Eldecalcitol 通过调控氧化还原反应，促进人牙髓干细胞的骨/牙发生分化及矿化基质的形成

《Tissue and Cell》：Eldecalcitol Enhances Osteo/Odontogenic Differentiation and Mineralized Matrix Formation via Redox Modulation in Human Dental Pulp Stem Cells

　　**Francisco Javier Rodríguez-Lozano | Ana Belén Pérez-Oliva | María José Menchón-Pérez | David García-Bernal | Pablo Rodríguez-González | Sergio López-García**

**西班牙穆尔西亚大学IMIB-Pascual Parrilla医学院Morales Meseguer医院皮肤科、口腔科、放射科和物理医学系，30008穆尔西亚**

**摘要**

**目的**
本研究探讨了具有免疫调节和成骨调节特性的维生素D3合成类似物eldecalcitol（ELD）对体外人类牙髓干细胞（hDPSCs）生物学行为的影响。具体而言，本研究旨在评估ELD对细胞活力、氧化应激反应、迁移能力、成骨/牙本质形成分化以及矿化潜力的影响，特别关注氧化还原调节与hDPSCs再生特性之间的相互作用。

**方法**
hDPSCs被不同浓度的ELD处理，并在多个时间点进行评估。细胞活力通过MTT测定法进行评估，而细胞凋亡和细胞内活性氧（ROS）的产生则分别通过流式细胞术结合Annexin V/7-AAD和CM-H2DCFDA染色进行分析。细胞迁移通过伤口愈合实验进行评估，细胞骨架结构通过F-actin phalloidin染色进行观察。成骨/牙本质形成分化通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析碱性磷酸酶（ALP）、I型胶原α1链（COL1A1）、骨连接蛋白（ON）和骨唾液蛋白（BSP）的表达水平来确定。矿化基质的形成通过Alizarin Red S染色进行评估。统计分析采用ANOVA方法，并进行相应的post hoc检验（p < 0.05）。

**结果**
ELD对hDPSCs的行为表现出剂量依赖性效应。较低浓度（10^-5、10^-6和10^-7 M）能够维持细胞活力，保持氧化还原平衡，增强迁移能力，并促进细胞骨架的有序排列。相比之下，较高浓度（10^-4 M）会增加ROS的产生和细胞凋亡，最终影响细胞功能。在转录水平上，ELD显著上调了关键成骨标志物，早期诱导ALP和COL1A1的表达，随后ON和BSP的表达也增加（p < 0.05）。这些分子变化与富钙结节的显著形成相关，证实了在生物学上有利的浓度下矿化能力的增强。总体而言，ELD对hDPSCs显示出剂量依赖性的调节作用，可能代表了再生性根管治疗的一种有前景的策略。

**结论**
ELD通过剂量依赖性的氧化还原平衡和细胞功能调节，促进了hDPSCs的成骨/牙本质形成分化及矿化基质的形成。这些发现强调了存在一个明确的治疗浓度窗口，并支持ELD作为再生性根管治疗中生物调节剂的应用潜力。

---

## 1. 引言
龋齿、创伤和炎症等牙科疾病常导致矿化组织的丧失，可能会影响牙本质-牙髓复合体的活力（Asgary和Shamszadeh，2026年）。传统的修复方法主要依赖惰性材料来替换受损结构；然而，当代根管治疗越来越强调基于生物学的策略，旨在保护组织活力并促进再生（Iaculli等人，2022年）。这种范式的转变反映了人们越来越认识到，成功的临床结果取决于对炎症、组织修复、氧化还原平衡和矿化组织形成相关细胞反应的调节（Aga等人，2025年）。牙本质-牙髓复合体是一个动态的生物系统，其中的再生机制紧密相连。骨免疫学的见解表明，骨骼系统和免疫系统之间存在广泛的分子重叠，这些重叠通过共享的细胞因子、受体、转录因子和信号通路来调节组织稳态和重塑（Marrelli等人，2018年；Spagnuolo等人，2023年）。在牙科组织中，免疫细胞——尤其是巨噬细胞——在协调牙髓对损伤的反应中起着关键作用（Gong等人，2026年）。在牙髓炎期间，病原体相关的和损伤相关的分子信号会激活驻留和渗入的免疫细胞，诱导促炎介质的释放，从而调节血管通透性、细胞招募和修复性牙本质形成。尽管受控的生物反应对于防御和愈合至关重要，但未解决的氧化应激会加剧组织损伤，最终导致牙髓活力的丧失。因此，在不利条件下能够有效保护细胞功能并促进再生的治疗策略在现代根管治疗中非常受欢迎（Lv等人，2025年）。维生素D作为一种关键的调节剂，在连接矿物质代谢和细胞稳态方面起着重要作用。除了其在钙和磷酸盐稳态中的经典内分泌功能外，维生素D信号还调节细胞增殖、分化和氧化还原状态（Argano等人，2025年）。在口腔环境中，维生素D缺乏与牙本质矿化缺陷、牙齿萌出延迟以及人类牙髓干细胞（hDPSCs）分化障碍有关，这突显了其在牙本质形成和牙髓生物学中的重要性（Woo等人，2015年；Xavier等人，2021年）。虽然维生素D已知会影响细胞信号传导，但其保护牙髓细胞免受氧化损伤并增强其再生潜力的潜力仍需进一步研究（Nygaard等人，2022年）。为了克服传统维生素D疗法的局限性（包括高钙血症副作用），已经开发了几种维生素D类似物（VDAs）。其中，eldecalcitol（ELD）是一种用于治疗骨质疏松症的下一代类似物，与骨化三醇相比，它具有更好的生物利用度和更长的半衰期，从而增强了骨密度和更理想的钙-磷酸盐平衡（Matsumoto等人，2011年）。实验证据表明，ELD可能对牙周组织具有保护作用，并支持矿化组织的代谢（Gao等人，2023年）。然而，其在促进组织再生反应和维持牙本质-牙髓复合体氧化还原平衡方面的潜在作用仍大部分尚未探索。了解ELD如何影响hDPSCs的行为，特别是其在维持氧化稳态的同时促进迁移和分化的能力，是一个重要的未满足的研究需求。此外，阐明这种维生素D类似物是否可以在保持细胞完整性的同时增强成骨/牙本质形成活性，可能为关键的牙髓治疗和再生性根管程序提供一种新的生物调节方法。因此，本研究旨在评估eldecalcitol对人类牙髓相关细胞反应的生物学影响，重点关注细胞相容性、氧化应激、细胞迁移和成骨/牙本质形成分化潜力。零假设是eldecalcitol不会诱导人类牙髓干细胞中氧化还原状态或再生反应的剂量依赖性调节。

## 2. 材料与方法**

### 2.1 hDPSCs的培养和特征鉴定
在机构伦理委员会批准研究项目（ID：4930/2024）后，从16至22岁捐赠者的拔除的阻生第三磨牙牙髓中采集hDPSCs（n = 10）。细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Merck/Sigma-Aldrich，德国达姆施塔特）中培养，条件标准。

### 2.2 eldecalcitol处理
本研究中使用的eldecalcitol（ELD；商品编号HY-A0020；MedChemExpress，美国新泽西州蒙茅斯 Junction）是维生素D3的合成活性类似物。该化合物溶解在二甲基亚砜（DMSO）中制备浓缩储备液，分装后储存在-80°C下避光保存，以保持化学稳定性和避免反复冻融循环。每次实验前，将储备液重新解冻并稀释至最终工作浓度10^-4 M、10^-5 M、10^-6 M和10^-7 M。这些浓度是基于先前用于评估维生素D代谢物和类似物在体外模型中的细胞活力、分化和矿化潜力的广泛生物活性范围选择的。培养基中的DMSO最终浓度不超过0.1%（v/v）。对照组培养基不含ELD，仅含等量的DMSO。细胞在标准培养条件（37°C，5% CO?）下培养，处理培养基每2-3天更换一次，以确保整个实验期间的持续暴露和化合物稳定性。仅在完全培养基中培养的细胞作为对照组。

### 2.3 细胞活力测定
使用甲基噻唑基二苯四唑溴化物（MTT）测定法评估细胞活力。人类牙髓干细胞（hDPSCs）接种在96孔板中（每孔2.5 × 10^4细胞），在37°C和5% CO?条件下培养24小时。然后，细胞用含有eldecalcitol（ELD）的培养基处理，最终浓度分别为10^-4 M、10^-5 M、10^-6 M和10^-7 M，而对照组仅含DMSO（0.1%），并分别培养3天、7天和14天，每2-3天更换培养基。在每个时间点，加入MTT溶液（Sigma-Aldrich，德国达姆施塔特），培养4小时后，将结晶形式的染料溶解在DMSO/甘氨酸缓冲液中，并使用多模式微孔读取器（Infinite 200 PRO；Tecan Group Ltd.，瑞士M?nnedorf）在570 nm处测量吸光度。结果以相对于对照细胞的百分比活力表示，实验重复三次。

### 2.4 细胞迁移
使用伤口愈合实验评估细胞迁移。人类牙髓干细胞（hDPSCs）接种在12孔或48孔板中，每孔密度为2 × 10^4或3 × 10^4细胞，直至细胞汇合。用无菌移液管尖端制造线性划痕，之后加入含eldecalcitol（10^-4–10^-7 M）或对照培养基。细胞在37°C、5% CO?的湿润环境中培养，监测0小时、24小时、48小时和72小时的伤口闭合情况。使用EVOS FL Auto倒置显微镜（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）在4倍放大倍率下拍摄三个标准化区域的图像，并使用ImageJ软件（NIH，美国马里兰州贝塞斯达）量化剩余的伤口面积。实验重复三次或四次。

### 2.5 F-actin细胞骨架染色
通过F-actin染色评估eldecalcitol（ELD）处理后hDPSCs的细胞骨架变化。实验培养期结束后，细胞用PBS冲洗，用4%戊二醛在室温下固定15分钟，然后用抗vinculin一抗（Abcam，英国剑桥）染色，随后用Alexa Fluor? 488标记的二级抗体（Invitrogen，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）染色。接着，在室温下用0.165 μM Alexa Fluor? 594-phalloidin（Invitrogen）在PBS中标记细胞骨架actin丝状蛋白20分钟。然后用DAPI（300 nM，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）对细胞核进行复染5分钟。样品安装在共聚焦显微镜（Leica，德国韦茨拉尔）上观察细胞骨架结构和细胞形态。

### 2.6 细胞凋亡分析（Annexin V/7-AAD染色）
使用Annexin-V和7-氨基放线菌素D（7-AAD）双染色进行流式细胞术分析，以评估eldecalcitol（ELD）对hDPSC活力和凋亡的影响。人类牙髓干细胞用逐渐增加浓度的ELD（10^-4-10^-7 M）处理72小时，与未经处理的对照组细胞进行比较。之后，收集细胞，用PBS洗涤，并根据制造商指示用Annexin-V和7-AAD染色。通过流式细胞术分析存活细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡/坏死细胞的百分比。

### 2.7 细胞内活性氧（ROS）检测
使用细胞渗透性荧光探针CM-H2DCFDA（Molecular Probes，美国俄勒冈州尤金）检测细胞内活性氧（ROS）的产生。人类牙髓干细胞（hDPSCs）在完全培养基中培养（对照组）或用最终浓度10^-4、10^-5、10^-6和10^-7 M的eldecalcitol（ELD）处理，条件为37°C、5% CO?，培养72小时。处理后，用PBS洗涤两次以去除残留培养基，然后在37°C、无血清培养基中加入5 μM CM-H2DCFDA培养30分钟。之后，再次用PBS洗涤细胞，通过温和的胰蛋白酶处理收集细胞，并立即使用BD FACS Canto II?流式细胞仪（BD Biosciences）进行分析。使用FlowJo软件（FlowJo LLC，美国俄勒冈州阿什兰）量化ROS阳性细胞的百分比和荧光强度，并将结果标准化以评估ELD处理引起的氧化应激水平的变化。所有实验条件重复三次，并在三个独立实验中验证。

### 2.8 基因表达谱分析
通过实时定量PCR（RT-qPCR）评估成骨和牙本质形成标志物的表达。人类牙髓干细胞（hDPSCs）在两种不同条件下培养：完全基础培养基和成骨分化培养基（OsteoDiff，Miltenyi Biotec，德国）。根据实验设计，用选定的ELD浓度处理细胞以进行分析，并培养3天、7天和14天。在每个时间点，按照制造商指示使用Trizol Plus试剂（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）提取总RNA。通过分光光度法评估RNA浓度和纯度，并使用逆转录试剂盒合成互补DNA（cDNA）。定量PCR扩增使用针对碱性磷酸酶（ALP）、I型胶原α1链（COL1A1）、骨连接素（ON）和骨唾液酸蛋白（BSP）的特异性引物进行。相对基因表达水平使用2^-ΔΔCt方法计算，并以GAPDH作为内源性对照进行标准化。在基础培养基中培养的未处理细胞作为阴性对照，而在成骨培养基中培养的细胞作为阳性对照。所有实验均重复三次，在三个独立实验中进行。2.9. 钙化结节形成的评估使用Alizarin Red S（ARS）染色来评估CSBS在hDPSCs中的矿化诱导潜力。该实验在与基因表达分析相同的条件下进行。包括两个对照：阴性对照（未处理细胞）和阳性对照（Osteodiff，一种商业成骨诱导培养基）。经过21天的培养后，细胞经过两次PBS洗涤，用4% PFA固定，然后用ARS（Sigma）染色。最后冲洗后，在自然光条件下拍摄图像。所有条件均重复三次以确保实验可靠性。2.10. 统计方法所有数据使用GraphPad Prism软件（版本8.1.0；GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA）进行分析。结果以三个独立实验的平均值呈现。首先使用分位数-分位数（Q-Q）图评估数据分布的正态性，并在统计测试前评估方差齐性。根据实验设计和数据分布，使用单因素或双因素方差分析（ANOVA）进行比较，随后进行Tukey的事后多重比较测试，或使用Mann-Whitney U测试处理非参数数据。p值< 0.05被认为具有统计学意义。3. 结果3.1. 细胞表型和代谢活性流式细胞术分析首先确认hDPSCs表现出间充质干细胞表型，表现出低于5%的造血标记物（CD14, CD20, CD34, 和 CD45）表达和超过95%的间充质标记物（CD73, CD90, 和 CD105）阳性表达（图1A）。随后，通过MTT实验评估细胞对不同浓度eldecalcitol（ELD）处理的代谢活性，结果显示ELD处理对细胞代谢活性有浓度和时间依赖性响应。具体来说，浓度在10^-7到10^-5 M之间的范围在整个实验期间保持了或略微增强了与对照组相当的细胞代谢活性。相比之下，只有最高浓度（10^-4 M）在后期时间点导致代谢活性降低（*p < 0.05）。总体而言，暴露于低至10^-5 M ELD浓度的hDPSCs显示出与对照组相似的生存能力，证实了这一范围内的良好细胞相容性，并支持明显的剂量依赖性生物响应（图1B）。3.2. 细胞迁移通过伤口愈合实验评估hDPSCs的迁移能力，在暴露于不同浓度的eldecalcitol（ELD）后进行。代表性图像显示所有实验组中伤口面积随时间的逐渐减小；然而，ELD处理对细胞迁移产生了浓度依赖性效应（图2A）。较低浓度（10^-7和10^-6 M）比对照细胞促进更快的伤口闭合，尤其是在24和48小时时，表明迁移行为增强（*p < 0.05）。相反，较高浓度（10^-5和10^-4 M）显示伤口闭合延迟和迁移率降低，这与存活率实验中观察到的代谢活性降低一致（图2B）。总体而言，这些发现表明ELD以剂量依赖的方式调节hDPSC的迁移，较低浓度有利于细胞运动。3.3. 细胞骨架组织（F-actin染色）为了进一步了解eldecalcitol（ELD）对hDPSCs细胞骨架组织和细胞形态的影响，进行了F-actin染色。总体而言，荧光显微镜显示对照组细胞以及低浓度ELD处理（10^-7和10^-6 M）的细胞具有明确的actin纤维网络和保持的细胞形态，其特征在于细胞骨架排列有序和明显的细胞扩散（图3）。相比之下，高浓度（10^-5和10^-4 M）处理导致细胞骨架结构改变，包括细胞扩散减少和actin纤维分布不那么有序。这些发现表明ELD以浓度依赖的方式影响细胞骨架动态，支持在低浓度下观察到的增强迁移行为以及在高剂量下检测到的细胞活性降低。3.4. 细胞凋亡分析通过Annexin-V/7-AAD流式细胞术评估eldecalcitol（ELD）对hDPSC活力和凋亡的影响。代表性 dot 图和定量分析显示，低和中等浓度ELD（10^-7-10^-5 M）处理并未显著改变与对照组相比的活细胞百分比，从而证实了良好的细胞相容性（图4）。值得注意的是，只有最高浓度（10^-4 M）显著降低了细胞活力，降至80%以下，并表明激活了与凋亡相关的机制。这些发现表明ELD对细胞存活有浓度依赖的影响，支持代谢活性结果，并表明高剂量可能通过凋亡相关机制损害细胞活力。3.5. 细胞内活性氧（ROS）的产生随后评估了eldecalcitol（ELD）对hDPSCs中ROS水平的影响。流式细胞术分析显示ROS产生的浓度依赖性调节（图5A）。低和中等浓度ELD处理（10^-7-10^-5 M）的细胞显示出与对照组相当或略低的ROS水平，表明维持了平衡的氧化还原状态。相比之下，高浓度ELD（10^-4 M）显著增加了ROS阳性细胞的比例（***p < 0.001），反映了氧化应激的增加（图5B）。这些发现与在高剂量下观察到的凋亡增加和代谢活性降低一致，支持氧化应激对ELD在hDPSCs中的浓度依赖性生物效应。3.6. 基因表达谱接下来，我们通过RT-qPCR分析了hDPSCs中成骨标记物的时间依赖性表达。我们的结果表明，虽然使用成骨分化培养基（Osteodiff）成功启动了hDPSCs向成骨/牙源性分化的方向，但添加eldecalcitol（ELD）显著增强了这些标记物的表达（图6）。具体来说，ELD的添加显著增加了碱性磷酸酶（ALP）的表达，在Osteodiff + 10^-5 M ELD组中第14天达到峰值，显示出与未经处理的对照组相比早期的成骨/牙源性分化有协同增强作用（***p < 0.001）。同样，I型胶原α1链（COL1A1）的表达也随着时间的推移逐渐上调，特别是在第14天，10^-5和10^-6 M ELD与Osteodiff结合使用时，显示出研究中观察到的最高表达水平，表明分化期间细胞外基质的合成得到改善（*p < 0.05）。成骨培养基的影响也在骨连接素（ON）表达中得到体现，在ELD存在下，其在中间和晚期时间点的表达进一步显著上调，加速了基质的成熟和矿化过程，超出了单独使用Osteodiff的能力。同样，骨唾液酸蛋白（BSP），一种晚期成骨/牙源性标记物，在第14天也表现出显著增加。值得注意的是，10^-5 M的ELD添加使BSP表达增加了约40%，表明ELD添加作为一种强效辅助剂，显著增强了成骨培养基的诱导效果，促进了与hDPSC分化相关的关键成骨/牙源性标记物的更强烈表达。3.7. 矿化结节形成的评估为了探索ELD的潜在治疗价值，进行了Alizarin Red S染色，以评估ELD在21天培养后对hDPSCs中矿化基质形成的影响（图7）。与未处理的对照组相比，ELD处理的细胞显示出更多的富含钙的结节沉积，表明矿化能力增强（图7A）。这种效应在较低浓度下更为明显，观察到矿化面积显著增加（*p < 0.05）。相比之下，较高浓度的ELD显示出染色强度降低，这与之前实验中观察到的存活率和分化潜力下降一致（图7B）。总体而言，添加ELD在支持成骨分化的条件下显著增强了细胞外基质的矿化，证实了之前通过RT-qPCR检测到的成骨标记物的上调。4. 讨论基于维生素D类似物的公认的免疫调节和成骨特性，本研究的假设是eldecalcitol（ELD）可以调节细胞内的氧化还原平衡，从而影响人类牙髓干细胞（hDPSCs）的再生行为，特别是它们的成骨/牙源性分化和矿化潜力。目前的发现支持这一假设，表明ELD对细胞活力、氧化应激和分化相关反应具有明显的剂量依赖性效应。较低浓度促进了有利的生物学特征，表现为保持细胞活力、增强迁移、上调成骨标记物和增加矿化基质形成，而较高浓度则诱导氧化应激并降低细胞性能。我们的活力数据表明了一种明显的剂量-反应模式，其中较低的ELD浓度保持了代谢活性，而较高剂量损害了细胞性能。这种非线性行为与之前描述维生素D代谢物浓度依赖性反应的证据一致，在这些研究中，低或中等剂量促进调节性细胞反应，而较高剂量可能减少增殖或引起细胞应激（Sun等人，2016年）。例如，已经在广泛的浓度范围（10^-7–10^-4 M）内测试了calcitriol和tacalcitol，以评估细胞因子的调节和细胞反应，显示出剂量依赖的生物学效应，并支持在体外表征维生素D类似物活性时探索广泛浓度窗口的相关性（Rostkowska-Nadolska等人，2010年）。与代谢活性结果一致，Annexin-V/7-AAD分析支持超 optimal ELD浓度增加了凋亡/坏死细胞的比例，表明较高剂量下的存活率降低反映了真正的细胞损伤，而不是短暂的代谢抑制。虽然直接证据表明eldcalcitol（ELD）在牙髓细胞中的活性仍然有限，但维生素D信号传导已被广泛认为是与多种细胞类型的细胞存活途径和应激反应相关的，这支持了当氧化平衡被打破时细胞凋亡作为下游结果的合理性（Kou等人，2023年）。ROS的结果强调了浓度依赖性存活/凋亡与下游再生表型之间的机制联系。众所周知，ROS在间充质谱系中具有双重作用：可控的ROS水平支持信号传导和分化，而过量的ROS则会促进功能障碍和凋亡（Atashi等人，2015年）。在这个背景下，我们观察到较低的ELD浓度能够维持一个平衡的氧化还原状态，这与“治疗性氧化还原窗口”概念相符——适度的氧化还原调节支持再生信号传导，而过度的氧化应激则会损害干细胞功能。伤口愈合试验显示，较低的ELD浓度可以改善hDPSC（人牙髓干细胞）的迁移能力，而较高浓度则会阻碍伤口闭合。这一观察结果尤为重要，因为细胞迁移是牙髓愈合和修复性牙本质形成过程中的一个关键早期事件，它使前体细胞能够定植在受损区域并启动组织修复（Machla等人，2023年）。先前的研究表明，细胞迁移与牙科组织的再生结果密切相关，因为增强hDPSC迁移能力的因素通常与改善的分化和矿化能力相关（Kim等人，2020年；Mora等人，2025年；Seo等人，2019年）。例如，用再生活性分子刺激DPSC已被证明可以促进伤口闭合和细胞骨架重组，从而支持迁移行为在牙科组织再生中的功能重要性（Malthiery等人，2020年；Osorio等人，2024年）。类似的促再生效果也在活性维生素D [1,25(OH)?D?] 在牙干细胞相关模型中得到描述。尽管直接评估ELD在牙髓细胞中的研究仍然有限，但维生素D信号传导与从根尖乳头（SCAPs）和其他间充质群体中的干细胞黏附能力、细胞扩散和成骨分化能力的提高有关，这表明维生素D受体（VDR）的激活可以积极调控分化前的早期细胞行为（Mojarad等人，2016年）。此外，来自干细胞生物学的证据表明，VDR信号传导通过调节涉及细胞激活和迁移的途径来促进迁移和伤口愈合反应，进一步增强了本研究中观察到的效应的生物学合理性（Oda等人，2018年）。然而，必须承认，VDR信号传导在此处观察到的ELD介导的迁移反应中的直接作用仍然是一个假设，需要通过功能测定（如受体敲低或特定信号抑制）进行进一步研究。

我们的细胞骨架数据进一步支持了这些功能发现，因为较低的ELD浓度保持了有序的F-actin结构和支持细胞扩散，而较高浓度则破坏了细胞骨架结构。鉴于actin重塑对迁移和机械转导至关重要，这些观察结果与牙髓干细胞的研究一致，这些研究表明actin细胞骨架重组直接影响细胞硬度、迁移能力和伤口闭合潜力（Malthiery等人，2020年）。此外，hDPSC的迁移已被证明依赖于与 focal adhesion 和细胞骨架动态相关的途径，这支持了actin 组织的变化可以直接影响干细胞迁移和修复行为的概念（Li等人，2017年）。而且，在不利的细胞条件下，迁移能力受损与牙髓愈合潜力降低相关，进一步突显了细胞骨架完整性的生物学重要性（Yang等人，2025年）。在转录水平上，ELD显著增强了成骨/成牙分化能力，这一点通过早期/中期阶段ALP和COL1A1的显著过表达以及后期成熟和矿化相关标志物ON和BSP的显著上调得到证明。这种时间顺序在生物学上与矿化组织形成的自然进程一致，即早期激活基质合成基因先于细胞外基质成熟和随后的矿化沉积。最近的内科牙科研究同样描述了hDPSC成熟过程中阶段依赖性的分化标志物激活，早期ALP活性增加，随后矿化基质形成增强（Qiu等人，2023年；Sauro等人，2018年）。观察到的顺序模式表明，ELD促进了一个协调的分化过程，而不是孤立的基因激活。这些发现与证据一致，即活性维生素D代谢物通过维生素D受体介导的途径增强人牙髓细胞的成牙和成骨分化，包括调节谱系分化和矿化的ERK相关信号机制（Uzunoglu-Ozyurek等人，2022年）。虽然我们研究中的表型和转录结果与这些已建立的途径一致，但ERK激活和VDR介导的信号传导在对ELD响应中的具体作用仍属假设。因此，在通过深入的机制分析（如受体敲低或特定信号抑制）得到证实之前，应谨慎解释这些机制。重要的是，本研究中观察到的转录变化伴随着矿化的功能证据，如ELD处理组中富含钙的结节形成增加。Alizarin Red S染色检测到的矿化基质沉积增强支持了基因表达谱的生物学相关性，并表明ELD诱导的转录激活转化为有效的细胞外基质矿化。类似的关系也在最近的牙干细胞模型中报道，这些模型表明调节分化相关基因程序可以改善功能再生结果（Bucchi等人，2023年；Del Giudice等人，2025年）。总体而言，这些发现表明ELD驱动了一个从转录到功能的协调分化级联反应，在有利的生物学条件下最终增强了hDPSC的矿化能力。

从转化医学的角度来看，目前的发现表明，ELD可能是一种有前景的生物调节剂，通过在适当的浓度范围内应用，它可以增强成骨/成牙分化和矿化基质的形成，从而为再生性牙科策略提供支持。本研究中观察到的剂量依赖性效应突显了存在一个潜在的治疗窗口，在这个窗口内，氧化还原平衡、细胞功能和分化过程得以最佳保留，而较高浓度可能会诱导氧化应激并损害再生结果。然而，也应承认一些限制。首先，这项研究是在体外条件下进行的，无法完全再现牙髓微环境的复杂性，包括免疫相互作用、血管化和动态炎症反应。其次，尽管与其他维生素D类似物的比较提供了机制背景，但ELD在牙髓组织中的特异性信号传导途径仍不完整，VDR和ERK信号传导的参与虽然合理，但目前仍处于假设阶段。此外，不同研究之间的细胞来源、培养条件和用药方案的差异可能会限制对当前发现的直接外推。因此，需要进一步的深入功能和机制分析，如途径抑制或基因沉默，以提供涉及的分子机制的确切证据。此类研究结合三维模型和体内研究对于验证ELD的治疗潜力和安全性以及进一步增强这些发现在再生性牙科领域的相关性至关重要。尽管存在这些限制，目前的结果提供了证据，表明ELD的氧化还原调节可以影响细胞应激与再生活动之间的平衡，支持其在未来再生性牙科方法中作为辅助分子的潜在作用。

**结论**

在这项体外研究的局限性范围内，eldcalcitol（ELD）对人类牙髓干细胞表现出明显的剂量依赖性效应，调节了细胞存活、氧化应激、迁移和成骨/成牙分化。较低的ELD浓度保持了氧化还原平衡，增强了细胞骨架组织和细胞迁移能力，促进了成骨/成牙标记物的过表达，并增加了矿化基质的形成，而较高浓度则损害了细胞性能。这些发现表明，ELD可能通过氧化还原依赖性的分化途径调节来增强再生潜力，支持存在一个治疗浓度窗口。需要进一步的体内和转化医学研究来确认ELD作为再生性牙科疗法中生物调节剂的实际应用潜力。

**作者贡献声明**

Sergio López-García：写作 – 审稿与编辑、撰写初稿、可视化、资金获取、数据管理、概念化。
Pablo Rodríguez-González：可视化、验证、监督、研究、正式分析。
David García-Bernal：验证、监督、软件使用、资源配置。
María José Menchón-Pérez：监督、方法学、研究。
Ana Belén Pérez-Oliva：写作 – 审稿与编辑、方法学、研究。
Francisco Javier Rodríguez-Lozano：写作 – 审稿与编辑、撰写初稿、概念化。