添加褪黑素的体外成熟培养基对脱氧雪腐镰刀菌毒素暴露的猪卵母细胞发育和基因表达的影响

《Theriogenology》：Effects of in vitro maturation medium supplemented with melatonin on the development and gene expression of deoxynivalenol-exposed porcine oocytes

　　

沈鹏志|陈彦平|罗丽莎·巴兰泰恩|蒋忠丰|李彦华|李嘉伟|余琪

台湾屏东科技大学动物科学系，屏东县内埔912

摘要

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是牲畜饲料中最常见的霉菌毒素之一，已知会损害生殖生理和卵母细胞质量。褪黑素（MEL）是一种强效抗氧化剂，据报道可以在体外成熟（IVM）过程中减轻DON引起的细胞毒性。本研究旨在评估DON和MEL补充剂在IVM期间对卵母细胞发育能力和转录组谱的影响。结果显示，暴露于DON（1 μM）显著降低了卵母细胞的成熟率（47.6%），而同时给予DON（1 μM）和MEL（1 μM）则显著提高了成熟率（74.4%）。为了探究潜在的分子变化，进行了下一代测序（NGS），随后通过定量PCR（qPCR）验证了14个候选基因。在 cumulus 细胞中，与单独使用DON相比，MEL补充显著上调了ATP5F1E、TCEAL2和RNase P的表达。在卵母细胞中，MEL恢复了线粒体和应激相关基因的表达，包括NDUBF6、ATP8和SEC61A2，同时降低了与线粒体清除、铁死亡和细胞骨架应激相关的COX15、ACSL4、CPEB2和MAP7基因的表达。这些表达结果在NGS和qPCR分析中一致。总体而言，结果表明，MEL在IVM期间的补充通过增强线粒体功能、减少氧化应激和正常化卵母细胞和cumulus细胞的基因表达来缓解DON引起的细胞毒性。此外，这些发现支持了MEL作为霉菌毒素污染生殖系统保护剂的潜力。

引言

谷物极易受到真菌感染，因为其成分以及储存和运输过程中的处理方式为真菌生长创造了理想的环境。这些感染不仅会降低营养价值和口感，更重要的是，还会导致霉菌毒素的积累和污染，从而严重损害动物健康和生产力[1]，[2]。饲料成分中的水分含量超过16%会促进真菌繁殖，从而增加霉菌毒素污染的风险[3]。在这些毒素中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），也称为呕吐毒素，由Fusarium属产生，是台湾饲料样本中检测到的最常见霉菌毒素[4]。接触DON污染的饲料会导致饲料摄入量减少，可能影响各种牲畜物种的生长率和繁殖性能[5]，[6]，[7]，[8]。

除了对饲料摄入量和整体生产力的系统影响外，DON还在细胞水平上产生不利影响，尤其是对生殖生理的影响。体外研究表明，在体外成熟（IVM）过程中暴露于高浓度DON的猪卵母细胞表现出cumulus细胞扩张减少和cumulus细胞死亡显著增加。这些累积效应导致卵母细胞成熟率降低和胚胎发育受损[9]，[10]。值得注意的是，在IVM期间给予褪黑素可以上调与卵母细胞成熟和早期胚胎发生相关的基因表达，从而促进囊胚形成[11]。

最近的研究探讨了褪黑素（MEL）作为潜在解毒剂的潜力。研究还表明，褪黑素可以增加cumulus-卵母细胞复合体（COC）的扩张，上调与胚胎发生相关的基因，改善胚胎能力，并抑制猪卵母细胞中的促凋亡基因表达[12]。这些发现支持褪黑素在对抗霉菌毒素引起的生殖毒性方面的保护作用。值得注意的是，有报道称，在IVM治疗期间补充褪黑素可以缓解黄曲霉毒素B1（AFB1）[13]、赭曲霉毒素A（OTA）[14]和DON[15]对猪和小鼠卵母细胞的毒性作用。在这些研究中，与褪黑素共同给药可以恢复卵母细胞的成熟和胚胎发育能力，达到霉菌毒素处理时的水平。褪黑素的这种保护作用可能是通过促进抗氧化相关基因的表达、减少细胞内ROS和降低卵母细胞中的凋亡率来实现的[16]，[17]。

尽管有越来越多的证据表明褪黑素具有保护作用，但其背后的基因表达机制仍不够明确。为此，本研究调查了DON暴露对IVM条件下猪卵母细胞发育的影响，并评估了不同浓度褪黑素的保护效果。利用下一代测序（NGS），我们分析了同时用1 μM DON和1 μM MEL处理的cumulus细胞和卵母细胞的mRNA表达模式。通过定量PCR（qPCR）进一步验证NGS识别出的差异表达基因（DEGs），以量化相对表达变化。这种方法旨在阐明褪黑素如何缓解DON对猪卵母细胞和cumulus细胞毒性的分子机制。

部分摘录

化学物质和试剂

除非另有说明，本研究中使用的所有化学物质和试剂均购自Sigma–Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）。

实验设计

为了研究褪黑素（MEL）在脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）存在下对猪卵母细胞发育的影响，实验分为四个主要实验过程和分析步骤。

首先，将cumulus-卵母细胞复合体（COCs）分为五组：对照组（无DON/MEL）、DON（1 μM）以及DON与MEL联合处理的组

IVM期间MEL补充对猪卵母细胞成熟和发育的影响

表2总结了在不同浓度MEL添加条件下，DON暴露对猪卵母细胞成熟率和孤雌生殖发育能力的影响。结果显示，仅用1 μM DON处理的组（DON组：47.6%）的卵母细胞成熟率显著低于对照组（80.7%）以及同时用1 μM DON和1 μM MEL处理的组（DON + 1 MEL组：74.4%）。

讨论

牲畜饲料中的霉菌毒素对动物健康、生长和发育构成重大风险。生物活性化合物如玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）经常在饲料样本中被检测到，其浓度往往足以引发不良生理反应[13]，[21]，[22]。这些霉菌毒素与免疫毒性效应相关，并能干扰各种牲畜物种的生殖功能。

CRediT作者贡献声明

余琪：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资源提供、方法论设计、概念构思。罗丽莎·巴兰泰恩：撰写——初稿撰写、验证。蒋忠丰：验证、软件使用、数据分析。李彦华：软件使用、数据分析、数据管理。李嘉伟：撰写——审稿与编辑、资源提供、方法论设计。沈鹏志：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资源提供、方法论设计、资金筹集、概念构思。陈彦平：撰写——

利益冲突

作者声明他们没有可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

利益冲突声明

本工作得到了台湾国家科学委员会（Grant No. MOST 111-2313-B-020-005）的支持。作者声明没有其他竞争性利益。

致谢

本工作得到了台湾国家科学委员会的资助（项目编号：MOST 111-2313-B-020-005）。