一种基于三种不同水热合成的AuNP-CQD纳米胶体的简单且灵敏的比色生物传感器，这些纳米胶体经过适配体修饰，可用于检测血清样本中的双氯芬酸

《Surfaces and Interfaces》：A simple and sensitive colorimetric biosensor based on three different hydrothermally synthesized AuNP-CQD nanocolloids functionalized with aptamer for the biosensing of diclofenac in serum samples.

　　阿尤什·德伊（Aayush Dey）| 帕尔特·萨尔蒂·森·古普塔（Parth Sarthi Sen Gupta）| 阿比谢克·拉克赫拉（Abhishek Lakhera）| 拉吉夫·巴特拉（Rajeev Bhatla）| 迪内什·K·亚达夫（Dinesh K Yadav）| 德巴普里娅·哈兹拉（Debapriya Hazra）| 哈迪·潘迪亚（Hardi Pandya）| 桑杰·库马尔（Sanjay Kumar）
印度古吉拉特邦甘地纳加尔警察局附近第9区，国家法医科学大学博士研究学院（SDSR）

**摘要**
本研究重点介绍了三种不同类型的金纳米颗粒——碳量子点（AuNP-CQD）纳米胶体的合成，分别命名为AuNP-CQD（EA）、AuNP-CQD（G）和AuNP-CQD（S）。首先，在将AuNP与不同类型的CQD结合之前，通过水热法使用不同的前体合成CQD作为碳源。乙醇胺（Ethanolamine）、甘氨酸（Glycine）和丝氨酸（Serine）分别作为AuNP-CQD（EA）、AuNP-CQD（G）和AuNP-CQD（S）的碳源，而柠檬酸（Citric acid）用作还原剂。随后，这些AuNP-CQD被进一步功能化，以利用二氯芬酸特异性适配体（DCLApt）进行二氯芬酸钠的比色检测。采用紫外-可见光谱（UV-Visible spectroscopy）进行光学表征，同时利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和动态光散射（DLS）技术对比色系统进行进一步分析。高级分析技术如X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）用于详细研究制备的纳米胶体的结构和表面特性。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）等微观评估技术用于观察AuNP、CQD及其复合物的形态。AuNP通过静电相互作用与CQD结合。所制备的纳米胶体被用于二氯芬酸钠制剂中二氯芬酸的比色检测，其检测限（LOD）分别为53.08 nM、27.12 nM和18.85 nM。这些纳米胶体还用于人体血清样本中二氯芬酸的定量分析，回收率分别为94.27%–98.79%（AuNP-CQD（EA））、97.84%–105.25%（AuNP-CQD（G）和95.17%–99.23%（AuNP-CQD（S）），相对标准偏差（RSD）分别为6.87%–3.46%、2.1%–2.04%和5.86%–1.22%。AuNP-CQD的性能优于纯AuNP和其他纳米复合材料，在比色生物传感领域展现了优势，为未来的研究和多种应用奠定了基础。

**引言**
近年来，比色生物传感器因其制备简单、无需复杂仪器且能快速提供结果而受到广泛关注[[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]]。金纳米颗粒（AuNP）因其高消光系数、强表面等离子体共振（SPR）、尺寸依赖性和较大的比表面积等优势，被广泛用于抗生素（如氧四环素[[10], [11], [12]]、卡那霉素[13]、恩诺氟沙星[14]、环丙沙星[15]、氯霉素[16,17]及许多非甾体抗炎药（NSAIDs）的比色生物传感。近年来，由于AuNP及其复合材料的盐诱导聚集现象相对容易实现且成本较低，因此受到了更多关注[[19]]。适配体具有高亲和力、特异性和稳定性等特性，可与其他纳米材料结合使用[[20]]。适配体是实验室合成的短链寡核苷酸，由脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）组成[[21]]。根据其三维结构，适配体可对目标分子（生物分子或细胞）表现出特异性亲和力。与抗体相比，适配体在制备比色生物传感器方面具有更多优势，如制备步骤简单、成本低廉、灵敏度和特异性更高[[22]]。适配体主要通过体外过程“系统进化 ligands 通过指数富集”（SELEX）生成[[23]]，可通过化学合成获得高特异性的寡核苷酸。这些寡核苷酸还可根据研究需求进行修饰，以适应特定纳米颗粒的结合。AuNP具有表面等离子体共振（SPR）现象，即当受到特定波长光照射时，其表面电子会集体振荡。这一特性使研究人员能够通过改变AuNP的形状和大小来调节其吸收光谱[[24,25]]。AuNP已与DNA[26]、荧光肽[27]和生物聚合物[28]等生物分子结合。适配体与AuNP的结合为替代抗体和复杂免疫测定方法提供了基础，适用于生物传感器和靶向治疗等多种应用[[29]]。

**碳量子点（CQD）**
近年来，碳量子点（CQD）因其优异的水溶性、生物相容性和稳定性而在多种研究中得到广泛应用[[19]]。CQD还具有物理化学稳定性、可调导电性和光学特性，与其他无机元素构成的纳米颗粒相当[[30], [31], [32]]。CQD的合成方法相对简单，这也使其适用于各种应用，尤其是生物传感器[[30], [31], [32]]。CQD可作为多齿配体，用于开发与AuNP结合的生物传感器[[33], [34], [35], [36]]。将CQD与金属纳米颗粒（尤其是AuNP）结合，可互补各自的特性，从而提高生物传感平台的灵敏度、稳定性和性能[[38]]。本研究中使用的碳量子点前体包括乙醇胺（EA）、甘氨酸（G）和丝氨酸（S）。乙醇胺含有胺基和羟基，但缺乏羧基，导致碳核形成不良，因此适合作为表面钝化剂[[39]]。甘氨酸和丝氨酸的区别在于后者缺少含氧侧链[[40]]；丝氨酸同时含有胺基、羧基和羟基，便于进行广泛的脱水和交联反应，使其成为与其他纳米材料（本研究中为AuNP）结合的理想材料[[41]]。CQD的前体决定了其表面化学性质、电荷密度和空间构型，进而影响适配体与AuNP-CQD的结合方式及是否能够有效结合目标分子（二氯芬酸钠）。适配体与AuNP-CQD的结合机制主要有三种：AuNP-CQD表面的可用官能团、适配体在纳米颗粒表面的负载量（与官能团密度成正比[[42]]、以及适配体与AuNP-CQD表面的π-π堆叠作用[[43]]。适配体和AuNP-CQD表面的电荷也影响结合过程。由于适配体和AuNP-CQD均带负电荷，两者之间的排斥作用使适配体骨架向外延伸，从而能够结合目标分子[[44]]。空间位阻也是影响结合的因素[[45]]。

**二氯芬酸（Diclofenac）**
二氯芬酸（DCL）是一种非甾体抗炎药（NSAID），主要用于镇痛和抗炎。商业上以Voltaren品牌销售，形式为二氯芬酸钠[[47], [48], [49], [50]]。DCL通过抑制环氧化酶抑制前列腺素合成和信号传导，干扰胚胎发育等关键过程[[51]]。DCL具有持久毒性[[52]]，有研究表明其导致印度秃鹫物种减少可能与兽医用途有关[[52]]。DCL也对水生生物（如大型溞、鳟鱼、胚胎和幼虫）有毒[[52]]。作为最常用的药物之一，DCL在水环境中也有检测需求[[53]]。因此，需要开发更新颖、快速、简便的方法来检测DCL，以保障人类健康和环境安全。

**实验方法**
AuNP在特定波长光照射下表现出表面等离子体共振（SPR），通过改变其形状和大小调节吸收光谱[[24,25]]。将AuNP与CQD结合后，颜色从红色变为粉色，表明两者发生了共轭[[46]]。选择乙醇胺（EA）、甘氨酸（G）和丝氨酸（S）作为碳量子点前体，柠檬酸（CA）作为还原剂。制备的CQD随后与AuNP结合。加入电解质NaCl后，AuNP-CQD发生聚集，导致颜色从粉色变为蓝黑色[[46]]。将DCLApt通过范德华力固定在AuNP-CQD上可防止NaCl的屏蔽/聚集效应[[46]]。Na-DCL的加入使AuNP-CQD颜色变为蓝黑色[[46]]。在其他NSAIDs（如萘普生和阿司匹林）存在下，纳米胶体仍保持分散状态，表明所选适配体序列仅对Na-DCL具有特异性[[46]]。

**结果与讨论**
本研究制备了三种类型的AuNP-CQD纳米胶体（AuNP-CQD（EA）、AuNP-CQD（G）和AuNP-CQD（S）），并进行了紫外-可见光谱、动态光散射（DLS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）等表征。这些纳米胶体用于开发二氯芬酸钠的比色传感系统，计算了检测限[[46]]。

**试剂**
三水合氯化金（III）（HAuCl4·3H2O）购自Sigma-Aldrich；氯金酸还原剂三水合柠檬酸钠（C6H5Na3O7·2H2O）购自Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.（印度孟买）；氯化钠（NaCl）购自Central Drug House (P) Ltd.（印度新德里）；碳量子点前体乙醇胺（C2H7NO, 99%）购自Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.（印度孟买）。

**分子对接分析**
利用PyRx虚拟筛选平台结合AutoDock Vina（版本1.2.6）对DCLApt与二氯芬酸钠、萘普生和阿司匹林的相互作用进行了分子对接分析[[20]]。

**结论与展望**
采用水热法合成CQD（EA、G和S），并与AuNP结合制备AuNP-CQD纳米胶体[[38]]。这些纳米胶体通过多种技术进行了表征，用于二氯芬酸钠的比色生物传感。检测限为53.08 nM[[46]]。

**作者贡献声明**
阿尤什·德伊（Aayush Dey）：撰写初稿、可视化、方法设计、数据分析、概念构建；
帕尔特·萨尔蒂·森·古普塔（Parth Sarthi Sen Gupta）：软件开发、数据分析；
阿比谢克·拉克赫拉（Abhishek Lakhera）：软件开发、数据分析；
拉吉夫·巴特拉（Rajeev Bhatla）：数据分析；
迪内什·K·亚达夫（Dinesh K Yadav）：数据分析；
德巴普里娅·哈兹拉（Debapriya Hazra）：数据分析。哈迪·潘迪亚（Hardi Pandya）：负责形式化分析。桑杰·库马尔（Sanjay Kumar）：负责验证、资源管理、方法论研究、调查工作以及形式化分析的深化与概念化。

利益冲突声明
作者声明：他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。