与牦牛相比，患有精子发生停滞的牛-牦杂交种具有不同的睾丸体细胞特征

《Theriogenology》：Distinct testicular somatic cell profiles in cattle-yak with spermatogenic arrest compared to yak

　　

张鹏|沈振华|吴世新|董文静|郭书军|李秋云|吴新瑞|陈洪亮|TserangDonko Mipam|熊显荣|李健|蔡欣

四川省教育厅与西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用重点实验室，中国四川省成都市

摘要

精原干细胞微环境是由多种睾丸体细胞构成的复杂系统，这些细胞通过多种机制共同维持正常的精子发生过程，包括旁分泌因子的释放、直接的细胞间接触以及细胞外基质提供的结构支持。本研究重点分离并鉴定了牛牦杂交种和牦牛睾丸中的莱迪希细胞（Leydig cells）、塞托利细胞（Sertoli cells）和管周肌样细胞（peritubular myoid cells）。主要目的是通过比较这些细胞在睾丸内的原位特性与体外观察到的特性，揭示它们之间的潜在差异。结果表明，牛牦杂交种与牦牛相比，三种类型的睾丸体细胞的增殖活性存在显著差异：牛牦杂交种的莱迪希细胞中与睾酮合成相关的基因表达上调，睾酮分泌活性增强；塞托利细胞中与血睾屏障相关的基因表达下调，抑制素B的分泌活性也增强；管周肌样细胞中与未分化精原细胞增殖和精子发生相关的蛋白质因子表达发生改变。这些变化可能表明睾丸体细胞的增殖和功能活动异常，从而导致牛牦杂交种的精子发生受阻。本研究为解决牛牦杂交种雄性不育问题提供了新的见解。

引言

牛牦杂交种是牛（♂）和牦牛（♀）的种间杂交后代，由于精子发生受阻而表现出雄性不育[1]。这一生殖障碍严重限制了其在牦牛杂交育种计划中的优良遗传特性利用。精子发生是一个复杂的生物过程，依赖于生殖细胞与体细胞之间的精确协调。在这一过程中，包括塞托利细胞、莱迪希细胞和管周肌样细胞在内的体细胞在维持生精小管稳态方面起着关键作用[2]。这些细胞通过提供结构支持、分泌关键信号分子以及调节细胞间通信网络来促进生殖细胞的分化并启动减数分裂[3]，[4]。

莱迪希细胞（LCs）是一类位于生精小管间质组织中的内分泌细胞。在黄体生成素的刺激下，LCs合成并分泌雄激素，主要是睾酮[5]。睾酮在精子发生过程中起着关键作用。O’Donnell等人的研究表明[6]，它在大鼠精子发生周期的第VII至VIII阶段对圆形精母细胞的转化至关重要，并有助于减数分裂的进行[7]。相反，睾酮水平显著下降会诱导处于精子发生第VII阶段的粗线期精母细胞和圆形精母细胞发生凋亡[8]。

塞托利细胞（SCs）是睾丸生精小管上皮中的关键体细胞类型。这些细胞与生殖细胞紧密相关，为精子发生提供结构、营养和免疫支持[9]。SCs的一个关键功能是形成血睾屏障（BTB），该屏障通过相邻SCs之间的紧密连接建立起来。这一屏障将生精小管的腔内部分与体循环隔开，从而维持稳定的微环境，保护发育中的生殖细胞免受免疫攻击，并防止有害物质的进入[10]。此外，SCs分泌促进生殖细胞通过减数分裂的关键信号分子[11]。研究表明，促卵泡激素（FSH）和/或睾酮的撤除可以在生殖细胞发育的特定阶段诱导细胞凋亡[12]，[13]。

管周肌样细胞（PMCs）是一层位于生精小管基底膜上的收缩性体细胞。研究表明，PMCs在精子发生和维持睾丸稳态中起着关键作用[14]。对雄性小鼠进行雄激素受体（AR）特异性敲除实验后发现，其睾丸重量在青春期前下降，生殖细胞数量减少[15]。这些动物还出现了无精症和不育现象，表明PMCs对正常精子发生至关重要。

因此，精子发生微环境中体细胞的正常功能是正常精子发生的先决条件。本研究旨在比较分析牛牦杂交种和牦牛中的体细胞类型。我们成功分离并鉴定了这两种物种的三种主要体细胞类型——LCs、SCs和PMCs，并研究了它们在睾丸组织和体外培养中的功能差异。此外，我们证实这三种细胞类型都能表达FGF2，这是一种参与精子发生调控的关键蛋白质因子。该研究还探讨了外源性FGF2补充对牛牦杂交种未分化精原细胞（UDSPG）在体外培养条件下的影响。总之，本研究为牛牦杂交种雄性不育的机制提供了新的见解，并为杂交育种改进、生殖隔离机制以及雄性不育的治疗策略等相关领域提供了理论支持。

节片段

实验动物

实验材料来自四川省洪原县12个月大的健康梅娃牦牛和牛牦杂交种。组织用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗后，切成6～10立方毫米的小块，然后进行玻璃化处理并储存在-196°C的液氮中。

玻璃化与解冻

首先沿纵隔线解剖睾丸，使用无菌手术剪刀将其切成约6–10立方毫米的小块，然后放入DMEM/F-12培养基中。

牛牦杂交种和牦牛中微环境细胞的分布特征

采用苏木精和伊红（HE）染色法来观察和分析牛牦杂交种和牦牛的精子发生过程。如图1A所示，牛牦杂交种的生精上皮呈单层结构，具有空腔，且包含少量的精原细胞和初级精母细胞。相比之下，牦牛的生精小管中含有精原细胞、精母细胞和精细胞。

讨论

睾丸体细胞，包括莱迪希细胞、塞托利细胞和管周肌样细胞，被认为是生精微环境（SSCs）的关键组成部分[2]。对比分析牛牦杂交种和牦牛中的这些体细胞，有助于深入了解导致杂交种雄性不育的细胞机制。本研究通过揭示这些体细胞的表型差异，为进一步探索它们的潜在功能奠定了基础——尽管这些功能仍有待进一步研究

结论

本研究发现，牛牦杂交种的莱迪希细胞中的雄激素分泌活性增强，塞托利细胞中的抑制素B分泌增加。此外，塞托利细胞中与紧密连接相关的蛋白质合成能力下降，而管周肌样细胞的细胞因子分泌也发生了变化。这些变化共同导致了牛牦杂交种睾丸内激素和细胞因子的浓度分布改变。由此产生的微环境可能对精子发生细胞的支持作用减弱，可能是导致其精子发生受阻的原因之一

作者贡献声明

蔡欣：撰写——审稿与编辑、资源管理、项目协调、数据管理、概念构思。熊显荣：验证。李健：监督、资金筹集。张鹏：撰写——初稿撰写、验证、方法设计、实验实施、资金筹集、数据管理、概念构思。李秋云：数据管理。吴新瑞：数据分析。陈洪亮：软件操作。TserangDonko Mipam：软件操作。沈振华：验证、方法设计、数据分析。吴世新：验证

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

资助

本研究得到了四川省自然科学基金（资助编号：2026NSFSC0169）和中央高校基本科研业务费、西南民族大学（资助编号：ZYN2025261）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。