CD44 expression in renal tubules during maladaptive repair is a potential marker for the transition from acute kidney injury to chronic kidney disease in rats 肾小管恶性适应修复过程中CD44的表达是急性肾损伤向慢性肾病转变的潜在标志物

《Toxicology》：CD44 expression in renal tubules during maladaptive repair is a potential marker for the transition from acute kidney injury to chronic kidney disease in rats

　　

肾小管上皮细胞（TECs）是药物性肾损伤的主要靶点，也是急性肾损伤（AKI）的成因。尽管TEC再生有助于恢复，但恶性适应修复会促进纤维化和慢性肾病（CKD）。据报道，CD44主要定位于大鼠CKD模型纤维化病变中扩张/萎缩的TECs，提示其在修复失败的TECs（FR-TECs）中富集，但其在AKI向CKD转变过程中的动态变化尚不清楚。研究人员通过第28天的肾脏缺血再灌注（I/R；30或60分钟）或顺铂肾毒性（2或6 mg/kg，腹腔注射）诱导跨越适应性修复和AKI向CKD转变的大鼠模型，对此进行了检测。在AKI向CKD转变的环境（I/R 60分钟和顺铂6 mg/kg）中，CD44在纤维化发生前即已在扩张/萎缩的TECs中诱导表达。对小鼠I/R单细胞RNA测序数据的重新分析证实了Cd44在恶性适应TEC簇中的富集。在顺铂模型中，血清CD44早期升高并在常规标志物恢复正常后仍保持升高，这与肾脏CD44的诱导表达相平行。激光显微切割（LMD）扩张/萎缩TECs的微阵列谱揭示了基质相关的特征。免疫组织化学显示水通道蛋白1（AQP1）减少，波形蛋白诱导，且CD44+小管仍被层粘连蛋白阳性的基底膜包裹。通路分析预测CD44是包括Fn1在内的纤维化相关基因的假定上游调节因子；扩张/萎缩TECs中Fn1 mRNA的增加伴随管周纤维连接蛋白的积累，提示了小管对基质沉积的可能贡献。总之，这些发现支持组织CD44作为AKI向CKD转变过程中恶性适应小管修复的候选标志物，并提示血清CD44可作为顺铂肾毒性中的候选循环指标。

该研究聚焦于急性肾损伤（AKI）向慢性肾病（CKD）转变过程中的恶性适应修复机制，探讨了CD44作为潜在生物标志物的价值。研究由Kohei Matsushita、Hirotoshi Akane等来自日本国立卫生科学研究所病理部的团队完成，成果发表于《Toxicology》期刊。

研究背景与现状问题

肾脏作为外源性物质代谢和排泄的关键器官，易受药物毒性影响，药物性肾损伤（DIKI）是导致AKI的常见原因。虽然AKI本身通常被认为可逆，但流行病学和实验证据表明，AKI可能进展为不可逆的CKD，即AKI-CKD转变。肾小管上皮细胞（TECs）的修复是这一过程的核心：适应性修复可恢复肾功能，而恶性适应修复则导致修复失败的TECs（FR-TECs）产生，进而引发纤维化。既往研究虽发现了多种DIKI的早期检测标志物，但对结局评估尤其是AKI-CKD转变的关注不足。CD44作为一种跨膜糖蛋白，已知在多种大鼠CKD模型的纤维化病变TECs中富集，提示其可能与FR-TECs相关，但在AKI-CKD转变早期的动态变化及其作为标志物的潜力尚未明确。因此，阐明CD44在恶性适应修复中的表达规律，对于评估药物肾毒性的长期风险具有重要意义。

研究方法概述

研究人员构建了两种大鼠AKI-CKD转变模型：单侧肾脏缺血再灌注（I/R，60分钟，代表转变组；30分钟为代表适应性修复组）和单次顺铂（CDDP，6 mg/kg，代表转变组；2 mg/kg为代表适应性修复组）腹腔注射。通过苏木精-伊红（HE）、天狼猩红染色评估病理和纤维化；免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）检测CD44、γ-H2AX、p21、衰老相关β-半乳糖苷酶、水通道蛋白1（AQP1）、波形蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白的表达及定位；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清CD44水平；激光显微切割（LMD）结合微阵列分析扩张/萎缩TECs的基因表达谱；蛋白质印迹（Western blotting）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证CD44及其标准异构体的表达；重新分析已发表的小鼠I/R单细胞RNA测序数据以验证Cd44的细胞特异性。

研究结果

1. AKI-CKD转变过程中纤维化的发生与TECs中CD44的表达

天狼猩红染色显示，在I/R 60分钟和CDDP 6 mg/kg模型中，间质胶原纤维面积分别在14天和10天显著增加，标志着纤维化形成。适应性修复组（I/R 30分钟、CDDP 2 mg/kg）表现为短暂再生小管后完全恢复；而转变组则在坏死后出现扩张TECs，随后在纤维化区域检测到萎缩TECs。CD44几乎不在正常和再生TECs中表达，但在两种转变模型纤维化发生前的扩张/萎缩TECs细胞膜上清晰表达。DNA损伤标志物γ-H2AX和p21以及衰老相关β-半乳糖苷酶在扩张TECs中呈异质性表达，提示恶性适应修复状态。

2. 通过重新分析小鼠I/R模型单细胞RNA测序数据确认CD44在FR-TECs中的特异性

对两个独立小鼠I/R模型单细胞RNA测序数据集的重新分析显示，提取的TECs可分为健康（Healthy segment 1/S1、S2、S3等）和损伤/恶性适应（Injured、Maladaptive等）亚群。Cd44表达细胞主要富集于恶性适应簇中，而在健康或单纯损伤簇中极少，从单细胞层面证实了CD44与恶性适应TECs的关联。

3. 血清CD44水平与常规肾损伤标志物的比较

在CDDP诱导的转变模型中，血液尿素氮（BUN）和血清肌酐（sCre）在5天达峰后下降，而血清CD44水平在整个AKI-CKD转变过程中持续升高，且与肾脏CD44⁺小管数量呈正相关，在第28天也与天狼猩红阳性面积相关。这表明血清CD44可能比传统功能性指标更能反映持续的恶性适应状态。

4. 激光显微切割扩张/萎缩TECs的微阵列分析

对I/R 60分钟模型3天和28天、CDDP 6 mg/kg模型5天和28天的扩张/萎缩TECs进行LMD取样和微阵列分析，与正常TECs相比鉴定出大量差异表达基因（DEGs）。基因本体（GO）分析显示，上调基因集富集于免疫反应和细胞外基质（ECM）相关条目，下调基因集富集于转运体和代谢相关条目，提示扩张/萎缩TECs具有促炎和基质重塑的特征，且Cd44 mRNA显著高表达。

5. 上皮分化标志物和间质标志物的表达

分化标志物AQP1在正常近端TECs中高表达，而在两种转变模型的扩张/萎缩TECs中极低或缺失，IF显示其与CD44表达基本互斥。间质标志物波形蛋白在正常TECs中不表达，但在扩张/萎缩TECs中清晰表达并与CD44共定位。层粘连蛋白染色显示CD44⁺TECs仍被基底膜包裹，未见明显向间质迁移的证据，提示其可能处于部分上皮间质转化（pEMT）样状态。

6. 扩张/萎缩TECs周围的局部ECM沉积

通路分析预测CD44是包括Fn1（编码纤维连接蛋白）在内的纤维化相关基因的假定上游调节因子。原位杂交（ISH）和IHC显示，扩张/萎缩TECs中Fn1 mRNA表达增加，且周围间质纤维连接蛋白沉积增多，微阵列数据也证实了这一点。IF显示纤维连接蛋白围绕CD44⁺TECs沉积。

7. AKI-CKD转变过程中表达的CD44剪接变体分析

Western blotting和qPCR分析表明，两种转变模型中肾脏主要表达的是分子量约82 kDa的CD44标准异构体（standard isoform），其mRNA水平与总CD44相当，提示该异构体可能与AKI-CKD转变相关。

8. 损伤小管中CD44与血管细胞黏附分子1（VCAM-1）的关系

在独立小鼠I/R实验中，VCAM-1在扩张/萎缩小管中清晰表达，且与CD44大量共定位（96.6% CD44⁺小管共表达VCAM-1）。单细胞数据分析也显示Vcam1在恶性适应簇CD44⁺TECs中上调。但在大鼠转变模型（I/R 60分钟、CDDP 6 mg/kg）的扩张/萎缩小管中未检测到VCAM-1免疫活性，LMD微阵列也未显示Vcam1明显上调，提示物种和模型依赖性差异，支持CD44作为大鼠模型中VCAM-1的实用替代或互补标志物。

讨论与结论总结

该研究通过大鼠I/R和CDDP模型证实，CD44在AKI-CKD转变早期、纤维化发生前的扩张/萎缩TECs中诱导表达，且主要表达CD44标准异构体。单细胞数据再分析和小管特异性分子特征均支持CD44是恶性适应/修复失败TECs（FR-TECs）的候选标志物。在顺铂模型中，血清CD44持续升高并与肾组织CD44诱导及纤维化程度相关，提示其作为循环指标的潜力。扩张/萎缩TECs表现出免疫反应激活、ECM相关基因上调、转运代谢基因下调，以及AQP1丢失和波形蛋白获得等pEMT样特征，且CD44⁺小管周围可见Fn1 mRNA增加和纤维连接蛋白沉积，提示小管对基质重塑的贡献。虽然CD44与VCAM-1在小鼠中具有高度共定位，但在大鼠模型中VCAM-1表达受限，凸显了CD44在大鼠毒理学研究中的独特价值。综上，组织CD44可作为大鼠AKI-CKD转变过程中恶性适应小管修复的标志物，血清CD44可作为顺铂肾毒性中监测该过程的候选循环指标，为药物肾毒性长期风险评估提供了新的工具。