹分析允许估计在磁场存在下的速度分布。携带Atto488-ExtM的纳米机器人通过荧光显微镜进行追踪，而MJNPs则通过明场显微镜进行追踪。在磁场作用下，基本纳米机器人显示出高斯速度分布，平均速度为3.5 ± 1.0 μm s?1（图4c），而MJNPs显示出截断的高斯分布，平均速度为1.4 ± 1.4 μm s?1（图S9a,b）。有趣的是，尽管基本纳米机器人的体积更大，因此对流动的阻力也更大，但它们的平均速度却更高。我们解释这种行为是由于较大的磁力克服了阻力，这归因于形成了小纳米机器人簇，这些簇比单个粒子携带更多的磁性物质，从而增强了整体磁矩，产生了更高的速度。这一解释还得到了宽速度分布的支持，这些分布的范围达到了平均速度的两倍（图4c；图S9b）。在另一种设置中，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）确认了在磁场暴露前Atto488的封装情况（图S9c和视频S2）。由于没有观察到背景荧光，聚合物体在引导运动过程中保持了其完整性。为了支持聚集假设，我们将SQUID测得的磁矩2.6 × 10?16?A m2（注释S2）与从速度分析中计算出的磁矩进行了比较。在我们的4.3 T m?1梯度下，单个未聚集的MJNP的理论漂移速度大约为0.44至0.48 μm s?1，这证实了单个粒子在布朗运动存在下可以被磁力拉动。然而，对MJNPs的实验速度分析得出的磁矩为m = (7.3或8.1) × 10?16?A m2，这取决于其方向，超过了SQUID测得的2.6 × 10?16?A m2（注释S2）。这种差异与小簇的存在是一致的。此外，附着聚合物体似乎增强了聚集现象。磁场诱导的小簇的形成是一种动态的、依赖于激活状态的效果，它发生在其他方面定义明确的纳米机器人之间，并不改变单个纳米机器人的结构、完整性或模块化组成。通过提高胶体稳定性和优化每个粒子的磁化强度，可以减少这种纳米机器人的聚集现象。尽管如此，聚集现象增强了纳米机器人的磁响应性，确保了在当前实验条件下的定向导航。

2.4 纳米机器人的功能复用：治疗性纳米机器人

为了实现纳米机器人的功能复用，我们将MPMs的化学不对称性与ExtM的功能结合起来。随后，我们开发了一种治疗性纳米机器人，它能够进行荧光成像和靶向细胞毒性，突显了其在医疗应用中的潜力。为了在赋予扩展模块治疗功能的同时实现实时荧光追踪，我们首先将成像模式从聚合物体腔室切换到MPMs。为此，使用EDC/NHS化学方法将Cy5-COOH连接到MJNPs的Fe3O4磁性纳米粒子的自由胺基上（图5a）。由此产生的Cy5-MJNPs表现出强烈的荧光（图S10a），同时保持了Janus形态，通过SEM可见（图5a,b）。通过FCS的亮度分析确定每个MJNP平均含有94 ± 10个Cy5分子（图S10b和注释S3）。随后，将ssDNAa连接到Cy5-MJNP的叠氮化功能化叶片上，得到了荧光Cy5-MPM（图5a,c；图S11和表S3）。Cy5-MPM的优势在于它同时支持磁操控和荧光追踪。为了评估模块化架构内的空间整合，通过将Cy5-MPM与Atto488-Pol-b耦合来组装基本纳米机器人。CLSM中Cy5和Atto488信号的清晰共定位表明纳米机器人的自组织成功（图S12）。

治疗性纳米机器人。(a) MJNPs表面修饰的示意图，详细展示了‘成像’Cy5（浅蓝色）在磁性叶片上的逐步定向附着，以及ssDNAa在相对叶片上的附着。(b) Cy5-MJNPs功能化后的SEM显微照片。(c) 带有非磁性叶片（橙色）并经过DNAa功能化的Cy5-MPM的TEM显微照片。示意图和TEM显微照片包括：(d) ASNase-CNCs和(e) ASNase-CNC-b。(f) 自由Cy5染料（20 nM，蓝色）、Cy5-a'（20 nM，红色）以及与Cy5-a'混合的ASNase-CNC-b的FCS自相关曲线（点）和相应的拟合曲线（线）。(g) 治疗性纳米机器人的示意图和(h) TEM显微照片，显示Cy5-MPM的一个叶片上仅附着了ASNase-ExtM。(i) ASNase的酶活性：溶液中的自由ASNase（蓝色点），ASNase-CNC-b（红色点）和治疗性纳米机器人（绿色点)。(j) 在PBS（顶部行）、基本纳米机器人（MPM+Atto488-ExtM；中间行）以及存在PolyI ([PolyI] = 50 μg mL?1) 的基本纳米机器人（底部行）培养5小时后的HeLa细胞CLSM显微照片。细胞用4%戊二醛固定，并用Hoechst 33342（蓝色）染色细胞核，用WGA-AF555（红色）染色细胞膜。Atto488的荧光（绿色）表明了基本纳米机器人的存在。合并的显微照片显示了纳米机器人在细胞表面的定位，而在PolyI存在下未观察到任何附着。比例尺=20 μm。(k) 用治疗性纳米机器人（活性）、未渗透处理的相应纳米机器人（非活性）和单独的纳米机器人组件（MJNPs、MPMs、不含melittin孔的ASNase-Pol-b（非活性）、含有melittin孔的ASNase-CNC-b（活性）处理的HeLa细胞的细胞活力，分别在24小时（顶部）和72小时（底部）通过MTS测定。在没有PolyI的情况下（绿色条形）和在PolyI存在的情况下（品红色条形）处理的细胞进行了比较。使用双向ANOVA和Tukey的事后检验计算了处理细胞与未处理对照组之间的统计差异。P值（p）表示统计显著性：ns >0.05, *p < 0.05, **p < 0.02, ***p < 0.002, ****p < 0.0002。接下来，我们开发了一种具有催化活性的ExtM，该方法是将L-天冬酰胺酶封装在用melittin孔渗透的CNCs内（图5d；图S13a和注释S4）。ASNase是一种重要的化疗剂，它可以耗尽细胞外的L-天冬酰胺，某些癌细胞依赖这种物质生存[46]。然而，其免疫原性和较短的半衰期限制了其临床应用[47]。通过比色酸测定（Bicinchoninic acid assay）确定，ASNase-CNCs的封装效率为20%，既不会阻塞melittin孔，也不会在DBCO修饰的ssDNAb附着后影响囊泡形态（图5e；图S13b和S14及表S4）。由此产生的ASNase-CNC-b平均每个CNC含有48 ± 7条DNAb链（图5f），其中一些链用于与MPMs耦合，其余的链作为“对接臂”与细胞膜上的清除受体相互作用[17, 41, 48]。通过将Cy5-MPMs与最多包含四个ASNase-CNC-b（ASNase-ExtM）的ExtMs连接，构建了治疗性纳米机器人。ASNase-ExtM选择性地附着在Cy5-MPM的DNA功能化叶片上，形成了与其基本对应物类似的架构（图5g,h）。通过监测CNCs内L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨的过程来评估纳米机器人的酶活性（图5i；图S15和注释S4）。纳米机器人和ASNase-CNC-b获得了相似的酶动力学，表明ASNase-CNC-b附着在Cy5-MPM上并未影响封装酶的活性。这表明在我们的条件下，整合到纳米机器人结构中并不显著影响ASNase的活性。尽管自由ASNase的催化效率更高——可能是因为没有CNC膜作为扩散屏障——但封装在CNCs内使其免受潜在有害条件如蛋白酶降解的影响[47]。对于治疗效果而言，纳米机器人与细胞的相互作用是一个关键方面。我们之前已经证明，聚合物体[48]和Janus纳米粒子-聚合物体簇[17, 41]可以通过ssDNA与癌细胞膜上的清除受体（SRs）相互作用。由于治疗性纳米机器人旨在诱导细胞凋亡，这使得检测细胞相互作用变得复杂，因此我们改为在没有磁场的情况下使用基本纳米机器人来研究其与HeLa细胞的对接（图5j）。细胞对接和活力测定是在静态孵育条件下进行的，以将生物反应与场诱导的积累和局部浓度梯度分开。与HeLa细胞孵育5小时后，大多数基本纳米机器人都与细胞膜结合（图5j，中间行）。因此，ExtM上的未杂交ssDNAb可以作为纳米机器人的对接臂，类似于分散的Atto488-Pol-b与HeLa细胞的相互作用[41]。相比之下，在poly(inosinic acid)（PolyI）存在下未观察到纳米机器人附着（图5j，底部行）。总之，治疗性纳米机器人能够实现与细胞膜的靶向相互作用，并基于荧光在细胞表面定位纳米机器人。通过测试它们对HeLa细胞活力的影响来评估治疗性纳米机器人的治疗效果。具体来说，细胞与携带ASNase-ExtM（活性）或不含melittin孔的ASNase-ExtM（非活性）的治疗性纳米机器人以及单独的纳米机器人组件一起孵育24小时（图5k，顶部图），48小时（图S16b），以及72小时（图5k，底部图）。治疗性纳米机器人显著降低了细胞活力，在72小时时的效果比24小时更明显（16 ± 7% vs 72 ± 6%活力（图5k）。治疗性纳米机器人在细胞毒性方面优于ASNase-CNC-b，因为它们在ExtMs中集中了ASNase，减少了自由ASNase的快速活性损失和限制[49-51]。携带封装ASNase的治疗性纳米机器人能够与癌细胞结合，克服了这些限制。在PolyI存在的情况下，纳米机器人没有显示出细胞活力的降低，因为细胞对接被阻止了。值得注意的是，在没有磁场的条件下进行细胞活力测定，使我们能够在受控且可重复的暴露条件下评估封装ASNase的固有治疗效果。为了排除培养基中存在的核酸酶可能破坏DNA介导的连接或纳米机器人完整性的可能性，我们在DFCS和热失活的DFCS（HI-DFCS）中监测了基本纳米机器人在1.5小时磁操控期间的表现，分别在组装后立即（t0）和在37°C下孵育72小时后（t0'）。此外，还在两种培养基中以及有无孵育时间的情况下，通过TEM评估了基本纳米机器人的结构完整性（图S17；视频S3–S6和注释S4）。在两种培养基中，我们都没有观察到背景荧光强度的增加，这表明纳米机器人在磁操控下保持完整，Atto488-ExtM的释放和/或破坏可以忽略不计。虽然在拥挤的细胞介质中可视化更加具有挑战性，但透射电子显微镜（TEM）图像证实，纳米机器人在经过磁操控后仍保持了其结构完整性，这与稳定的DNA介导的附着一致。此外，不含蜂毒肽孔的ASNase-Pol-b以及携带非活性ExtM的诊疗用纳米机器人也没有影响细胞的存活率。另外，单独的非酶活性纳米机器人组件（MJNPs、MPMs、Cy5-MPMs）也没有对细胞存活率产生影响。此外，Cy5-MPMs的存在使得可以对纳米机器人进行荧光引导成像，这使它们成为诊断应用的理想候选者，例如在手术中检测肿瘤边缘以进行切除。

2.5 纳米机器人的功能性多重化：催化纳米机器人

作为功能性多重化的第二个例子，我们开发了一种催化纳米机器人，它结合了ExtM的CNCs所贡献的酶活性、磁响应性和强大的荧光单元。与诊疗用纳米机器人相比，Cy5-MPM没有进行修改，而ExtM则包含装载了碱性磷酸酶（ALP-ExtM）的CNCs，这种酶在包括肝脏、骨骼和肾脏在内的多种组织中能够介导关键的去磷酸化反应[52]。ALP在ExtM内的易交换性突显了其容纳多种活性载荷的能力，从而可以直接调节纳米机器人的功能并扩大其潜在应用范围。经过蜂毒肽处理的ALP-CNCs保持了囊泡结构和大小，ALP的封装效率约为22%（图S18a）。将DBCO功能化的单链DNA抗体（ssDNAb）与ALP-CNC结合，就像Atto488-Pol一样，每个ALP-CNC-b的表面密度达到了50 ± 9个ssDNAs（图6a；图S18b，表S5，注释S5）。

通过模块化组装催化纳米机器人，整合了磁控运动、成像和酶活性。示意图及相应的TEM显微照片展示了：(a) ALP-CNC-b和(b) 显示ALP-CNC-b在Cy5-MPM上特定叶状附着的催化纳米机器人；(c) 溶液中游离ALP（蓝点）、ALP-CNC-b（红点）和催化纳米机器人（绿点）的酶活性；(d) CLSM显微照片显示在由圆盘形钕磁铁（N42级，直径10毫米，高度2毫米）产生的磁场下Cy5-MPM（左）和催化纳米机器人（右）的环形聚集。红色荧光对应于与Cy5-MPM结合的Cy5。刻度尺为200微米。(e) CLSM显微照片显示：左侧为纳米机器人上的Cy5荧光；中间为ALP-ExtM产生的DiFMU荧光；右侧为显示在磁力定位的纳米机器人位置上的空间限制的催化活性的合并荧光图像。刻度尺为200微米。(f) 纳米机器人在溶液中反复进行DiFMUP转化的循环。每次循环后，纳米机器人通过磁铁回收并重新分散到新鲜的底物溶液中。将Cy5-MPM和ALP-CNC-b混合后，可以编程自组织成含有四个ALP-CNCs（ALP-ExtM）的扩展模块，这些扩展模块仅附着在Cy5-MPM的非磁性叶上（图6b）。通过将荧光团6,8-二氟-4-甲基伞形花酯磷酸（DiFMUP）转化为荧光团6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素（DiFMU）来监测这些纳米机器人的ALP催化活性。时间依赖的DiFMU原位生成证实，ALP-CNCs在纳米机器人扩展模块内保持了催化活性，表明（图6c；图S19和注释S5）附着在Cy5-MPM上对酶活性影响最小。使用基于钕圆盘磁铁的磁控装置研究了催化纳米机器人的磁操控能力，该磁铁在磁铁边缘附近产生空间非均匀的径向磁场[53]。这种配置促进了磁响应纳米结构的定向聚集。在磁场存在下，Cy5-MPM和纳米机器人都向磁铁边缘迁移，在30分钟内形成了环形结构，如CLSM所示（图6d；图S20）。移除磁铁后，Cy5-MPM在不到10分钟内重新分散，可能是因为颗粒大多保持为单独单元，从而实现了快速的布朗扩散（图S20a和视频S7）。相比之下，在相同条件下，催化纳米机器人主要保持聚集状态，需要轻微搅拌才能完全重新分散（图S20b和视频S8及S9）。这种聚集行为与在磁场下观察到的纳米机器人更高速度一致（图4c），其中颗粒簇比单个单元携带更多的磁性物质，导致磁化增强和推进速度加快。重要的是，这种场诱导的聚集是可逆的；移除磁场后，纳米机器人会重新分散（视频S9），这与外部磁场下磁性胶体的瞬态结合和解离报告一致[54]。这些结果共同表明，纳米机器人倾向于暂时形成小簇，这既解释了它们在磁场下的增强运动，也解释了磁场移除后它们分散速度变慢的现象。然后通过添加酶底物DiFMUP来评估磁场限制下的纳米机器人的催化活性。由ALP-ExtM的酶活性产生的DiFMU荧光与纳米机器人的Cy5荧光大部分重叠，表明纳米机器人是活跃的（图6e；视频S10）。对磁固定的催化纳米机器人的荧光映射显示了DiFMU强度的径向梯度，在纳米机器人密度高的区域信号最强（图S21）。因此，通过施加场梯度，可以将催化纳米机器人定位在特定位置，从而实现酶活性的空间控制。值得注意的是，磁场诱导的纳米机器人聚集会对底物的扩散产生限制，导致反应速率相对于溶液中的分散纳米机器人较慢（图6c）。这种效应是可逆的，可以通过调整场强度和几何形状以及重新分散纳米机器人来调节。磁响应性和结构完整性是纳米机器人有效回收和再利用的关键前提。为了评估可重复使用性，首先将催化纳米机器人分散在含有DiFMUP的缓冲液中。在最大转化成DiFMU后，通过磁力固定它们，去除荧光产物，然后将纳米机器人重新分散到含有DiFMUP的新鲜缓冲液中（视频S9）。催化纳米机器人的酶活性（图6f）和它们的结构完整性（图S22）在三个循环中得到了保持，反应速率仅有轻微下降。尽管在定位实验中使用磁操控来空间限制催化作用，但磁功能也可以用于酶的回收。可重复使用性在各种催化应用中具有关键优势，因为它可以以时间和空间的精确度持续生产所需的分子。这种对催化活性的可控重新定位和限制支持了我们系统的机器人行为。

3 结论

本研究展示了具有磁控制和可编程自组织的多功能纳米机器人系统，这些纳米机器人由磁性Janus纳米颗粒和聚合物体组成，通过在统一架构内集成磁推进模块和功能扩展模块来实现。通过在纳米尺度上实现可控的磁推进以及独特的形态，我们的方法从根本上不同于现有的纳米机器人设计，同时利用了微型化的优势。通过DNA杂交将这两个模块耦合，清晰地分离了推进和活性，减少了交叉干扰，并最小化了敏感生物活性组分的变性。保持DNA界面与磁域在空间上的分离还有另一个优势，即避免了非特异性吸附和减少杂交的可及性，后者直接削弱了受控自组装。纳米机器人可以使用外部磁场动态定位，从而实现多功能性的时空控制。值得注意的是，它们的结构完整性在多次催化循环中得到了保持。这种稳健性——对于重复使用有价值的酶载荷至关重要——突显了系统的可持续性。通过结合磁引导、实时光学监测和催化活性三种不同功能的三种纳米机器人，我们展示了模块化设计的多功能性和可重构性。此外，我们纳米机器人的模块化设计允许通过改变活性载荷（例如蛋白质）或在同一ExtM内集成不同的CNCs来直接调整应用。总体而言，我们基于在多功能纳米机器人内对各个模块进行多步骤化学功能化的策略，为未来的智能、适应性纳米材料奠定了基础。虽然微型化提供了许多优势，但我们的研究强调了它在实现可重复使用性和可持续性方面的关键作用，我们认为这对于该领域未来的发展至关重要。

4 实验部分

4.1 纳米颗粒的合成和功能化

4.1.1 Fe3O4纳米颗粒和NH2-Fe3O4的合成

磁性Fe3O4纳米颗粒（MNPs）是通过共沉淀方法合成的，并进行了少量修改[55]。简要来说，将三氯化铁（FeCl3·6H2O，8.1克）和二氯化铁（FeCl2·4H2O；3克）溶解在脱氧超纯水（UPW；150毫升）中，在持续搅拌和氮气氛围下直到获得均匀溶液。之后，逐滴加入NH4OH（25%，v/v）（25毫升），并在惰性气氛和强烈搅拌条件下将混合物保持在80°C，以获得黑色沉淀物MNPs。条件维持一小时，然后冷却至室温（RT）。黑色MNPs通过磁力分离，并用UPW洗涤五次，再用乙醇洗涤两次。为了用胺基团功能化MNPs，将3克MNPs分散在乙醇（200毫升）中，并加入3-(三乙氧基硅基)丙胺（APTES；5毫升）。混合物在室温下搅拌过夜。所得到的胺基功能化MNPs（NH2-Fe2O3）通过磁力分离并用乙醇洗涤三次以去除未反应的APTES，然后用UPW洗涤五次（图2c；图S2和S3）。NH2-Fe2O3的尺寸（10 ± 2纳米）通过DLS确定（表S1）。

4.1.2 Janus纳米颗粒的合成

各向异性Janus纳米颗粒的合成及其表面羧酸和叠氮基团的选择性修饰已在前文描述[17, 41]。简要来说，通过微乳液聚合合成的聚（叔丁基丙烯酸酯）（PtBA）种子纳米颗粒（1克）分散在乙醇（5毫升）中，并用UPW稀释至50毫升。悬浮液在室温下用氩气吹扫30分钟以脱氧。另外，将3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯（TSPM；1.5毫升）和3-叠氮丙基三甲氧基硅烷（TSPA；0.5毫升）的混合物在15毫升UPW中通过超声波处理2分钟。然后在70°C下连续搅拌的同时，将此乳液逐滴加入到PtBA分散液中（1000转/分钟）。20分钟后，加入过硫酸铵（APS；20毫克）以引发聚合反应，并在氩气氛围下在70°C下继续反应24小时。所得到的前体Janus纳米颗粒通过离心和依次用乙醇和UPW洗涤进行纯化。它们的尺寸通过DLS确定为389 ± 6纳米。

4.2 磁推进模块（MPM）的形成

4.2.1 用磁性纳米颗粒功能化Janus纳米颗粒的羧酸叶

Janus纳米颗粒（15毫克）分散在含有（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC；250微升，2.5毫摩尔）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS；250微升，5毫摩尔）和三乙胺（Et3N；10微升）的二甲基亚胺（DMF；1毫升）的溶液中。搅拌混合物2分钟后，加入NH2-Fe3O4（150毫克）纳米颗粒（800微升），并在室温下孵育24小时。磁性Janus纳米颗粒（MJNPs）通过离心和依次用乙醇和UPW洗涤进行纯化。MJNPs的尺寸通过DLS确定为407 ± 10纳米，而基于50个颗粒的测量，SEM分析得出的平均长轴长度为406 ± 21纳米。Zeta电位为?56.0 ± 1毫伏。SEM图像和纳米颗粒的表征见图2、图S3和S4以及表S1。

4.2.2 用Cy5-COOH功能化MJNPs的磁性叶

为了用荧光染料功能化磁性叶，向Cy5-COOH（50微升，1毫米）中加入EDC（100微升，0.2毫摩尔）、NHS（200微升，0.2毫摩尔）和Et3N（4微升）（在DMF；1毫升）中。溶液在室温下孵育5分钟以激活羧酸基团。随后，加入分散在DMF（200微升）中的MJNPs（15毫克），并在室温下搅拌4小时。携带Cy5的磁性纳米颗粒（Cy5-MJNPs）通过磁分离法进行纯化，并用乙醇洗涤三次，然后用去离子水（UPW）洗涤以去除未反应的染料。通过动态光散射（DLS）测定MJNPs的尺寸，得到长轴尺寸分别为405 ± 11 nm和405 ± 19 nm，这些数据是通过平均50个颗粒的扫描电子显微镜（SEM）显微图得出的（见图S11和表S3）。纳米颗粒的SEM图像显示在图5中。其ζ电位为?41.0 ± 0.9 mV。

4.2.3 MJNPs和Cy5-MJNPs的叠氮化物功能化
对于叠氮化物功能化，将15毫克的MJNPs和Cy5-MJNPs置于0.5毫升的PBS溶液中，与0.2毫摩尔的DBCO-DNA链在室温（RT）下通过应变促进的叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）进行24小时的反应。所得到的ssDNA功能化的MJNPs（MPM）或Cy5-MJNPs（Cy5-MPM）通过离心法纯化，并用乙醇和UPW洗涤。MPM或Cy5-MPM的尺寸通过DLS测定，结果分别为410 ± 11 nm和408 ± 13 nm。它们的ζ电位分别为?55.0 ± 1.4 mV和?50.0 ± 0.7 mV（见图2和图5中的SEM和TEM图像以及MPM的表征；见图S4和S11和表S1和S3）。Janus纳米颗粒及其磁性衍生物的形态和尺寸通过扫描电子显微镜（SEM，Zeiss Gemini SEM 450）和透射电子显微镜（TEM，Philips CM100，80 kV）进行分析。SEM证实了功能化的不对称性，而能量色散X射线光谱（EDX）映射验证了NH2-Fe3O4纳米颗粒选择性地附着在具有羧酸官能团的Janus纳米颗粒的叠氮化物上。更多实验细节见支持信息中的方法部分。

4.2.4 荧光相关光谱（FCS）
FCS通过检测与荧光标记的互补链的杂交来验证ssDNA的 conjugation [17, 41]。详细协议见支持信息中的方法部分。为了确定表面结合的寡核苷酸链的检测，假设了一个1:1的杂交模型：一条ssDNAa仅与一条Atto488-b′杂交，另一条ssDNAb仅与一条Cy5-a′杂交。检测链（Atto488-b′, Cy5-a′）较短，而ssDNAa和ssDNAb的长度大约是它们的两倍；未考虑多价结合。

4.3 扩展模块亚单位的形成
4.3.1 CNCs和聚合物体的形成
纳米机器人的扩展模块的亚单位、催化纳米腔室（CNCs）、聚合物体和Atto488-Pol是根据既定协议制备的，并进行了修改以支持天冬酰胺酶（ASNase）、碱性磷酸酶（ALP）和荧光染料（Atto488）的封装 [17]。简要来说，将280微升25毫克/毫升的PDMS25-b-PMOXA10-OH溶液和120微升25毫克/毫升的PDMS28-b-PMOXA10-N3溶液分别溶解在乙醇中，以30%的摩尔比混合，得到最终聚合物浓度为10毫克/毫升。将溶液转移到圆底烧瓶中，使用旋转蒸发器（例如，在40°C的水浴中，转速约为600转/分钟，持续30分钟）去除乙醇，以形成薄聚合物膜。为了自组装封装ASNase的CNCs（ASNase-CNCs）或ALP的CNCs（ALP-CNCs），用含有ASNase（1毫克/毫升）或ALP（1毫克/毫升）和melittin（40微升1毫摩尔的溶液）的PBS缓冲液重新水化薄膜。混合物在室温下搅拌12小时，然后通过聚碳酸酯膜（Whatman Nuclepore，初始孔径为400纳米，随后为200纳米）进行九次挤出。未封装的酶通过用蛋白酶K（120微升，1毫克/毫升）在37°C下处理2小时去除，随后通过尺寸排阻色谱（SEC）进行纯化。SEC纯化在?KTA Go系统（Cytiva）上进行，使用Superdex 200 10/300 GL柱（GE Healthcare）。早期洗脱的CNCs或聚合物体组分被收集并合并，而自由酶则在后一步洗脱。作为对照，未渗透的纳米组装体（无活性）ASNase-Pol和ALP-Pol的制备方法相同，但在薄膜重新水化过程中不添加melittin。为了获得封装Atto488的Atto488-Pol，使用1毫升0.2毫摩尔的Atto488染料溶液进行重新水化。挤出后，Atto488-Pol也通过SEC纯化以去除未封装的染料。使用相同的自组装条件（聚合物浓度为10毫克/毫升），我们制备了不携带任何封装货物的聚合物体（Pol）以及带有渗透melittin的聚合物体（Mel-Pol；10毫克/毫升的聚合物和40微升1毫摩尔的melittin溶液）。所有CNCs和聚合物体都储存在4°C的PBS中。更多实验细节和数据见支持信息中的方法部分和注释S1、S4和S5。

4.3.2 CNCs内酶的封装效率测定
蛋白质浓度使用Pierce增强型比色酸（BCA）蛋白测定试剂盒按照制造商的协议进行测定。为了测定ASNase或ALP的封装效率（EE），使用了不含melittin的负载酶的聚合物体（ASNase-Pol或ALP-Pol），以避免melittin肽对BCA测定中总蛋白信号的贡献。将200微升的聚合物体（ASNase-Pol或ALP-Pol）加入乙醇中，最终浓度达到2%，并在37°C下超声处理5分钟。所得溶液通过0.2微米的尼龙膜（Whatman，直径4毫米，General Electric，英国）过滤，并用BCA工作试剂稀释1:4。样品和标准品在37°C下孵育2小时，然后在562纳米处使用Spectramax iD3微孔板读数器测量吸光度。释放的蛋白质用量牛血清白蛋白（BSA）校准曲线进行定量。封装效率（EE）使用公式（1）计算：

封装效率大约为ASNase-Pol的20%和ALP-Pol的22%。为了估计每个囊泡的平均酶负载量，将释放的酶总量除以通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）确定的聚合物体数量。

4.3.3 ssDNAb与CNCs和聚合物体的结合
将500微升的Atto488-Pol或ASNase-CNCs或ALP-CNCs与5′-DBCO-终止的ssDNAb（浓度为0.2毫摩尔，每个叠氮基团对应1.2当量）混合。混合物在37°C下摇动300转/分钟孵育过夜，以促进SPAAC反应。通过SEC纯化混合物以去除未结合的ssDNAb。扩展模块的最终亚单位Atto488-Pol-b、ASNase-CNC-b或ALP-CNC-b储存在4°C的PBS中。使用透射电子显微镜（TEM，Philips CM100，80 kV）分析ssDNA功能化前后聚合物体和CNCs的形态。FCS通过检测与荧光标记的互补链的杂交来验证ssDNA的结合。动态光散射（DLS，Zetasizer Nano ZSP，Malvern）测量流体动力学直径（Dh），而多角度DLS和静态光散射（SLS，LS Instruments，配备21毫瓦HeNe激光器）在30°到150°的散射角度下用于二阶累积分析，以获得流体动力学半径（Rh）并使用Guinier图从SLS数据确定回转半径（Rg）。FCS通过检测与荧光标记的互补链的杂交来验证ssDNA的结合。ssDNAb附着到CNCs或聚合物体后，其ζ电位从3.2 ± 0.9 mV变化到?6.2 ± 1.2 mV。更多实验细节和数据见支持信息中的方法部分和注释S1、S4和S5。

4.4 纳米机器人的组装和磁控制
4.4.1 纳米机器人的制备
通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）确定磁性推进模块（MPMs或Cy5-MPMs）和封装Atto488、ASNase或ALP的扩展模块亚单位的浓度。为了形成纳米机器人，将大约2 × 10^9个MPM或Cy5-MPM的溶液与含有扩展模块亚单位（大约1 × 10^10个Atto488-Pol-b或ASNase-CNC-b或ALP-CNC-b）的溶液混合。混合物调整至最终体积300微升，并在37°C下摇动300转/分钟孵育过夜，以促进互补的ssDNA链（-a和-b）在自组织过程中的杂交。使用TEM成像分析所得到的纳米机器人，以证明成功自组织成纳米机器人结构。

4.4.2 磁控制和空间定位
为了研究磁驱动的粒子运动，使用玻璃盖片作为基底和改良的Gene Frame间隔器制备了一个密封的观察室。标准的Gene Frame（10 × 10 × 0.25毫米^3）沿着边缘切割，以减少截断的圆锥形钢芯尖端与观察区域之间的距离，使得尖端到样本的距离为d = 6.5毫米。将25微升的粒子悬浮液pipette到腔室中，并用第二个盖片密封。腔室安装在一对位于显微镜物镜上方的Helmholtz线圈之间，使用定制的3D打印支架。通过电源施加2.5伏直流输入并通过10倍电压放大器产生磁场。在观察位置，磁场强度为31.1毫特斯拉，场梯度为4.3特斯拉每米。使用63倍物镜和高分辨率相机以15帧/秒的频率，通过荧光显微镜或明场显微镜观察粒子向截断的圆锥形尖端的运动。使用Python 3.10.9中的trackpy库分析粒子轨迹。从帧到帧的位移推导出瞬时粒子速度，并根据帧率进行缩放，将像素转换为微米。排除了由于噪声导致的负速度。速度分布以直方图显示，并用正态分布或截断的正态分布拟合基本纳米机器人或MJNPs的峰值速度。使用Hall探针安装在精密机械操纵器上，测量了基于Helmholtz线圈的磁场剖面和梯度。首先确定样本位置的垂直位置。然后将探针与铁芯的尖端水平对齐，并在沿芯轴撤回探针时获取磁场测量值。磁场梯度是使用连续测量之间的有限差分计算的。此外，磁场数据还用五次多项式拟合，以获得平滑的、单调递减的剖面，并从中得出梯度。测量的和拟合的磁场剖面及其对应的梯度见图S8。对于最终尖端到样本的距离d = 6.5毫米，磁场和梯度分别为31.1毫特斯拉和4.3特斯拉每米。此外，使用堆叠的钕磁铁（NdFeB，圆柱形，10个磁铁，直径3毫米，高度9毫米，等级N45）评估了基本纳米机器人的磁响应性。在Petri皿中用PBS（200微升）稀释50微升的基本纳米机器人，然后将磁铁放置在Petri皿的一侧以产生横向磁场梯度。使用CLSM实时监测纳米机器人的迁移，Atto488荧光实现动态跟踪。在磁操控期间和之后没有观察到Atto488-ExtM的显著荧光损失或泄漏，证实了聚合物体的稳定性。为了评估磁定位，向两个孔的Lab-Tek 2腔室盖片系统（μ-slide）中加入1毫升含有Cy5-MPM或催化纳米机器人的溶液，并在盖片底部放置一个圆盘形的钕磁铁（等级N42；直径10毫米，高度2毫米）15分钟。使用CLSM实时监测纳米机器人的迁移，并使用Atto488荧光实现动态跟踪。没有观察到显著的荧光损失或泄漏。使用堆叠的钕磁铁（NdFeB，圆柱形，直径3毫米，高度9毫米，等级N45）评估了基本纳米机器人的磁响应性。在Petri皿中稀释50微升的基本纳米机器人，并在Petri皿的一侧放置磁铁以产生横向磁场梯度。使用CLSM实时监测纳米机器人的迁移。使用Hall探针的Gaussmeter（PCE-MFM 3500，PCE Instruments）在直流模式下操作，量化了圆盘形钕磁铁的磁通密度。首先确定样本位置的垂直位置，然后将探针与铁芯的尖端对齐，并在沿芯轴撤回探针时获取磁场测量值。磁场梯度是使用连续测量之间的有限差分计算的。此外，磁场数据还用五次多项式拟合，以获得平滑的、单调递减的剖面。磁场数据在磁体中心和磁体边缘进行记录：(i) μ-slide底部（z = 0 mm；探针与slide的外部底部表面接触）以及(ii) 在slide底部上方z = 2 mm处（液体柱内的间隔定义的距离）。在slide的底部表面，磁体中心的磁场强度为228.3 mT，到磁体边缘时降低到185.2 mT，这是通过直接磁场测量确定的。在z = 2 mm处，磁场强度在中心降低到147.0 mT，在环边缘降低到73.6 mT。这些值对应的平均轴向梯度（ΔB/Δz在0–2 mm范围内）分别为40.7 T m?1（中心）和55.8 T m?1（环边缘）。环边缘的较高梯度与实验观察到的Cy5-MPMs和纳米机器人的环状积聚现象一致（图6d；图S20）。

4.5 细胞研究

4.5.1 细胞培养
HeLa细胞（人类宫颈上皮癌；ATCC：CCL-2）在添加了10%胎牛血清（FCS）和青霉素-链霉素（100 U mL?1/100 μg mL?1）的DMEM培养基中培养，温度为37°C，处于含有5% CO2的潮湿环境中。

4.5.2 基本纳米机器人与细胞的相互作用
HeLa细胞以每孔3 × 10^4个细胞的密度接种在8孔Ibidi μ-slides上，使用DFCS（300 μL）培养24小时。然后，将上清液替换为新鲜的DFCS（160 μL），并向每个孔中加入40 μL的PBS（pH 7.4）中的测试样本。所有培养步骤都在没有外部磁场的情况下进行。测试样本包括基本纳米机器人、扩展模块亚单位（Atto488-Pol-b）、经过poly-inosinic酸抑制剂处理的基木纳米机器人及其Atto488-Pol-b（[PolyI] = 50 μg mL?1，用于抑制清除受体活性），以及仅使用PBS作为阴性对照。之后细胞再培养5小时，然后去除上清液。细胞用PBS洗涤三次，用4%甲醛固定15分钟，接着用Hoechst 33342（0.25 μg mL?1）染色30分钟。核染色后，细胞再次用PBS洗涤三次，随后在室温下用荧光标记的小麦胚芽凝集素（WGA-AF555，5 μg mL?1）染色5分钟以标记细胞膜。最后，细胞用PBS洗涤三次，并通过CLSM进行成像。

4.5.3 细胞活力测定
使用CellTiter 96 AQueous One溶液细胞增殖测定试剂（Promega）按照制造商的协议进行细胞活力评估。HeLa细胞分别以每孔6000个细胞、3000个细胞和1500个细胞的密度接种在96孔板中，并培养24小时、48小时和72小时。随后，将DFCS替换为含有测试样本的新鲜培养基200 μL，这些测试样本包括治疗性纳米机器人及其各个组成部分（ASNase-CNC-b、Cy5-MPM、MJNPs和MPM）。每种纳米成分的浓度调整至与完全组装的治疗性纳米机器人中的浓度相匹配。封装的ASNase的浓度调整为0.60 μg mL?1。在每种情况下，将40 μL的测试样本与160 μL的DFCS混合后加入细胞中。处理过的细胞在标准条件下与或不与SR抑制剂（[PolyI] = 50 μg mL?1）一起培养5小时。之后用PBS洗涤板孔，然后加入每孔100 μL的新鲜DFCS。培养24小时、48小时或72小时后，将培养基替换为含有MTS试剂的DFCS。培养2小时后，使用SpectraMax iD3微孔读数器（Molecular Devices）在λ = 490 nm处测量吸光度。从所有测试孔中减去仅含MTS试剂的DFCS的背景吸光度。吸光度值归一化到未处理细胞的水平。每种条件重复三次测量，并且实验重复两次。

4.6 酶活性测定
酶活性测定在黑色平底96孔板（Thermo Fisher Scientific）中进行。每个孔的最终体积为200 μL PBS（pH 7.4）。所有测定在25°C下进行，使用相同的最终酶浓度来比较游离酶、封装在CNCs中的酶以及纳米机器人ExtMs内的酶。所有测量均重复三次。ASNase活性使用Abcam asparaginase活性测定试剂盒（ab107922）进行定量，按照制造商的荧光测定协议进行，并根据定制的ASNase制剂进行调整。ASNase，无论是游离的、封装在CNCs中的还是整合到纳米机器人中的，最终浓度为45 ng/mL，与L-天冬酰胺以逐渐增加的浓度（0.2, 2, 10, 20, 30, 和 40 μM）一起孵育。使用Spectramax iD3微孔读数器（λex = 535 nm, λem = 587 nm）监测荧光。使用不同浓度的DiFMUP（5, 10, 15, 25, 和 50 μM）作为荧光底物，测量游离ALP、封装在CNCs中的ALP以及整合到催化纳米机器人中的ALP的活性。荧光随时间变化的情况使用SpectraMax iD3微孔读数器（λex = 358 nm 和 λem = 450 nm）记录。初始速率从信号增加的线性阶段提取，并使用GraphPad Prism拟合Michaelis-Menten方程以得出Km和Vmax值。

4.7 催化纳米机器人的重复使用性
催化纳米机器人的回收性能通过三个酶循环进行评估。将酶浓度为50 ng/mL的纳米机器人分散在PBS（190 μL）中，并通过加入DiFMUP（10 μL, 300 μM）启动反应。使用SpectraMax iD3微孔读数器（λex = 358 nm 和 λem = 450 nm）记录荧光，直到反应达到平台期。随后，在孔下方放置一个圆盘形钕磁体（N42级，直径10 mm，高度2 mm）以磁力固定纳米机器人。小心地移除含有荧光产物的上清液，然后将纳米机器人重新分散在新鲜的PBS（190 μL）中，接着加入DiFMUP（10 μL, 300 μM）以恢复200 μL的总体积用于下一个循环。监测三个循环的荧光强度，并通过与初始反应速率比较来评估酶活性。

4.8 统计分析
数据以平均值±标准差（s.d.）的形式呈现。使用Image J从TEM和SEM图像中提取的尺寸测量数据的统计分析在OriginPro 2022b中进行。使用双因素方差分析（ANOVA）进行两组以上之间的比较，随后进行Tukey的事后检验。图中的误差条代表至少来自3个不同样本的标准差。Michaelis-Menten参数使用GraphPad Prism从至少3个不同样本计算得出。

作者贡献
V.M.、P.F.和C.G.P.构思了这项研究。V.M.负责磁性Janus纳米粒子的合成，开发并优化了纳米机器人的架构，进行了酶特性测试、重复使用性研究以及整体数据整合。X.H.和M.S.进行了体外细胞相互作用实验，包括共聚焦激光扫描显微镜观察、细胞对接的定量分析以及细胞活力评估。X.H.和M.S.以及C.-A.S.解释了细胞实验结果。L.M.、N.M.G.和P.F.设计并执行了磁操纵实验，包括轨迹跟踪和运动分析。所有合作者都对数据解释做出了贡献。V.M.、C.-A.S.、P.F.和C.G.P.撰写并审阅了手稿，并得到了所有作者的输入。M.V.、C.G.P.和P.F.监督了整个项目。C.G.P.和P.F.获得了资金支持。所有作者讨论了结果，修订了手稿，并批准了最终版本。

致谢
作者衷心感谢国家分子系统工程能力中心（NCCR-MSE，资助编号51NF-40-205608）、瑞士国家科学基金会（SNSF，资助编号207383）、瑞士纳米科学研究所（SNI）以及巴塞尔大学的财政支持。作者感谢Dr. A. Angelini参与早期探索性实验，以及Dr. R. Wehr在二嵌段共聚物合成方面的帮助。作者还感谢巴塞尔大学的Dr. N. Abdollahi提供圆盘形钕磁体以及有益的讨论。此外，作者感谢瑞士纳米科学研究所的Nano Imaging Lab（NI Lab）提供成像仪器的使用权限。作者还感谢巴登-符腾堡州科学、研究与艺术部（MWK）和德国研究基金会（DFG）通过INST 35/1314-1 FUGG和INST35/1503-1 FUGG资助的数据存储服务SDS@hd。开放获取出版由巴塞尔大学通过Wiley - 巴塞尔大学协议与瑞士学术图书馆联盟共同实现。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究发现的数据在Zenodo上公开可用，网址为https://doi.org/10.5281/zenodo.18649900，参考编号为18649900。