用于食品接触材料和婴儿产品中N-亚硝胺及可N-亚硝基化的物质样品制备及GC–TEA/GC–MS分析的方法开发

《Talanta》：Method development for sample preparation and GC–TEA/GC–MS analysis of N-nitrosamines and N-nitrosatable substances in food contact materials and infant products

　　

徐敦明|赵超|华玛蒂·Z.|袁文轩|杨天|林瑞|庄莉莉|赵亮娟|郑文杰|卢晓楠

福建厦门集美大学海洋食品与生物工程学院，361021，中国

摘要

N-亚硝胺是橡胶和聚合物材料中日益受到关注的致癌污染物。然而，现有的分析方法往往缺乏对全球法规要求的多种食品模拟物的系统验证，且依赖单一检测平台可能会因基质干扰而影响可靠性。本研究开发并验证了用于检测从食品接触材料（FCMs）和婴儿产品中迁移出的N-亚硝胺及N-亚硝胺可生成物质的稳健分析方法。采用了两种互补的方法：气相色谱-热能分析（GC–TEA）和气相色谱-质谱（GC–MS）。对样品制备方案进行了全面评估和优化，包括使用七种食品模拟物进行迁移测试和液-液萃取。GC–TEA和GC–MS的检测限均较低（GC–TEA为0.026–0.188 μg kg^-1；GC–MS为0.009–0.430 μg kg^{-1N-亚硝胺暴露提供了可靠的工具。}

引言

N-亚硝胺是一类具有R₂N–N=O结构的化合物，通常根据其物理性质（如挥发性）、毒性（如致癌性）和来源（如烟草特异性化合物）进行分类（Liu等人，2022年）。许多常见的N-亚硝胺已被国际癌症研究机构认定为可能对人类致癌（2B组）或很可能对人类致癌（2A组）（国际癌症研究机构，2025年；Kühne等人，2018年）。N-亚硝胺可生成物质主要是仲胺，在酸性条件下（例如胃中）可以与亚硝酸盐反应生成N-亚硝胺，从而增加饮食暴露的风险。N-亚硝胺和N-亚硝胺可生成物质，尤其是挥发性化合物，在环境、工业应用、个人护理产品和其他消费品中广泛存在（Liu等人，2022年；Kühne等人，2018年；Manchuri等人，2024年）。食品接触材料（FCMs）是潜在饮食暴露的重要来源。许多FCMs由橡胶或相关材料制成，如热塑性弹性体（TPE/TPR）。在生产过程中会加入硫化促进剂，这些促进剂是仲胺的主要来源，仲胺随后可与氮氧化物反应（Incavo等人，2006年）。这些FCMs不仅包括工业食品处理部件（如奶瓶内衬、管道、手套），还包括消费品（如食品容器、厨房用具），特别是为婴儿设计的产品，如奶嘴和安抚奶嘴。由于对这些危害的担忧日益增加，因此开发了能够检测FCMs向食品或婴儿产品中的唾液中迁移的N-亚硝胺和N-亚硝胺可生成物质的方法，其检测限可达到十亿分之一水平。

根据欧盟（委员会指令93/11/EEC）、中国（GB4806.11-2023）、加拿大（SOR/2016-180）和美国（CPG Sec 500.450）的规定，婴儿产品中N-亚硝胺的总迁移量通常限制在10 μg kg^-1以内（欧洲委员会，1993年；中国国家卫生健康委员会，2023年；加拿大政府司法部，2016年；美国食品药品监督管理局，2005年）。欧盟和中国都制定了更详细的阈值，涵盖了通用FCMs、N-亚硝胺可生成物质以及更广泛的食品模拟物。迄今为止，所有法规主要关注挥发性N-亚硝胺，涉及的化合物不到20种。

在过去几十年中，已经开发了许多N-亚硝胺的检测方法和相应的样品制备技术。早期，气相色谱-热能分析（GC–TEA）是主要的检测方法（Liu等人，2022年；Hwang等人，2023年）。GC–TEA检测器对N-亚硝胺和亚硝酸盐具有高选择性和灵敏度。这种特异性源于测量处于激发态的NO₂*返回基态时发出的辐射。NO₂*是通过硝基自由基（·NO）的氧化产生的，并在N-亚硝胺热解过程中由臭氧生成。因此，辐射强度与·NO浓度成正比（Parr等人，2019年）。自本世纪以来，基于质谱（MS）的方法越来越受欢迎。这些方法结合了GC和液相色谱（LC）的分离能力和MS的精确识别能力。更重要的是，GC–MS和LC–MS具有更大的灵活性、更低的检测限以及更低的运营成本，逐渐取代了GC–TEA在科学研究和常规应用中的地位（Liu等人，2022年；Kühne等人，2018年；Kim等人，2021年；Mutsuga等人，2013年；Koster等人，2014年）。尽管如此，GC–TEA仍然是一项有价值的技术，特别是作为重新分析检测出N-亚硝胺或N-亚硝胺可生成物质的样品的确认方法。GC–TEA对N-亚硝基具有极高的选择性，使其能够抵抗复杂的基质干扰，实现稳健的定量（例如在食品和烟草中）。相比之下，GC-MS提供了必要的精确分子碎片模式，用于结构确认，防止假阳性结果。两者共同构成了可靠的定量和确认工作流程。

与分析食品、环境样品或药品成分中的残留物不同，量化从FCMs释放到食品和唾液中的N-亚硝胺和N-亚硝胺可生成物质的实际水平具有重要的实际意义。典型的样品制备包括对FCM样品的预处理、使用食品模拟物进行迁移测试，以及提取和浓缩迁移溶液，以便后续用GC–TEA或GC–MS进行分析。不同监管机构采用的食品模拟物和其他程序步骤各不相同。在可用的提取策略中，液-液萃取是最广泛用于处理多种食品模拟物的方法，尽管学术界和监管实验室也报告了固相萃取（SPE）、固相微萃取和超临界流体萃取（Hwang等人，2023年；Mutsuga等人，2013年；Park等人，2018年；美国农业部，2009年；Andrade等人，2005年）。

在这项研究中，我们同时进行了GC–TEA和GC–MS方法对N-亚硝胺和N-亚硝胺可生成物质的分析。全面评估和优化了样品制备方法，包括食品模拟物的选择、迁移测试和不同的提取方案。然后建立了GC–TEA和GC–MS方法来检测十五种N-亚硝胺和三种主要的N-亚硝胺可生成物质，并使用三种样品类型和七种食品模拟物系统地评估了检测限、准确性和精确度。进一步进行了实验室间验证，以评估检测限、线性、回收率和相对标准偏差，证明了所开发方法的可重复性和转移性。最后，对91种市场样品进行了确认性后紫外检测。总体而言，本研究为监管机构提供了可靠且实用的分析工具，用于常规监测FCMs和婴儿产品中的N-亚硝胺和N-亚硝胺可生成物质。

部分摘录

试剂和标准溶液

二氯甲烷和无水乙醇（100%）为色谱级，所有其他试剂（如HCl、NaOH、醋酸、NaNO₂）至少为ACS级。所有十五种N-亚硝胺标准品（表1）和N-亚硝胺可生成物质（二甲胺、N-乙胺和N-甲胺）的纯度均大于98.0%，由主要供应商（如Sigma-Aldrich，美国）通过当地供应商提供。储备溶液（100 mg L^-1）是通过将每种化合物25毫克溶解在250毫升乙醇中制备的

方法验证

三个实验室对这些方法进行了线性、检测限（LOD，定义为峰高处信噪比的三个倍浓度）、定量限（LOQ，定义为峰高处信噪比的十个倍浓度）、准确度（以回收率%表示）和精确度（以相对标准偏差RSD%表示）的验证。

GC柱的选择

对于GC–MS，研究了各种GC柱的分离能力，包括HP-5ms [含（5%-phenyl）-甲基聚硅氧烷相] 和许多极性柱（如DB-WAX UI、DB-FFAP、Wonda CAP WAX、DB-35）。选择DB-WAX UI（图1）是因为其在N-亚硝胺分析中的高极性，其重复性和峰尾效应低于其他测试柱。

对于GC–TEA，一些极性柱（如Wonda CAP WAX）会加速

方法验证

检测限。用于GC–TEA的N-亚硝胺标准混合物是从1 μg mL^-1储备液新鲜制备至0.025、0.050、0.100、0.200和0.500 μg mL^-1；用于GC–MS的从5 μg mL^-1储备液制备至0.050、0.100、0.200、0.300、0.400和0.500 μg mL^-1。在0.025 – 0.500 μg mL^-1和0.050 – 0.500 μg mL^-1的线性范围内，GC–TEA和GC–MS的确定系数（R²）分别大于0.998和0.995（表S12和S13）。FCMs和奶瓶的LOD和LOQ

结论

本研究全面评估了样品制备程序，并开发了GC–TEA和GC–MS方法，用于分析从FCMs和婴儿产品中迁移出的十五种N-亚硝胺和三种主要的N-亚硝胺可生成物质。这些方法在三种样品类型和多种食品模拟物中实现了令人满意的检测限、回收率和RSD，并进一步提供了实用的监管阈值建议。三个实验室进行了实验室间验证

CRediT作者贡献声明

杨天：撰写 – 原稿、方法学、研究、正式分析。林瑞：验证、资源、方法学。庄莉莉：验证、资源、方法学。赵亮娟：可视化、验证、软件。郑文杰：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。卢晓楠：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。徐敦明：验证，

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

中国国家重点研发计划（2023YFF1104900）、麦吉尔大学和加拿大研究主席计划（资助编号CRC-2024-00011）的支持。