优化制备纳米壳聚糖/聚乳酸（PLA）纳米纤维创可贴以促进糖尿病伤口愈合：体内评估与性能分析

《South African Journal of Chemical Engineering》：Optimized Fabrication of Nanochitosan/PLA Nanofiber Wound Dressings for Diabetic Wound Healing: In Vivo Evaluation and Performance Analysis

　　Citra Yulia Sari|Azzah Dyah Pramata|Prihartini Widiyanti|Siti Nurkhamidah|Amanda Augre Maharani Purimahua|Wanda Benboy|Tri Widjaja
印度尼西亚苏拉巴亚Sukolilo市10月10日技术学院化学工程系，邮编60111

**摘要**
糖尿病溃疡是一种慢性并发症，由于感染风险高和抗菌素耐药性增加，因此难以管理，这需要开发更有效的伤口敷料。本研究旨在优化电纺参数和纳米壳聚糖（NCS）在聚乳酸（PLA）体系中的组成，以生产具有优异生物性能的纳米纤维基伤口敷料。该方法结合了基于响应面方法（RSM）的优化技术和体内评估。优化结果显示，在最佳条件下——即NCS浓度为5.76%、流速为8.03 mL/h、电压为21.64 kV时，可以生产出均匀无珠状的纳米纤维，平均直径为397 nm。NCS的添加显著提高了材料的弹性，表现为断裂伸长率约为76%。此外，亲水性也得到了增强，水接触角从114.52°降低到65.3°，表明材料与伤口液体的相互作用有所改善。随着NCS浓度的增加，抗菌活性也随之增强。在感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的糖尿病大鼠进行的体内研究表明，使用这些纳米纤维敷料比商业敷料能加速伤口愈合过程，表现为炎症减少、细菌定植减少以及胶原沉积更加有序。本研究科学地证明了工艺参数、纳米纤维结构和生物性能之间的相互关系。优化后的PLA/NCS纳米纤维在机械性能、抗菌性能和再生性能方面表现出优异的组合，因此具有成为更有效和可持续的糖尿病伤口治疗创新解决方案的潜力。

**1. 引言**
慢性伤口，包括压疮、静脉溃疡、糖尿病溃疡和术后伤口，已成为一个日益严重的全球健康问题，对医疗和社会经济产生了重大影响。据估计，每年有超过650万人患有慢性伤口，而且随着人口老龄化、肥胖以及糖尿病发病率的增加，这一趋势仍在持续（Sen, 2021）。在印度尼西亚，糖尿病已成为一个主要的公共卫生问题，2021年报告的病例接近2000万例。糖尿病溃疡是最严重的并发症之一，常常导致长期住院、高发病率甚至肢体截肢。这些伤口显著降低了患者的生活质量，并给医疗系统带来了沉重的经济负担。已经开发了多种先进的伤口敷料，包括水凝胶（Li et al., 2025）、气凝胶（Liu et al., 2025）和纳米纤维（Song et al., 2024）。其中，电纺纳米纤维因其结构和功能优势而脱颖而出。这项技术能够制造出纳米级的连续纤维，具有可控的形态、高孔隙率和较大的表面积（Liu et al., 2019）。纳米纤维结构紧密模仿了天然细胞外基质（ECM），为细胞粘附、增殖和迁移创造了理想的环境。此外，纳米纤维可以通过生物活性分子进行功能化，使其同时具备结构支撑和靶向药物输送的作用（Rahmati et al., 2021）。然而，在电纺过程中控制纳米纤维的形态，特别是实现均匀的纤维直径和最小化珠状物的形成，仍然是一个主要挑战。大多数先前的研究往往只是部分优化工艺参数或仅关注一个响应，因此未能提供控制纤维质量的综合方法。因此，本研究提出了一种基于响应面方法（RSM）的优化方法，同时考虑两个主要响应——纤维直径和珠状物数量，以获得能够生产出具有最佳和一致形态的纳米纤维的工艺条件。

最有前景的生物聚合物之一是壳聚糖，它是一种从甲壳类动物壳中提取的几丁质衍生物。壳聚糖是可生物降解的、生物相容的、具有止血作用，并且具有内在的抗菌性能（Moeini et al., 2020）。当将其制成纳米颗粒时，其有效性显著提高。纳米壳聚糖（NCS）由于其高表面电荷密度而表现出更强的抗菌活性。体内研究表明，NCS可以加速上皮再生、角质形成细胞迁移、胶原沉积和肉芽组织形成（Yadid et al., 2019）。将NCS整合到电纺纳米纤维中可以产生强大的协同效应，结合了NCS的抗菌和再生性能以及模拟天然ECM的结构功能。这种组合支持成纤维细胞的粘附和增殖，加速伤口闭合，并降低感染风险（Ramalingam et al., 2019）。然而，NCS在纳米纤维系统中的应用仍然相对有限，因为大多数先前的研究都集中在使用传统的壳聚糖上；因此，NCS的优势尚未在伤口敷料材料设计中得到充分利用。诸如生物对流等现象（描述了微生物在环境中的集体运动和分布）对于理解NCS等生物纳米材料与微生物在伤口中的相互作用非常重要，特别是在感染控制和提高伤口敷料效果方面（?wierczyńska et al., 2024）。

可生物降解的合成聚合物，如聚乳酸（PLA），进一步增强了纳米纤维作为伤口敷料的潜力。PLA因其生物相容性、可加工性和机械稳定性而在生物医学应用中得到广泛应用（Liu et al., 2023）。然而，纯PLA的一个主要缺点是缺乏抗菌活性，这限制了其在易感染伤口应用中的有效性。将PLA与纳米壳聚糖（NCS）结合是一种有前景的方法。将NCS整合到PLA基质中有可能生产出具有强结构性能和优异生物活性的纳米纤维。与通常使用大量壳聚糖且未系统优化的传统PLA/壳聚糖系统不同，本研究强调了利用具有更高表面积和反应性的纳米壳聚糖（NCS），并通过工艺参数优化方法更精确地控制纳米纤维的形态。尽管如此，研究PLA/NCS系统的研究仍然有限，尚未系统地优化其组成和工艺参数以实现最佳性能。由于糖尿病溃疡由于感染风险高和传统疗法效果有限而仍然是伤口护理的挑战，因此研究功能性且有效的伤口敷料至关重要。尽管基于生物聚合物的纳米纤维已经得到了广泛开发，但综合优化工艺参数、材料设计和生物评估的方法仍然有限，特别是在基于纳米壳聚糖的系统中。基于此，本研究假设通过多响应响应面方法（RSM）优化将纳米壳聚糖整合到PLA纳米纤维中，可以产生更可控的纤维形态，以及增强的抗菌活性和糖尿病伤口的愈合效果。因此，本研究旨在通过结合RSM的工艺参数优化和感染糖尿病伤口的体内性能评估，利用电纺方法开发NCS/PLA纳米纤维。图1展示了从制备过程优化和纳米纤维表征到生物评估的工作流程。本研究的新颖之处在于将多响应优化（纤维直径和珠状物数量）与体内生物验证相结合，从而系统地阐明了工艺参数、纳米纤维结构和伤口愈合性能之间的关系。因此，本研究有望促进更精准、有效且经过功能验证的基于生物聚合物的伤口敷料的发展。

**2. 材料与方法**
2.1. 材料
原材料包括聚乳酸（PLA）（Mw 90.000 g/mol，分析级，中国海航工业公司）、从虾壳合成的纳米壳聚糖（NCS，脱乙酰度81.75%，平均粒径420 nm，印度尼西亚苏拉巴亚10月10日技术学院工业废物处理实验室）、二氯甲烷（DCM，纯度≥99.8%，德国默克公司）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF，纯度≥99.8%，德国默克公司）和去离子水（实验室级）。使用铝箔作为收集器，10 mL注射器（Onemed）和21G针头用于溶液输送。设备包括电纺装置（图2）、Erlenmeyer烧瓶、50 mL烧杯、磁力搅拌器、热板搅拌器（Model 4658，Cole Parmer Instrument Company）、Ohaus分析天平和微量移液器。

2.2. 方法
2.2.1. 纳米纤维伤口敷料的制备
将PLA溶解在二氯甲烷（DCM）中，将NCS溶解在二甲基甲酰胺（DMF）中，考虑到它们的溶解特性和溶剂兼容性以确保聚合物完全溶解。两种溶液分别在室温（25 ± 2°C）下搅拌20分钟，以促进均匀分散并防止聚合物链聚集。然后将两种溶液混合并再搅拌10分钟，以获得均匀的聚合物混合物，这对于在电纺过程中获得均匀的纤维形态至关重要。将所得聚合物溶液装入注射器中，并根据响应面方法（RSM）设计中定义的实验变量使用电纺装置进行处理，从而系统地评估工艺参数对纤维直径和珠状物形成的影响。电纺过程在室温（25 ± 2°C）和相对湿度约40–50%的条件下进行。

2.2.2. FTIR分析
傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析用于识别官能团并确认PLA和NCS在纳米纤维复合结构中的化学相互作用。FTIR分析使用Agilent Cary 630红外光谱仪（美国）进行。纳米纤维样品在4000–400 cm?1的光谱范围内以4 cm?1的分辨率进行分析。测量前，样品被干燥以消除水分干扰，并直接放置在衰减全反射（ATR）晶体上进行扫描。记录得到的光谱并与纯PLA和NCS的参考光谱进行比较，以观察特征吸收峰和潜在的峰位移或强度变化。这些光谱变化被解释为分子相互作用，如氢键或物理混合，表明NCS成功融入PLA纳米纤维基质中。

2.2.3. 扫描电子显微镜（SEM）分析
扫描电子显微镜（SEM）是一种使用聚焦电子束来成像样品表面形态的电子显微镜。使用Hitachi SU3500 SEM观察表面形态。使用ImageJ软件分析纤维直径分布、平均直径和孔隙率，其中直径分布是通过测量每个样品的50根随机纤维来测量的。

2.2.4. 基于响应面方法（RSM）的优化
优化过程采用了基于响应面方法（RSM）和面心复合设计（FCCD），使用Design-Expert统计软件（Design-Expert Inc., ITS Surabaya, Indonesia）。评估了三个参数：NCS浓度（%）、进料速率（mL/h）和电压（kV），在预定的上限和下限范围内进行了20次实验运行（表1）。每次实验运行根据RSM设计进行一次。响应变量是珠状物数量和纤维直径。为了确保数据的可靠性，从每个样品的SEM图像中测量了20个不同点的纤维直径，并报告平均值以代表纳米纤维的形态。此外，通过平均每个样品两个相同大小SEM图像区域中观察到的珠状物数量来确定珠状物数量，从而提供珠状物形成的代表性估计。这种基于测量的重复实验用于捕捉样品内的变异性并提高结果的准确性，尽管没有进行完整的实验重复。实验后进行了方差分析（ANOVA），以确定每个参数的显著性并评估模型的适用性。表1展示了通过电纺制备纳米纤维的优化设计。

2.2.5. 机械分析
根据ASTM D630, Type V标准，使用LK10k万能试验机评估了拉伸性能。使用硅胶模具将样品切割成条状（宽度×长度，mm）。样品以10 mm/min的应变率拉伸直至失效。从应力-应变曲线计算杨氏模量、拉伸强度和断裂伸长率（εb）。

2.2.6. 疏水性分析
进行疏水性分析以评估纳米纤维样品的表面润湿性，通过其接触角来表示。将纳米纤维样品切成2 × 2 cm的片段并放置在平坦稳定的表面上。使用微量移液器小心地将50 μL的去离子水滴在样品表面以确定接触角。在液滴稳定后，水平拍摄图像以获得水滴的清晰轮廓。使用配备有接触角插件的ImageJ软件测量接触角。测得的接触角值用于确定表面特性：大于90°的角度表示疏水性行为，而小于90°的角度表示亲水性。2.2.7. 膨胀和吸收分析通过水吸收能力和膨胀率来评估生物聚合物的润湿性能。纳米纤维的水吸收能力使用以下公式（1）计算：将样品切成2×2厘米的正方形，并在烤箱中干燥72小时。首先称量样品的重量（w1），然后根据ASTM D570标准将其浸入水中24小时。浸入后，取出样品并轻轻擦拭表面水分，再测量最终重量（w2）。水吸收率通过以下公式计算：(1)水吸收率(%)=((w2?w1)/w1)×100同时记录纳米纤维的初始厚度（t1）和最终厚度（t2）。膨胀率使用以下公式计算：(2)膨胀率(%)=((t2?t1)/t1)×1002.2.8. 降解分析为了评估支架的降解行为，记录了PLA/NCS纳米纤维样品的初始干质量（D0，克）。然后将样品浸入磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH 7）中，并在36°C下孵育0-350小时。指定孵育时间后，取出样品，干燥至恒定重量，重新称重（D1，克）。降解率（D）使用以下公式计算：(3)D(%)=((D0?D1)/D0)×100%2.2.9. 抗菌分析使用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为测试菌株，将NCS/PLA纳米纤维敷料、商用壳聚糖/PLA敷料和标准医用纱布切成直径为1厘米的圆形片。使用微量移液器制备金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的悬浮液，并向琼脂培养基中加入每种悬浮液0.05毫升。标准医用纱布作为对照组。将样品放置在离培养皿边缘至少20毫米的地方，并在37°C下孵育24小时。测量抗菌抑制区，拍照并记录（Ghelich等人，2019年）。2.2.10. 体内分析进行了体内伤口愈合测试，以评估纳米纤维复合材料在治疗糖尿病伤口方面的性能。本研究使用小鼠作为实验对象。体内测试方案总结在图4中。首先诱导小鼠患上糖尿病，并监测一个月。确诊糖尿病后，在第-3天（h-3）通过将标准细菌悬浮液（10^8 CFU/mL）直接接种到伤口区域来诱导局部感染模型。在第0天（h0），在伤口感染后应用伤口敷料。几只小鼠被制造出直径为6毫米的伤口。实验动物被分为三组，每组六只。第一组接受PLA/NCS纳米纤维治疗，第二组接受商业产品（Aquacel）治疗，第三组作为未经治疗的阴性对照。观察8天的伤口愈合情况，使用数字卡尺在-3天、0天、2天、4天和8天分别测量五次伤口直径。为了进行组织病理学分析，每组牺牲两只小鼠，并收集伤口组织，使用苏木精和伊红（H&E）染色检查组织形态。组织病理学评分用于评估炎症评分和成纤维细胞密度作为伤口愈合参数。3. 结果与讨论3.1. 形态学和优化分析表2展示了不同NCS比例、进料速率和电压下PLA/NCS基纳米纤维伤口敷料的纤维直径和珠子数量分析结果。这些数据是通过使用扫描电子显微镜（SEM）进行形态学表征获得的，以评估静电纺丝参数对最终纤维结构的影响。表2. 纳米纤维伤口敷料的纤维直径和珠子数量分析运行代码自变量响应PLA/NCS比例进料速率（ml/h）电压（kV）纤维直径珠子数量D110522443.0514D25720392.332D35920592.950D45718484.595D507201128.614D610720701.7511D710918739.813D810922796.24D95722308.154D105720377.152D115720315.1D1210518778.216D1305181728.413D145720376.23D155720389.772D165720391.151D170522958.418D185520366.757D1909222596.80D2009183150.80使用扫描电子显微镜（SEM）分析纳米纤维的表面形态，以评估在不同条件下的纤维结构和形成的珠子数量。SEM图像提供了评估纤维均匀性、形态缺陷和纤维直径分布的重要视觉信息。珠子、球形结构或沿纤维的局部增厚通常是由于表面张力、溶液粘度和静电力之间的不平衡造成的。使用ImageJ软件从SEM图像中量化纤维直径分布（图3）。下载：下载高分辨率图像（913KB）下载：下载全尺寸图像图3. 形态学 (a) 5% NCS – 7 ml/h – 20 kV；(b) 5% NCS – 9 ml/h – 20 kV；(c) 5% NCS – 7 ml/h – 18 kV；(d) 0% NCS – 7 ml/h – 20 kV；(e) 10% NCS – 7 ml/h – 20 kV；(f) 5% NCS – 7 ml/h – 22 kV；(g) 5% NCS – 5 ml/h – 20 kV为了确定每个参数的影响，在不同参数设置下分析了平均纤维直径和珠子数量。进料速率的变化显著影响了含有5% NCS且在20 kV下的静电纺丝样品的纤维直径和珠子数量。如图4 (a)所示，将进料速率增加到7 ml/h时，纤维直径减小到377 nm，同时珠子数量显著减少到2个。然而，在9 ml/h的进料速率下，纤维直径显著增加到593 nm，而珠子数量减少到0个。图表显示珠子数量随着进料速率的增加而减少，而纤维直径随着进料速率的增加而增加。在这个过程中，进料速率是指聚合物溶液从注射器“泵送”通过针头的速率。进料速率过低会增加聚合物在到达收集器之前固化的概率，从而导致纳米纤维产品中形成珠子。然而，增加进料速率会导致更大的纤维直径，这是不希望的。Vashisth等人也报告了类似的发现，他们表明更高的进料速率会产生直径更大的纳米纤维（Vashisth等人，2014年）。下载：下载高分辨率图像（302KB）下载：下载全尺寸图像图4. (a) 进料速率对纤维直径和珠子数量的影响（5% NCS – 电压20 kV），(b) 电压对纤维直径和珠子数量的影响（5% NCS – 电压20 kV），(c) NCS百分比对纤维直径和珠子数量的影响（5% NCS – 电压20 kV），图4 (b) 显示了电压对纳米纤维形态的显著影响。在18 kV时，纤维直径为485 nm，珠子数量为5个。当电压增加到20 kV时，纤维直径减小到377 nm，同时珠子数量减少到2个。然而，进一步将电压增加到22 kV时，纤维直径减小到308 nm，而珠子数量增加到4个。图表表明，随着电压的增加，纤维直径和珠子数量呈下降趋势。在这个过程中，电压作为驱动力，通过电压产生的电场将聚合物溶液从针头传递到收集器。电压过低会导致传递力不足，从而增加聚合物在到达收集器之前固化的概率。在静电纺丝过程中，聚合物溶液受到静电力的作用，使针尖处的液滴拉伸成细长的喷射流。为了形成喷射流并产生光滑的纳米纤维，静电力必须足够强以克服溶液的表面张力。如果表面张力相对于施加的静电力过高，溶液不太可能被拉伸，更倾向于形成液滴或“珠子”而不是细纤维。这导致纳米纤维产品中形成珠子。此外，低电压会阻碍最佳纤维的形成，产生较大或不均匀的纤维。这些发现与Vashisth等人的报告一致，他们表明增加电压通常会产生直径更小的纳米纤维（Vashisth等人，2014年）。将电压增加到最佳点可以提供更强的静电拉力，使溶液更好地拉伸，形成更细、更均匀的纤维，同时减少珠子的形成。然而，过高的电压会破坏喷射流，增加珠子形成的可能性。总体而言，存在一个最佳电压，可以产生最小的纤维直径和最少的珠子数量。图4 (c) 显示了NCS含量对纳米纤维形态的显著影响。在NCS浓度为0%时，得到的纤维直径非常大，为1,828.60 nm，珠子数量为6个。当NCS浓度增加到5%时，纤维直径显著减小到377.15 nm，珠子数量减少到2个。然而，在10% NCS时，纤维直径再次增加到701.75 nm，珠子数量显著增加到11个。图表表明，在某个NCS浓度下，珠子数量和纤维直径都降至最低，然后随着壳聚糖百分比的继续增加而再次增加。在给定的操作条件下，含有0%壳聚糖或100% PLA的聚合物溶液会产生直径较大的纤维，因为PLA-DCM具有低表面张力和低粘度，因此在静电纺丝过程中产生较大的纤维。此外，PLA-DCM干燥非常快，导致其粘度在纤维拉伸过程中迅速增加。这种早期的粘度增加使PLA溶液更加“刚性”，不易拉伸成更细的纤维。此外，低表面张力和高干燥速度增加了纯PLA溶液形成珠子的倾向。当添加壳聚糖时，PLA-DCM/壳聚糖-DMF系统产生了表面张力更高、粘度更高、干燥更慢的聚合物溶液。将壳聚糖浓度增加到某个阈值会导致纳米纤维直径更小。这一结果与Vashisth等人的报告一致，他们指出更粘稠的溶液倾向于产生直径更小的纳米纤维（Bhattarai等人，2005年）。添加壳聚糖还增强了溶液的导电性，加强了静电纺丝过程中的静电拉伸力，从而产生更细、更均匀的纤维（Hernández-Vargas等人，2014年）。SEM图像显示纤维排列整齐，没有珠子聚集，表明工艺条件更稳定和最佳。然而，过量的壳聚糖增加了纤维直径。正如Hernández等人所报告的，在某些聚合物混合物（明胶和胶原蛋白）和TFA溶剂中，较高浓度的壳聚糖会产生直径更大的纤维（Sriyanti等人，2026年）。这是因为过量的壳聚糖使溶液粘度增加，使得在静电力作用下喷射流更难以拉伸和延长，从而产生更厚的纤维。使用方差分析（ANOVA）评估了SEM分析得出的纤维直径和珠子数量结果。进行此分析是为了确定研究中使用的每个变量是否对结果有显著影响。表3展示了伤口敷料制造的操作条件和成分的ANOVA结果。表3. 方差分析（ANOVA）纤维直径来源自由度平方和均方F值P值模型912084412134271259.410.000线性36221733207391191.760.000%NCS146294424629442204.830.000进料速率（ml/h）11275740127574056.440.000电压（kV）131655231655214.010.6232平方34737372157912469.870.000%NCS*%NCS12164329216432995.760.000进料速率（ml/h）*进料速率（ml/h）137530375301.660.2867电压（kV）*电压（kV）19259250.040.32212-way交互作用3112530737510216.600.000%NCS*进料速率（ml/h）19425999425994.380.062%NCS*电压（kV）113656813656816.080.0025进料速率（ml/h）*电压（kV）1461404614018.130.0017误差1056786.7322601拟合不足551338.494519777690.0239纯误差55448.246总计1912310427根据p值< 0.05确定显著变量（Sriyanti等人，2026年）。表3列出了纤维直径响应的ANOVA结果。从线性模型的角度来看，显著变量是%NCS和进料速率，而电压是一个不显著变量，其p值为0.6232。相比之下，从二次模型的角度来看，唯一显著的变量是%NCS，因为其他变量（进料速率和电压）的p值大于0.05。在两种模型中，电压变量都没有显著影响。相反，在2-way交互作用模型中，%NCS-电压交互作用的p值为0.0025，进料速率-电压交互作用的p值为0.0017。另一方面，%NCS和进料速率之间的交互作用没有显著影响，其p值为0.062。总结来说，RSM优化结果表明，%NCS是影响纤维直径的最主要因素，其次是进料速率，而电压本身没有直接效果，但通过与其他变量的相互作用产生了显著影响。这一结果与Sriyanti等人的研究结果相反，他们的研究调查了PVP/PCL纳米纤维直径的优化，并证明了电压对最终直径的重要性（Fatahian和Erfani，2025年）。相比之下，Fatahian等人使用PLA原料优化纳米纤维的研究显示了类似的结果，其中流速是一个重要参数，而电压对纤维直径没有显著影响（Ambarita等人，2023年）。根据所用变量与响应变量（纤维直径）之间的关系，推导出了一个回归方程。所得方程（4）如下：

(4) 纤维直径（nm）= 397.69 - 230.4×%NCS + 127.18×进料速率 + 12.18×电压 + 521.47×（%NCS×%NCS） + 51.14×进料速率×进料速率 - 47.34×电压×电压 - 55.76×%NCS×进料速率 - 106.84×%NCS×电压 + 113.44×进料速率×电压

根据该方程，从分析数据中计算出了R2值；较高的R2值（接近100%）表示变量之间的关系更强。本研究中R2值的模型总结如下表4所示。在纤维直径响应模型中，R2值为96.65%，调整后的R2值为95.41%，表明该模型对实验数据的拟合度非常好，且涉及的不显著变量很少。尽管预测的R2值为84.43%较低，但与调整后的R2值仍具有相当好的吻合度，差异小于20%，表明该模型仍具有可接受的预测能力。这一结果与Aulia等人的研究相比相当好，他们在优化模型中显示的预测R2值为-64.64%（Ramadhani，2017年）。在那项研究中，根据p值评估，模型中包含了一些不显著的变量。此外，标准差（S）值为150.338，表明数据相对于平均值的变化较大，这可能是由于电纺过程的变异性以及异常值的存在；然而，这并没有显著降低模型表示实验数据主要趋势的能力。

表4. 纤维直径R2值的模型总结
SR2 adjR2 pred
150.338 96.65% 95.41%
84.43%

图5(c)中的残差诊断分析显示，大多数数据点遵循正态分布图的对角线，表明模型拟合良好。这与高R2值一致，表明模型能够准确且精确地表示实验数据，尽管在某些点上有轻微偏差。图5展示了在达到最佳条件时变量之间关系的可视化表示。图5(a)-(c)通过等高线图展示了两个变量对纤维直径的交互作用，其中深蓝色区域表示最小直径。图5(e)-(g)中的表面图作为3D表示也标记了该区域的最优点。在流速和%NCS的交互作用中，当NCS含量为2-10%且流速较低时，可以获得直径<500 nm的纤维。电压和%NCS的交互作用也显示出类似的趋势，高电压增加了获得直径<500 nm的概率。同时，高电压和低流速的组合也产生了最佳条件。总之，RSM结果表明，在一定的%NCS范围内，通过流速和电压的组合可以实现直径<500 nm的纤维，这证实了参数交互作用在确定最佳条件中的重要性。

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图5. (a), (b), (c) 纤维直径等高线图, (d) 纤维直径概率图, (e), (f), (g) 纤维直径表面图

表5展示了珠子数量响应的ANOVA结果。从线性模型的角度来看，显著变量是%NCS和进料速率，而电压是一个不显著变量，其p值大于0.05，具体为0.095。相比之下，从二次模型的角度来看，唯一显著的变量是%NCS，因为其他变量进料速率和电压的p值分别大于0.05，即0.468和0.058。在双向交互模型中，所有变量交互作用都显示出显著效果，所有变量之间的交互作用的p值均小于0.05。总之，RSM优化结果表明，%NCS是影响珠子数量的主要因素，而进料速率仅在线性模型中显著，电压没有直接效果。然而，所有变量之间的交互作用都有显著贡献，这证实了珠子形成受到过程参数组合的同时影响。使用RSM方法优化珠子数量响应的结果在其他研究中尚未报道。尽管如此，参数效应与珠子数量之间的相关性在图4的解释中有描述。

表5. 珠子数量的分析（ANOVA）
来源 自由度 平方和 均方 F值 P值
模型 9 41.41 87 1.26 94 9.55 0.000
线性 33 9.11 10 3.33 1.64 0.000
%NCS 14 4.14 4.13 0.66 0.000
进料速率（ml/h）12 60.12 60.11 80.5 0.000
电压（kV） 14 9.4 4.93 3.41 0.095
平方 32 18 88 0.60 65 0.050
%NCS*%NCS 18 4.56 84.56 85 8.80 0.000
进料速率（ml/h）* 10 81 80.81 0.57 0.468
电压（kV）* 电压（kV）16 56 86.56 4.57 0.058
双向交互 39 0.53 0.167 20.98 0.000
%NCS*进料速率（ml/h）14 0.54 0.52 8,160.000
%NCS*电压（kV）13 23 22 2.25 0.001
进料速率（ml/h）*电压（kV）11 81 12.52 0.005
误差 10 14.38 21.43 82.31 0.075
纯误差 52.83 30.56 7 0.075
总计 196 55.8

根据变量与响应变量之间的关系，推导出了一个回归方程。所得方程（5）如下：

(5) 珠子数量 = 2.28 - 2.1×%NCS - 5.1×进料速率 - 0.7×电压 + 5.5×（%NCS×%NCS） + 0.5455×进料速率×进料速率 + 1.55×电压×电压 + 2.25×%NCS×进料速率 - 2×%NCS×电压 - 1.55×进料速率×电压

根据该方程，本研究中R2值的模型总结如下表6所示。在珠子数量响应模型中，R2值为97.81%，调整后的R2值为95.83%，表明该模型对实验数据的拟合度非常好，且涉及的不显著变量很少。尽管预测的R2值为86.85%较低，但与调整后的R2值仍具有相当好的吻合度，差异小于20%，表明该模型仍具有足够的预测能力。此外，相对较低的标准差（S）值1.19924表明数据围绕平均值的分布较小；因此，该模型在表示实验数据方面具有很好的精度。

表6. 珠子数量R2值的模型总结
SR2 adjR2 pred
1.19924 97.81% 95.83%
86.85%

图6(c)中的残差诊断分析显示，大多数数据点遵循正态分布图的对角线，表明模型拟合良好。然而，有一个数据点显著偏离了这条线，表明存在一个异常值，导致偏离正态分布。尽管如此，高R2值表明模型仍然能够充分表示数据的主要趋势，尽管预测精度受到这个异常值的影响。图6(a)-(c)通过等高线图展示了两个变量对珠子数量的交互作用，其中深蓝色区域表示最小珠子数量。图6(e)-(g)中的表面图作为3D表示也标记了该区域的最优点。在流速和%NCS的交互作用中，在0-8% NCS范围内获得了最小珠子数量，流速较高时珠子形成的可能性增加。电压和%NCS的交互作用表明，在0-6% NCS范围内珠子形成最少。同时，高电压和高流速的组合也产生了最佳条件。总之，RSM结果表明，珠子数量受到%NCS、流速和电压组合的显著影响，这证实了参数组合在实现最佳条件中的重要性。

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图6. (a), (b), (c) 珠子数量等高线图, (d) 珠子数量概率图, (e), (f), (g) 珠子数量表面图

根据分析，有一组最佳条件可以生产出最佳的纳米纤维基伤口敷料。这些最佳条件是根据图7中显示的可行性图确定的。

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图7. 可行性图

可行性图显示了每个变量对珠子数量和纤维直径的影响。可行性图中呈现的每个参数的效果趋势与图4中的讨论一致。在进料速率为8.0303 ml/h和电压为21.6364 kV的情况下，使用5.7576%的壳聚糖溶液，实现了产生纤维直径小且珠子数量少的最佳操作条件，这与表7中的优化总结结果一致。

表7. 伤口敷料的优化总结
%NCS 进料速率（ml/h） 电压（kV） 珠子数量 纤维直径（nm）
5.757 88.0303 21.6364 0.00
20 745 397.322

在这些最佳条件下获得的伤口敷料估计珠子数量接近0，纤维直径为397.322 nm。这个可行性值是一个用于优化的函数，表明程序能够根据最终产品的标准满足预期结果。获得的可行性值表明该程序可以有效地生成一个操作条件模型，以生产最佳的伤口敷料产品。

图8
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图8. 最佳点处的纳米纤维形态：(a), (b) 第一次复制；(c), (d) 第二次复制；(e), (f) 第三次复制

为了验证优化结果，再次在最佳操作条件下进行了数据测试，并将优化结果的理论数据与实验数据进行了比较。误差使用RMSe（均方根误差（RMSE）根据以下公式计算：

(5a) ∑(t-1) | At - Ft)2 / n
其中At是实际值，Ft是理论值，n是RMSe数据点的数量。以下展示了预测产量与实验产量之间的比较。

根据上表，用于验证优化结果的实验纳米纤维直径范围为396.46至397.39 nm，RMSE为0.551，相对于预测的纳米纤维直径397.322 nm。本研究中获得的纤维直径处于皮肤组织细胞外基质（ECM）的尺寸范围内。纳米纤维通常定义为直径在1到1000 nm之间的结构，对于≤400 nm的尺寸已报告了显著的生物反应（Partovi等人，2024年）。优化验证的实验珠子数量为0，RMSE为0.002，与预测值0.0020745相比。均方根误差（RMSE）是观察值和模拟值之间绝对误差的度量。这个统计指标的范围是从0到无穷大（+∞），较小的值表示模拟性能更好（Kouzehgar和Eslamian，2023年）。根据这些结果，接近零的小RMSE值表明在最佳操作条件下的实验结果与预测一致，因此被认为是有效的。通过计算理论值和实验值之间的实验误差，重新测试了数据以验证最佳模型。结果分别显示在表8和表9中。获得的误差低于重复测试的容忍限（<5%），表明最佳点得到了很好的拟合。

表8. 预测和实验纳米纤维直径的比较
变量 预测纤维直径（nm） 实验纳米纤维直径（nm） RMSe
%NCS 5.757 839.322
进料速率（ml/h） 8.030 396.46 396.92
电压（kV） 21.636 21.636

表9. 预测和实验珠子数量的比较
变量 预测珠子数量 实验珠子数量 RMSe
%NCS 5.757 80.00 0.00
进料速率（ml/h） 8.030 0.00 0.00
电压（kV） 21.636 21.636

3. 机械性能表征
电纺PLA纳米纤维的机械性能对其作为伤口敷料的使用至关重要，因为它们影响使用过程中的柔韧性和结构完整性。在这项研究中，进行了拉伸测试以评估NCS掺入对PLA纳米纤维机械性能的影响。为了支持机械结果，使用了FTIR分析来研究PLA和NCS之间的分子间相互作用，同时使用SEM-EDX分析来确认NCS在PLA纳米纤维基质中的元素分布和分散情况，这在机械增强中起着重要作用。

纳米纤维伤口敷料的拉伸测试旨在确定材料的机械强度、弹性和硬度，表现为拉伸强度、断裂伸长率和杨氏模量。在这项研究中，进行了机械测试以阐明NCS掺入PLA纳米纤维后机械性能的变化趋势。因此，系统评估了含有0%、5%和10% NCS的纳米纤维样品，以评估NCS含量对复合纳米纤维机械性能的影响。这些参数对于确保敷料在应用于受伤皮肤时足够强、柔韧和舒适至关重要。如图9(a)所示，将NCS掺入复合基质显著影响了PLA的机械性能。在没有NCS（0%）或仅含100% PLA的纳米纤维中，杨氏模量和抗拉强度分别达到最高值8.25 MPa和0.49 MPa，而断裂伸长率非常低（14.17%），这表明PLA具有较高的硬度和脆性。聚乳酸（PLA）是一种可生物降解的聚合物，以其良好的机械强度而闻名，但其固有的脆性是一个缺点。这种脆性意味着PLA在受到突然应力或应变时容易开裂或断裂，因为其断裂伸长率低且弹性有限。这种脆性被认为是PLA在需要柔韧性或抗变形应用中的主要缺陷，通常需要通过添加增塑剂或填料等成分来改善其柔韧性和抗裂性（Farah等人，2016年）。下载：下载高分辨率图像（414KB）下载：下载全尺寸图像图9. (a) NCS含量对机械性能的影响，(b) 纳米纤维的FTIR分析，(c) 在不同NCS含量（7 mL/h – 20 kV – 5%）下的SEM-EDX测试结果。当添加5%的NCS时，杨氏模量和抗拉强度分别降至1.33 MPa和0.43 MPa，而断裂伸长率显著增加到73.83%。这表明添加NCS使材料变得更加有弹性和柔韧性，尽管强度和硬度有所下降。当NCS含量增加到10%时，这一趋势持续：杨氏模量和抗拉强度进一步降至0.37 MPa和0.21 MPa，而断裂伸长率略微增加到80.36%。随着NCS含量的增加，杨氏模量和抗拉强度的降低可以归因于NCS本身的机械特性，即NCS具有柔韧性但强度不高。壳聚糖具有优良的机械性能，特别是柔韧性，这种性能可以通过薄膜和纳米纤维形成等加工技术得到保持或增强（Rinaudo，2006年）。因此，断裂伸长率的增加表明NCS起到了天然增塑剂的作用，提高了材料的柔韧性。断裂伸长率超过70%被认为与天然皮肤柔韧性和类似皮肤细胞外基质（ECM）的机械行为范围一致（Pawlaczyk等人，2013年）。断裂伸长率超过70%也与皮肤细胞外基质（ECM）的机械性能相符（Ghelich等人，2019年）。尽管随着NCS含量的增加，杨氏模量和抗拉强度有所下降，但所得到的机械性能仍符合临床可接受的伤口敷料材料标准，在这些材料中，柔韧性和适应性比高硬度或承载能力更为重要（Culbreath等人，2024年）。重要的是，伤口敷料不应过于坚硬，因为过于刚性的材料可能会引起患者不适，阻碍与不规则伤口表面的贴合，并限制愈合过程中的自然皮肤运动。因此，较低的杨氏模量结合高断裂伸长率对于实际伤口敷料应用是有利的。总体而言，NCS的加入使材料的性质从硬而脆转变为更具弹性，尽管牺牲了一定的抗拉强度和硬度。根据图9(b)中的FTIR光谱，识别出PLA和壳聚糖基纳米纤维敷料的几个特征峰，表明这两种材料都含有特定的功能基团。1750 cm?1处的强峰表明存在强烈的羰基（C=O）伸缩，这是PLA的主要特征。此外，2998 cm?1处的峰表明存在C–H伸缩，这也源自PLA结构。这些峰证实了PLA的基本结构在混合物中保持完整。复合材料中壳聚糖的存在通过1465 cm?1处的峰得到证实，该峰代表胺（NH?）基团的弯曲振动，以及1380 cm?1处的峰代表C–H弯曲。1008 cm?1处的另一个峰表明NCS醋酰胺中的C–O键伸缩，这些光谱结果与Li等人的研究一致（Negut等人，2020年）。总体而言，该FTIR光谱证实了PLA和壳聚糖在纳米纤维结构中的成功混合。图9(c)和表10中的SEM-EDX表征结果显示，PLA和壳聚糖基纳米纤维（含有5%壳聚糖）主要含有碳（C）、氮（N）和氧（O）三种元素。碳和氧是主要元素，其重量百分比分别为47.18%和49.03%，这与聚乳酸（PLA）的化学结构相符，PLA由碳链和酯基团（–COO–）组成。同时，氮的含量为3.79%（按重量计），表明壳聚糖对纳米纤维结构的贡献。表10. C、N、O原子的定量分布元素% 重量% C 47.18 54.08 N 3.79 3.73 O 49.03 42.19 EDX光谱中氮的存在是壳聚糖结构中胺基团（–NH?）的特征，而在PLA中不存在氮。这证实了壳聚糖已成功分散在PLA纳米纤维基质中。尽管氮的含量相对较少，但它与混合物中初始设定的5%壳聚糖含量一致。因此，EDX结果支持了壳聚糖成功整合到纳米纤维中的结论，这一点非常重要，因为壳聚糖的存在赋予了纳米纤维抗菌性能并增强了其生物活性。图9(c)显示了测试纳米纤维区域中各种原子的分布。氮（N）原子的分布用蓝色点表示，分布均匀，没有集中在任何特定区域。由于氮原子代表壳聚糖化合物，这表明壳聚糖有效地分散到了PLA基质中。NCS在纳米纤维基质中的均匀分布进而影响了材料的物理性质，从而决定了其与伤口环境的相互作用及其作为伤口敷料的性能。

3.3. 物理特性
伤口敷料材料的物理特性对于维持湿润的伤口环境、促进液体吸收和支持组织再生至关重要。在本研究中，通过水吸收、孔隙率、膨胀率和降解分析以及疏水性等指标评估了静电纺丝纳米纤维膜的物理性能。这些测试提供了关于纳米纤维结构与生理液体之间相互作用、材料稳定性和润湿性的全面见解，这些都是影响渗出物管理、氧气渗透性和整体伤口愈合性能的重要参数。图10(a)显示了不同NCS浓度对水吸收、孔隙率和膨胀率的影响。使用微米测量仪测得的膨胀厚度在每个样品中都有所增加，纯PLA的膨胀厚度最低，而含有10% NCS的样品膨胀厚度最高。PLA的疏水性导致100% PLA纳米纤维的膨胀程度最小。NCS的添加显著影响了膨胀程度，因为NCS含有羟基和胺基团。生物复合材料中的羟基增强了与水分子的氢键形成（Li等人，2022年）。

NCS含量还影响了纳米纤维的孔隙率。在一定范围内，NCS含量的增加提高了纳米纤维的孔隙率。孔隙率定义为孔隙面积与总材料面积的比率。在这种情况下，孔隙率与第3.1节讨论的纳米纤维形态有关。0% NCS或100% PLA纳米纤维由于纤维直径较大，导致孔隙率较低。相比之下，5% NCS样品中纤维直径的减小使得孔隙率增加。然而，在10% NCS纳米纤维中观察到孔隙率下降，可能是由于形成了珠状颗粒，减少了纳米纤维内的空隙体积。孔隙率与水吸收成正比。图10(a)也显示了孔隙率与水吸收之间的类似趋势。较大的孔径允许纳米纤维捕获更多的水分，从而增加其水吸收率（Ibrahim等人，2023年）。总体而言，NCS含量的增加提高了膨胀能力、孔隙率和水吸收率，达到最佳条件。然而，在高浓度（10%）下，由于珠状颗粒的形成，孔隙率下降。伤口敷料材料的降解行为对伤口愈合过程很重要，因为过慢的降解可能会阻碍组织再生，而过快的降解则会损害伤口处的结构支撑。因此，适度和可控的降解速率是理想的，既能保持支架的完整性，又能允许组织逐渐生长。图10(b)显示了PLA/NCS纳米纤维膜随时间的降解过程。总体而言，PLA/NCS纳米纤维表现出渐进且可控的降解趋势，初期由于NCS的亲水性而快速降解，随后由于PLA基质的作用而进入更稳定的降解阶段，从而实现了结构稳定性和组织再生能力之间的平衡。结果表明，PLA/NCS纳米纤维表现出渐进的降解行为，初期损失约为14.8%，72小时后重量损失约为51.1%。随着降解时间的延长，降解速率逐渐增加到360小时后的68.9%，表明材料在生理环境中持续分解。初始降解可归因于NCS的亲水性，它促进了水的渗透并加速了纳米纤维基质的水解降解。在较长时间浸泡下观察到的较慢降解趋势表明PLA骨架有助于保持结构稳定性。Pei Feng等人关于聚乳酸支架降解机制和加速策略的研究表明，PLA支架的降解速率相对较慢，添加生物聚合物可以加速其降解速率（Hekmati等人，2014年）。在本研究中，使用100% PLA（不含NCS）制备纳米纤维敷料时，即使工艺参数（如电压和流速）有所变化，接触角也相对较高，约为114.52°。这种稳定性表明纯PLA本身具有疏水性，使其不太适合需要亲水性能来支持伤口渗出物吸收的伤口敷料应用。这些发现强调了材料改性的必要性，例如添加亲水填料，以改善PLA在生物医学应用中的性能（如先前报道的）。图10(c)显示，增加NCS的百分比显著降低了接触角。在没有NCS（0%）的情况下，接触角较高（±114.52°）；然而，随着NCS含量的增加，接触角降至约40°。这种降低归因于NCS的亲水性，NCS含有吸引水分子的羟基和胺基团，从而降低了接触角。Chen报告称100% PLA纳米纤维的接触角约为140°，表明PLA本身具有很强的疏水性。这种过强的疏水性限制了PLA作为伤口敷料基材的应用。理想的伤口敷料应保持适当的湿度水平。过强的疏水性会阻碍渗出物的吸收，导致液体在伤口周围积聚，从而延缓愈合。此外，疏水性表面生物相容性较差，可能抑制细胞黏附和增殖，而这些过程对组织再生至关重要。相反，过于亲水的敷料也不理想，因为它们可能会过度附着在伤口表面，增加组织损伤和感染的风险。因此，在亲水性和疏水性之间取得平衡至关重要（Feng等人，2021年）。NCS添加后接触角的降低与Samokhin（Chen等人，2023年）的研究结果一致，他们发现将壳聚糖加入PLA纳米纤维复合材料后接触角降低。接触角的降低表明材料表面变得更加亲水。

3.4. 伤口愈合性能
糖尿病患者常见慢性伤口。糖尿病伤口涉及表皮、真皮和皮下组织的损伤。这些伤口容易受到感染，尤其是由多重耐药细菌（如金黄色葡萄球菌）引起的感染，因为伤口环境潮湿、血糖水平高以及患者的免疫系统较弱。感染会加重伤口状况并阻碍愈合过程（Silva等人，2023年）。因此，我们进行了NCS/PLA纳米纤维作为抗菌递送系统和静电纺丝组织支架的体内测试，以确保伤口愈合的高效性和安全性。体内测试按照2.2.10小节中的描述进行，并显示在图11(a)中。下载：下载高分辨率图像（657KB）下载：下载全尺寸图像图11. (a) 体内测试方案，(b) 每个变量的每日伤口可视化，(c) 观察第8天之前的小鼠伤口面积，(d) 三个治疗组的伤口面积（以平方毫米计）和伤口愈合百分比的比较。为了进行比较，第一组小鼠接受了商业产品Aquacel的治疗作为阳性对照，第二组接受了NCS/PLA纳米纤维样本的治疗，第三组作为阴性对照，这些小鼠仅被伤口感染而没有接受任何愈合治疗。本研究遵循了协议，并获得了Nidom基金会（IACUC-PNF）的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，批准号为010425/IACUC/VII/2025。在这项研究中，我们使用了糖尿病小鼠模型，通过切除方法使伤口感染了MRSA。伤口面积使用卡尺测量。观察了直到感染后第8天的愈合过程。图11(b)显示了每个变量每日伤口面积的比较成像结果。从视觉上看，第3天的MRSA感染是成功的，因为在所有变量中第0天就出现了黄白色的脓液，并且在随后的几天里也是如此。伤口中观察到的脓液是由中性粒细胞和白细胞对抗MRSA产生的；在这个过程中，许多身体组织、白细胞和细菌死亡并转化为脓液。第8天，接受愈合纳米纤维治疗的小鼠表现出最好的结果，伤口几乎闭合，没有感染扩散或扩大，这从伤口周围小鼠毛发的初步再生可以得到证明。图11(c)展示了从第3天到第8天三个样本组（Aquacel、纳米纤维和阴性对照组）的伤口面积数据。第2天，Aquacel组（阳性对照）的伤口面积为44.82平方毫米，而纳米纤维组为48.43平方毫米。相比之下，阴性对照组的愈合速度较慢，伤口面积为68.61平方毫米，比第0天的初始测量值要大。这可能是由于MRSA感染仍然具有毒性，到第2天时伤口敷料和身体的免疫系统都无法有效对抗它。Aquacel组与阴性对照组之间以及纳米纤维组与阴性对照组之间的差异具有统计学意义（p < 0.05）。到第4天，Aquacel组进一步愈合，伤口面积为34.30平方毫米，几乎与纳米纤维组的34.38平方毫米相同，表明两者效果相当。阴性对照组继续显示出较慢的愈合速度，伤口面积为61.68平方毫米。两组与阴性对照组之间的差异非常显著（p < 0.01）。第8天，Aquacel组的伤口面积为41.07平方毫米，而纳米纤维组表现出优异的结果，伤口面积减少到24.07平方毫米。纳米纤维组和Aquacel组的伤口愈合情况明显优于阴性对照组（p < 0.01）。总体而言，趋势显示纳米纤维组随时间的伤口面积减少最为显著，其次是Aquacel组，而阴性对照组的愈合速度最慢。为了便于分析接受不同治疗的三个小鼠组之间的伤口愈合进展，计算了伤口愈合百分比。该参数是通过测量每次观察日伤口面积与第3天（小鼠首次受伤并感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）时的初始伤口面积之间的差异来获得的。伤口面积的减少被标准化到第3天的初始伤口大小，以确定愈合百分比。图11(d)展示了整个八天观察期间三个治疗组的伤口面积（以平方毫米表示）及其相应的伤口愈合百分比的比较分析，即作为阳性对照的Aquacel处理组、接受纳米纤维伤口敷料处理的组以及未经处理的阴性对照组。结果清楚地表明，与其它组相比，纳米纤维处理组的愈合趋势最为明显。第2天，纳米纤维处理组的伤口尚未完全闭合，伤口面积减少了约28%。Aquacel处理组（约19%）和阴性对照组（约48%）也观察到了类似的减少。这种早期伤口闭合的受限可以归因于从第3天到第2天持续的MRSA感染，在此期间伤口敷料尚未完全控制细菌定植。这种情况因小鼠的糖尿病状态而进一步加剧，已知糖尿病会延迟伤口愈合。总体而言，趋势显示纳米纤维组随时间的伤口愈合百分比增加最快且最一致，其次是Aquacel组，而阴性对照组的愈合进展最慢。从第2天到第8天，纳米纤维组在加速组织再生方面继续表现出最高的有效性，愈合率为25%。相比之下，Aquacel组的变化为-9%，而阴性对照组的变化为-21%，表明伤口进一步恶化。这些结果表明，Aquacel组和阴性对照组中的细菌感染抑制效果不佳；相反，伤口状况恶化了。只有接受纳米纤维伤口敷料处理的小鼠组出现了愈合。这表明PLA/NCS纳米纤维成功阻止了MRSA感染，使炎症阶段完全解决并进入下一个阶段——增殖阶段。在这个阶段，新的血管形成，成纤维细胞迁移到伤口中，并产生对愈合过程至关重要的基质（Samokhin等人，2023年）。为了进一步研究PLA/NCS基纳米纤维伤口敷料在九天治疗后增强MRSA感染小鼠糖尿病伤口愈合的效果，从缺损区域收集的皮肤组织样本用苏木精和伊红（HE）染色。图12(a)显示了接受Aquacel（阳性对照）处理的组的HE染色结果。对感染伤口组织的组织病理学观察显示上皮层破裂，表明由于创伤和感染引起的炎症过程，外层保护屏障被撕裂，表明组织完整性受到破坏。在伤口区域观察到炎症细胞的浸润，包括多形核细胞（如中性粒细胞），它们在早期炎症阶段通过破坏细菌和清除坏死组织发挥关键作用，以及单核细胞（如巨噬细胞和淋巴细胞），它们在后期和慢性炎症阶段出现以支持愈合过程和新组织的形成。此外，还发现了出血，定义为伤口内血管破裂导致的出血，表明血管在严重感染和炎症反应中的损伤。炎症是伤口愈合过程的第二阶段，通常涉及糖酵解的增加，导致局部组织环境酸化，这对伤口恢复不利。这些发现代表了身体对抗感染并启动受损组织再生的生物反应。总体而言，对照组（Aquacel）的组织病理学结果显示愈合效果不佳，特征是上皮层破裂、高炎症细胞浸润和出血，表明组织损伤和仍然占主导的炎症反应。这表明伤口仍处于炎症阶段，未能有效过渡到增殖阶段，从而阻碍了组织再生过程。下载：下载高分辨率图像（905KB）下载：下载全尺寸图像图12. (a) 阳性对照（Aquacel），(b) 纳米纤维伤口敷料，(c) 阴性对照的组织病理学分析。与阳性对照（Aquacel）相比，图12(b)中的组织病理学图像显示该样本的组织愈合过程比未经治疗的感染伤口组更先进。在纳米纤维样本中，上皮层没有严重破裂；相反，观察到薄的上皮层，表明上皮再生处于早期阶段。此外，细菌定植显著减少，只有少量的嗜碱性细胞定植，表明感染控制更为有效。细菌定植的减少被认为有助于减轻持续的炎症反应，从而促进伤口愈合从炎症阶段向增殖阶段的过渡。这种改善的生物反应可以与PLA/NCS纳米纤维敷料的物理特性相关联，特别是其纳米纤维网状结构，它紧密模仿了天然皮肤组织的细胞外基质（ECM）。ECM类似的架构为细胞粘附、迁移和增殖提供了有利的微环境，从而支持成纤维细胞的活动和胶原蛋白的沉积。此外，成纤维细胞、纤维细胞和有序排列的胶原束的存在表明组织重塑得到增强，可能表明血管生成活性增加，这在为再生组织提供氧气和营养物质方面起着关键作用。Ali等人对糖尿病伤口进行了基于PLA的纳米纤维的体内测试，并显示了加速糖尿病伤口愈合的满意结果（Garg等人，2018年）。此外，Rajalakshmi等人指出，如壳聚糖这样的生物聚合物不仅支持细胞增殖、血管生成和组织修复，还作为有效的药物递送载体，增强治疗剂在伤口部位的作用，加速细胞反应（Gurtner等人，2008年）。PLA/NCS纳米纤维敷料形成一个均匀的基质，使纳米壳聚糖（NCS）在纤维结构中均匀分布。在湿润的伤口环境中，纳米纤维与渗出物相互作用，促进NCS的逐渐释放，从而实现持续的抗菌活性。此外，纤维表面的一些NCS可以直接与细菌接触，提供即时的抗菌效果。这种受控释放和直接接触的结合，加上纳米纤维的高表面积和孔隙性，增强了NCS在抑制感染伤口中细菌生长的效果（Begnaud等人，2016年）。这种细菌负荷的减少有助于减少炎症反应，并创造一个更有利的伤口环境，从而加速组织再生和愈合。此外，相互连接的纳米纤维网络作为临时支架，引导新组织的形成，同时保持与伤口表面的紧密接触，最终促进伤口闭合和皮肤再生。NCS的使用可能通过其潜在的免疫调节作用进一步促进这一过程，帮助调节炎症反应并支持平衡的愈合环境。在伤口愈合过程中，真皮层中的胶原纤维沉积起着关键作用，加速组织修复，更多的胶原纤维沉积通常与更好的愈合结果相关（Pastar等人，2014年）。总之，组织病理学结果表明，与对照组相比，PLA/NCS纳米纤维敷料加速了伤口愈合，表现为早期上皮再生、细菌定植显著减少和炎症反应减弱。此外，成纤维细胞活性增加、胶原沉积有序以及类似ECM的组织结构表明增殖和重塑过程更有效，从而支持加速的组织再生。根据图12(c)（未经治疗的阴性对照）所示的组织病理学结果，伤口仍处于严重的、不受控制的炎症状态。这由极高的多形核细胞（PMNs）数量表明急性炎症阶段正在进行，以及大量的单核细胞表明慢性炎症持续存在。组织状况还显示出由于血管破裂导致的出血以及嗜碱性细菌的定植，表现为深色染色点的簇，这些点表明在没有有效保护的情况下，细菌附着并在伤口区域繁殖（Xue等人，2021年）。总体而言，这些结果表明，阴性对照组的愈合过程严重受损，尚未进入组织再生阶段。这一发现提供了一个重要的对比，进一步证明了本研究中开发的PLA/NCS纳米纤维材料的有效性，其中经过纳米纤维处理的样本表现出明显的较低炎症反应、减少的细菌定植以及更有序的新组织形成，表明其愈合过程比阴性对照组更为显著。因此，可以强调PLA/NCS纳米纤维作为有效的伤口敷料具有强大的潜力，能够加速伤口愈合并控制感染，其性能可与商业产品相媲美。作为伤口愈合早期阶段的一个重要参数，伤口敷料的应用在抑制炎症方面显示出积极的效果。糖尿病伤口的特点是持续的炎症；因此，有效调节伤口组织中的炎症对于成功愈合是必要的（Ali等人，2023年）。图13(a)中的炎症评分显示，阳性对照组（Aquacel Ag+）的炎症水平最低（0.87），表明其炎症解决得更好，伤口状况也更稳定。NCS/PLA纳米纤维组的炎症评分中等（2.93），表明炎症过程仍在进行中，但已被控制，并趋向于增殖阶段。相比之下，阴性对照组的评分最高（3.67），显示出广泛的持续白细胞浸润，表明感染或炎症未得到解决。统计上，阳性对照组与纳米纤维组之间的差异显著（p=0.001），而纳米纤维组与阴性对照组之间的差异不显著（p=0.35），尽管纳米纤维组相比阴性对照组有改善的趋势。这些发现表明，NCS/PLA纳米纤维比无治疗情况下更好地抑制了炎症反应，尽管其效果仍低于阳性对照组。Ji Suk Choi等人进行的研究表明，使用静电纺丝纳米纤维治疗糖尿病溃疡的体内伤口愈合在抑制炎症和促进伤口愈合过程方面有显著改善（Vinanthi Rajalakshmi等人，2025年）。下载：下载高分辨率图像（284KB）下载：下载全尺寸图像图13。(a) 炎症评分分析，(b) 成纤维细胞密度此外，在进入伤口愈合的增殖阶段时，成纤维细胞密度是一个反映组织再生活动和细胞外基质形成的重要参数。糖尿病伤口通常表现出细胞增殖受损；因此，成纤维细胞计数的增加是加速愈合治疗成功的一个指标。图13(b)中的成纤维细胞密度显示，NCS/PLA纳米纤维组的值最高（420个细胞/平方毫米），表明成纤维细胞增殖受到显著刺激，新组织形成活动更为活跃。阴性对照组的成纤维细胞密度较低（240个细胞/平方毫米），表明再生过程有限，而阳性对照组（Aquacel Ag+）的值最低（40个细胞/平方毫米），表明增殖阶段已经提前开始，成纤维细胞活动开始下降。统计上，阳性对照组与纳米纤维组之间的差异显著（p=0.0064），纳米纤维组与阴性对照组之间的差异也显著（p=0.001），证实了纳米纤维在增强增殖反应方面的有效性。这些发现表明，NCS/PLA纳米纤维可以通过增加成纤维细胞活动来加速增殖阶段，从而促进新组织的形成和更优化的伤口修复，优于无治疗和阳性对照组。作为比较，Azadi等人进行的研究表明，使用Fe3O4@SiO2/Schiff-base/Cu(II)纳米颗粒增强的海藻酸盐水凝胶薄膜作为糖尿病伤口敷料在体内可显著改善伤口的成纤维细胞阶段，并加速糖尿病伤口的愈合过程（Almukainzi等人，2022年）。预防细菌感染对于有效的伤口愈合至关重要，因为细菌定植会延迟组织再生并延长炎症。因此，伤口敷料材料的抗菌性能在决定其整体愈合效果方面起着决定性作用。图14(a)表明，将NCS掺入PLA纳米纤维中预计会赋予其抗菌功能，这将在下一节通过抗菌活性评估进行讨论。下载：下载高分辨率图像（408KB）下载：下载全尺寸图像图14。(a) 凝胶多糖的抗菌机制，(b) 小鼠伤口观察第8天，(c) 抗菌活性结果，(d) %NCS对抑制区的影响（毫米）。为了评估基于PLA/NCS的纳米纤维对两种测试细菌——金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性能，进行了抗菌活性分析。该测试旨在评估纳米纤维抑制细菌生长的能力，通过观察琼脂培养基上纳米纤维样本周围的抑制区来确定。样本周围形成的清晰区域表明了抗菌活性，随后对其进行分析以确定材料抑制每种细菌菌株的有效性。针对大肠杆菌的抑制区始终大于针对金黄色葡萄球菌的抑制区。这种现象可以通过革兰氏阴性菌（大肠杆菌）和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）之间的细胞壁结构差异来解释，大肠杆菌的肽聚糖层较薄，更容易被NCS等抗菌剂穿透。然而，NCS仍然可以抑制金黄色葡萄球菌，尽管效果不如对大肠杆菌的效果好。在与革兰氏阳性菌的相互作用中，带正电的凝胶多糖与肽聚糖层的负电荷基团结合，由于渗透压不平衡导致细胞壁变形和损伤，从而阻止营养物质的运输。通常，革兰氏阳性菌的抑制区比革兰氏阴性菌的小，因为它们的细胞壁更厚且更硬。根据图14(b)和(c)，添加5%和10%的NCS显著增强了纳米纤维对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。在0% NCS（纯PLA）的情况下，两种细菌的抑制区均为0毫米，表明没有抗菌效果。然而，当添加5%和10%的NCS时，抑制区直径显著增加，特别是针对大肠杆菌，表明NCS作为活性抗菌剂起着重要作用。抗菌活性随着NCS浓度的增加而增加，表明NCS有效地增强了PLA纳米纤维的抗菌性能。根据抑制区测量结果，含有5% NCS的样本对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别产生了1.9毫米和3.3毫米的抑制区，属于弱到中等的抑制效果。在10% NCS的情况下，金黄色葡萄球菌的抑制区增加到4.2毫米，大肠杆菌的抑制区增加到7.8毫米，表明抗菌活性中等。这些结果表明，抗菌性能随着NCS浓度的增加而增强，并且对革兰氏阴性菌（大肠杆菌）比对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）更有效。这证实了NCS作为纳米纤维伤口敷料中抗菌剂的潜力，特别是在预防开放性伤口的机会性微生物感染方面。多项研究，如Li Yuanhong等人关于凝胶多糖支架抗菌活性的研究，也显示了它们作为抗菌剂对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的有效性（Indrakumar等人，2024年）。4. 结论本研究成功优化了静电纺丝参数和纳米凝胶多糖（NCS）组成，制备出具有适合用于糖尿病伤口敷料的形态和机械性能的PLA/NCS纳米纤维。这项研究的主要创新在于将基于响应面方法（RSM）的过程参数优化与体内生物性能评估结合在一个综合框架内，以及利用纳米凝胶多糖在纳米纤维系统中同时增强抗菌和再生功能。优化结果显示，最佳条件——5.76% NCS浓度、21.64 kV电压和8.03 mL/h流速——产生了无珠子的纳米纤维，平均直径为397纳米，类似于细胞外基质（ECM）的架构。添加NCS减少了珠子的形成和纤维直径，达到最佳条件，但在较高浓度下，由于分散不完善导致不规则性。从机械角度来看，NCS的整合降低了刚度和抗拉强度，但显著提高了断裂时的伸长率超过70%，反映了支持伤口敷料应用的柔韧性。此外，亲水性显著增加，接触角从114.52°降至65.3°，有助于提高伤口渗出物的吸收能力。随着NCS浓度的增加，抗菌活性也增加，10%的组成显示对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有抑制作用。生物学上，体内结果表明，与Aquacel和阴性对照组相比，PLA/NCS纳米纤维显著加速了MRSA感染糖尿病伤口的愈合，表现为伤口面积减少更快、细菌定植减少以及组织病理学分析显示更先进的再上皮化和更有组织的胶原沉积。这些发现证实了过程参数、纳米纤维结构和生物性能之间的强相关性。因此，这项研究不仅为理解基于生物聚合物的生物材料设计提供了科学贡献，还展示了作为一种有效、可持续、多功能伤口敷料平台的实际意义，具有在慢性伤口中的潜在临床应用价值。作者贡献声明Citra Yulia Sari：撰写——审阅和编辑，撰写——初稿，监督，项目管理，方法学，调查，正式分析，数据管理。Azzah Dyah Pramata：监督，数据管理，概念化。Prihartini Widiyanti：调查。Siti Nurkhamidah：审阅和编辑。Wanda benboy和Amanda Augre Maharani Purimahua：调查，项目管理。Tri Widjaja：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，监督，资源管理，项目管理，数据管理，概念化。未引用的参考文献Salazar等人，2016年；Choi等人，2008年；Azadi等人，2026年；Rabea等人，2003年；Li等人，2020年。CRedI作者贡献声明Citra Yulia Sari：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，方法学，调查，正式分析，数据管理，概念化。Azzah Dyah Pramata：撰写——审阅与编辑，验证，监督，数据管理，概念化。Prihartini Widiyanti：撰写——审阅与编辑，数据管理。Siti Nurkhamidah：。Amanda Augre Maharani Purimahua：资源管理，项目管理。Wanda Benboy：资源管理，项目管理，方法学。Tri Widjaja：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，验证，监督，资金获取，数据管理，概念化。